O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Resumo

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Resumo

A marca da imunidade humoral é gerar ASC funcionais, que sintetizam e segregam Abs específica para um antigénio (Ag), tal como um agente patogénico, e são usados ​​para a defesa do hospedeiro. Para a determinação quantitativa do estado funcional da resposta imune humoral de um indivíduo, tanto Abs circulantes no soro e ASC são geralmente medidos como leituras funcionais. Nos seres humanos, o sangue periférico é a amostra mais conveniente e facilmente acessível e que pode ser utilizado para a determinação da resposta imune humoral induzida por células hospedeiras B. subconjuntos distintos de células B, incluindo ASC, podem ser isolados directamente a partir de sangue periférico por meio de selecção com micropérolas Ab-conjugados específicos de linhagem ou através de separação de células com citometria de fluxo. Além disso, as células B naive e de memória purificados podem ser activadas e diferenciadas em cultura em ASC. As actividades funcionais de ASC para contribuir para a secreção de Ab pode ser quantificada por ELISpot, que é um ensaio de enzima que convergeensaio -Conectado imunoabsorvência (ELISA) e tecnologias de transferência Western para permitir a enumeração de ASC individuais no nível de uma única célula. Na prática, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia da vacina por causa da facilidade de manuseamento de um grande número de amostras de sangue. Os métodos de isolamento de células B humanas a partir de sangue periférico, a diferenciação de células B em ASC in vitro, e o emprego de ELISpot para a quantificação de um total de IgM e IgG-ASC serão descritos aqui.

Introdução

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs ¹ de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico ^2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), células B de memória (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), e PBS / PCS (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 ⁺ IgM ⁺ B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina ^5. A maioria das células CD27 ⁺ B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 ⁺ oi PBS / PCs ^6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade ^4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies ^8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs ^9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 - 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas ^{6, 11-15.} Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om ^6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs ^6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral.

Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra ^de líquido ^16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos ^17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs.

Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico ^17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de PVDF em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais ^19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.

Protocolo

sangue periférico humano deve ser obtido a partir de dadores saudáveis ​​sob consentimento informado, bem como a utilização de amostras de sangue devem estar em conformidade com as orientações aprovadas estabelecidas por conselhos de revisão institucionais individuais. Neste estudo, o protocolo de usar sangue humano em uma demonstração dos resultados de citometria de fluxo (Figura 1) e ensaios ELISPOT (Figura 3) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Interna do National Taiwan University Hospital (número de protocolo 201307019RINB).

1. Isolamento e purificação de células B de sangue periférico humano

1. Desenhar ~ 10 mL de sangue a partir da veia cubital mediana (no anterior fossa cubital ao cotovelo) para um tubo de 15 ml, contendo K ₂ EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverter imediatamente o tubo várias vezes para evitar coágulos formação.
2. Adicionar 35 mL de autoclavada (121 ° C, 15 min) de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise (150 mM de _NH4Cl, 10 mM de _KHCO3, e EDTA 1 mM; pH 7,4) ao tubo que contém a amostra de sangue fresco (≥ 3: 1 v / v) e incuba-se à temperatura ambiente (TA) durante não mais do que 5 minutos.
   NOTA: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão de lise de RBC.
3. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Certifique-se de que o sedimento é de cor branca.
4. Ressuspender o sedimento com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na ₂ HPO _4, e 1,47 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) e centrifuga-se tal como no passo 1.3.
5. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 10 ml de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / mL de anfotericina B, e 2 mM de L-glutamina), e, em seguida, a chapa células em uma placa de cultura de 10 cm (10 ml de sangue por prato). Colocar a cápsula num incubador a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 30 min.
6. Agite suavemente o prato de cultura algumas vezes e colocar omeio de cultura (células de suspensão) em 15 mL tubos cónicos de plástico. Descartar as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura.
7. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento com 1 ml de meio RPMI 1640. Contar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
   NOTA: A viabilidade de leucócitos isolados é normalmente superior a 90% por exclusão com azul de tripano.
9. Centrifugar como no passo 1.7 e ressuspender as células em ~ 200 uL de tampão de PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 5-10 x 10 ⁶ células / ml.
10. Adicionar 5 mL de cocktail de anticorpo anti-humano biotinilado específico para as células do sangue (para a selecção negativa das células B) por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 30 min ^21.
    NOTA: O cocktail Ab anti-humana deve incluir, pelo menos Abs específico para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16.
11. Adicionar um excesso de volume de 10 vezesde PBS estéril para as células, centrifugar a 600 xg durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
12. Adicionar quantidades iguais de microesferas de estreptavidina conjugada (5 mL por 10 ⁶ células) para o pellet e misture bem.
13. Incubar em gelo durante 30 min num tubo cónico de 15 mL, em plástico.
14. Adicionar 2 ml de tampão PBS para dentro do tubo.
15. Colocar o tubo em um suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min. As micropérolas Brown vai anexar gradualmente para a parede do tubo ao lado do íman ^22.
16. Com o tubo restante no suporte magnético, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15-mL ^22.
17. Repita os passos de 1,14-1,16, e combinar os dois sobrenadantes que contêm as células B intactas. Descartar as microesferas.
18. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
19. Ressuspender o sedimento em meio RPMI 1640 para experiências a jusante.
    NOTA: Normalmente, 1 - 5 x 10 ⁵ células B witha pureza superior a 95% a partir de 10 ml de sangue periférico pode ser isolado ^23.

2. purificação e separação de Memória e Naïve B As células a partir de células B isoladas

1. Use células purificadas a partir do passo 1 e determinar o número de células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células em 100 ul de tampão PBS frio depois da centrifugação a 600 xg e TA durante 5 min.
3. Adicionar 1 - 2 ug de mAb CD27 biotinilado por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 30 min.
4. Adicionar 10 ml de tampão PBS ao tubo e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 ul de tampão PBS.
6. Adicionar a mesma quantidade de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - / 10 ⁶ células 2 ug) às células num tubo cónico de plástico de 15 ml.
7. Com cuidado, misturar bem e incubar em gelo durante 30 min.
8. Adicionar 2 - 3 ml de tampão PBS ao tubo.
9. Coloque otubo num suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir que as microesferas castanhos para anexar ao lado mais próximo do íman.
10. Com o tubo no suporte magnético, transferir cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de ensaio estéril. Esta fracção contém a CD27 enriquecido ^- células B virgens.
11. Adicionam-se 5 ml para o tubo contendo as micro-esferas e suavemente ressuspender as microesferas (isto é, a fracção enriquecida de células CD27 ⁺ de memória B) ^24-25.
12. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender as peletes com meio RPMI 1640 para os experimentos a jusante.
    NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% de células B podem ser purificadas como células de memória CD27 ⁺ a partir das PBMC de um dador saudável ^{7, 25-26.}

3. células de classificação para a coleta de células Naïve B, células B de memória, e PBS / PCs

1. Usando as células purificadas a partir do passo 1, determinar o número de células utilizando um hemocytometer ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células em tampão de PBS frio a uma concentração de 10 ⁷ por ml num tubo de polistireno de 5 ml.
3. Adicionar 1 - 2 ug de IgG humana por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 10 min para o bloco de Fc.
4. Adicionar 1 ug de cada anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 10 ⁶ células; misturar bem e incubar em gelo durante 30 min ^{4, 27.}
5. Na última 5 min na etapa 3.4, adicionar 5 mL do 7-D aminoactinomycin comercial (7-AAD).
6. Adicionar 2 ml de PBS ao tubo, vórtice, e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
7. Ressuspender as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e EDTA a 2 mM) a uma concentração de 1 - 5 x 10 ⁷ células por ml num tubo de 15 mL.
8. Filtrar as células através de um filtro de células de malha de nylon (40 um de tamanho de poro) para eliminar aglomerados de células.
9. Separaram-se as células com uma citometria de fluxo tipoer equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelha (640 nm).
   NOTA: O laser azul por si só é suficiente para 3 cores citometria de fluxo ^27-28.
10. Ordenar as células em três tubos de 15 ml (contendo 5 mL de meio RPMI) para a recolha simultânea de células B virgens (CD19 ⁺ CD27 ^-), células B de memória (CD19 ⁺ CD27 ^+), e PBS / PCS (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / oi} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    NOTA: Ordenar as células B naive e de memória podem ser cultivadas tal como descrito no passo 4.

4. Na diferenciação in vitro de células isoladas CD19 Humano ⁺ B, CD19 ⁺ CD27 ⁺ células B de memória, e CD19 ⁺ CD27 ^- células naive B

1. Usando as células purificadas nos passos 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células com meio RPMI 1640a uma concentração de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml e aliquotar-los para os poços de uma placa de 12 poços.
3. Adicionar CpG (ODN 2006) a 5 ug / 10 ⁶ células / ml ^{18, 29.}
4. Cultura das células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 5 dias.
5. Colher as células de cada poço, colocá-los separadamente em tubos de 15 ml, adicionar 5 mL de PBS a cada tubo e centrifugar-los a 600 xg e RT durante 5 min.
6. Contar as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automático. Ressuspender as células a uma concentração de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml com meio RPMI 1640.

5. ELISpot Assay

1. Adicionar 30 uL de 35% de etanol em água destilada a cada poço das placas ELISpot durante 30 s.
   NOTA: Quando pipetagem, evitando tocar na membrana nas cavidades em todos os momentos.
2. Inverter as placas ELISpot para remover o etanol.
3. Colocar 150 mL de DDH autoclavados ₂ O em cada poço e incubar-los à temperatura ambiente durante 5 minutos para lavar o etanol residual; seguir com uma lavagem de PBS estéril à temperatura ambiente durante 3 min.
   NOTA: As etapas 5.1 a 5.3 pode ser opcional, dependendo do fabrico das placas.
4. Coloque 50 uL de 5 ug / mL de anticorpo policlonal de F (ab ') ₂ de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) (em PBS) a cada poço das placas ELISpot e incubar a 4 ° C durante a noite (preferida) ou 37 ° C durante 2 h ^11.
   NOTA: Selar as bordas de placas com parafilme até à sua utilização.
5. Inverter as placas para remover Abs não ligado, adicionar 200 ul de PBS a cada poço e incubar duas vezes à temperatura ambiente durante 3 min de cada vez.
6. Adicionar 200? L de PBS com BSA a 5% (ou meio RPMI 1640) a cada poço para bloquear, e incubar à TA durante 2 h.
7. Inverter as placas para remover o tampão de bloqueio. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
8. Adicionar 100 uL de meio RPMI 1640 a cada poço e incubar a 37 ° C.
9. Quando estiver pronto para semear as células, inverter as placas para remover o meio RPMI 1640.
10. Semente de 100 uL (5 x 10 ^4), 50 mL (2,5 x 10 ^4), e 25 uL (1,25 x 10 ⁴⁾ das células (de passos 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, e 4.6) para os poços de uma placa ELISpot. Com meio RPMI 1640, perfazer o volume de 150 uL / ​​poço.
    NOTA: Um mínimo de uma ou duas diluições em série de 2 vezes para plaqueamento das células é recomendada.
11. Incubar as placas em uma incubadora a 37 ° C com _CO2 a 5% durante 8-14 h ^18. Evitar mover as placas durante a incubação.
12. Inverter as placas para remover as células e meio RPMI 1640.
13. Adicionar 200? L / cavidade de PBS-T (PBS com Tween 20 a 0,05%) e incuba-se-lhes 5 vezes à TA, cada vez durante 3 minutos. Inverta a placa para remover o tampão de lavagem entre cada um dos 5 lavagens.
14. Adicionar quer fosfatase alcalina de IgG de cabra-anti-humano (AP), Abs Fcy-específico (para a detecção de IgG, 1: 5000 em PBS-T) Ou de cabra anti-IgM humana-AP, Fcμ Abs específicos do fragmento (para a detecção de IgM, 1: 5000 em PBS-T) nas cavidades designadas e incubar à TA durante 2 h, no escuro.
15. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
16. Adicionar 50 / poço de solução de substrato de fosfato uL bromochloroindolyl-nitro azul de tetrazólio (BCIP / NBT). manchas de cor roxa normalmente aparecem em 5-15 min.
17. Adicionar 100 uL / poço de _ddH2O para evitar o sobre-revelação de manchas.
18. Lavar as placas com água corrente da torneira após o desenvolvimento completo de todos os pontos.
19. Remover o underdrain das placas e permitir-lhes secar ao ar, no escuro.
20. Contar as manchas utilizando um leitor automático de placas com um aparelho de imagem aquisição / análise (por exemplo, um scanner automático ou manualmente por meio de um microscópio de dissecção).
    NOTA: As placas podem ser armazenadas à temperatura ambiente no escuro e analisadas mais tarde.

Resultados

PBMCs foram depletados de glóbulos vermelhos e células aderentes (passos 1.2 a 1.7). Uma alíquota (2 X 10 ⁶⁾ de células foram submetidos a uma análise por citometria de fluxo para ilustrar as populações de células B naive, as células B de memória, e PBS / PCs no sangue periférico (Figura 1). Em PBMCs de dadores este, cerca de 10% dos linfócitos foram células B CD19 ^+. No compartimento de células B, a percentagem de CD19 ⁺ CD...

Discussão

Isolamento e Purificação de Células de Sangue Periférico Humano B

Normalmente, os glóbulos vermelhos podem ser eficientemente rompido e afastada pelo tampão de lise (passo 1.2). É importante que não se incubar PBMCs com o tampão de lise dos glóbulos vermelhos mais do que 5 minutos, como a viabilidade das células pode ser afectada pelo cloreto de amónio. Alternativamente, os glóbulos vermelhos e as plaquetas podem ser removidos simultaneamente por o protocolo seguinte.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 ml tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidin magnetic microbeads	BD Biosciences	9000810
15 ml Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinylated anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinylated anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size	Merck Millipore	MSIPS4510	sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer	C.T.L.