Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Zusammenfassung

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Zusammenfassung

Arzneimittelresistenz bleibt ein Hauptproblem bei der Behandlung von Krebs sowohl hämatologischen Malignitäten und soliden Tumoren. Intrinsic oder erworbene Resistenz kann durch eine Reihe von Mechanismen verursacht werden, einschließlich der erhöhten medikamentenbeseitigende, verringerte Arzneimittelaufnahme, Drogen Inaktivierung und Veränderungen von Arzneimitteltargets. Die jüngsten Daten zeigten, dass anders als durch bekannte genetische (Mutation, Verstärkung) und epigenetische (DNA-Hypermethylierung, Histon-post-translationale Modifikation) Modifikationen, Drogenresistenzmechanismen könnten auch durch Spleißen Verirrungen geregelt werden. Dies ist ein schnell wachsender Bereich der Untersuchung, die Zukunft Aufmerksamkeit, um verdient effektiver Therapieansätze zu planen. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird, bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile von mehreren in - vitro - Modellen durch RNA-seq und etablierened ein qRT-PCR-basierte Methode Kandidatengene zu validieren. Insbesondere untersuchten wir die Differential Spleißen von DDX5 und PKM-Transkripte. Die anomale Spleißen von der Rechenwerkzeug erkannt MATS wurde in leukämischen Zellen validiert, die zeigen, dass unterschiedliche DDX5 Splice-Varianten sind in den elterlichen gegen resistente Zellen exprimiert wird. In diesen Zellen beobachteten wir auch eine höhere PKM2 / PKM1 Verhältnis, das nicht in der Panc-1 Gemcitabin festen Gegenstück im Vergleich zu parentalen Panc-1-Zellen nachgewiesen wurde, einen anderen Mechanismus der Arzneimittelresistenz vorgeschlagen von Gemcitabin Exposition induziert.

Einleitung

Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsbehandlung, Resistenz von bösartigen Zellen gegenüber Chemotherapie, entweder intrinsisch oder bei längerer Arzneimittelexposition erfasst, ist der Hauptgrund für Therapieversagen in einem weiten Bereich von Leukämien und soliden Tumoren ^1.

Um die zugrunde liegenden Mechanismen Medikamentenresistenz in vitro - Zelllinie Modelle zu beschreiben sind , durch schrittweise Auswahl von Krebszellen resistent gegen chemotherapeutische Wirkstoffe entwickelt. Dieses Verfahren ahmt die Regime in den klinischen Einstellungen verwendet und erlaubt daher die gründliche Ermittlung relevanter Resistenzmechanismen. Resistente Zellen , die die Behandlung überleben , werden dann von der elterlichen empfindlichen Zellen zeichnen sich durch Verwendung von Zelllebensfähigkeit / Cytotoxizitätsassays ^2. In vitro drug resistance Profile von Primärzellen wurden signifikant im Zusammenhang mit klinischen Ansprechens auf eine Chemotherapie ³ erwiesen.

Hochdurchsatz-cytotoxicity Tests stellen eine bequeme Methode Arzneimittelempfindlichkeit in vitro zu bestimmen. Hierin wird die Lebensfähigkeit der Zellen bewertet , indem beispielsweise die 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide - MTT - Assay ^4, die auf metabolischen Umwandlung bestimmter Substrate basiert (dh Tetrazoliumsalze) in farbige Produkte, wodurch die mitochondriale Aktivität der Zellen widerspiegelt. Alternativ kann die zelluläre Proteingehalt quantifiziert werden unter Verwendung des Sulforhodamin B (SRB) Test ^5. Hier ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen proportional zu der optischen Dichte (OD) bei einer geeigneten Wellenlänge in einem Spektrophotometer gemessen, ohne die Notwendigkeit umfangreiche und zeitraubende Zellzählung Verfahren. Die Wachstumshemmung durch ein bestimmtes chemotherapeutisches Arzneimittel induzierte kann basierend auf der OD der Vertiefungen, in denen Zellen mit einem Testmittel und im Vergleich mit der OD der unbehandelten Kontrollzellen behandelt wurden, berechnet werden. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist OBTAined durch Arzneimittelkonzentrationen oder Prozent der lebenden Zellen relativ zu Kontrollzellen aufgetragen ist. Schließlich können Arzneimittelempfindlichkeit als die Konzentration angegeben, die in 50% der Hemmung des Zellwachstums führt , im Vergleich zu unbehandelten Zellen (IC _50).

Die Mechanismen, Arzneimittelresistenz zugrunde lagen, sind viele verschiedene Auffälligkeiten, wie Veränderungen der Genexpression von Determinanten der Arzneimittelaktivität und den Zellstoffwechsel beeinflussen. Diese molekularen Läsionen, einschließlich Mutationen, Abbildungsfehler bei einer Transkription und post-transkriptioneller Ebene sowie gestört epigenetischen Regulation oft Gene beeinflussen beteiligt entweder in den Arzneimittelmetabolismus oder Apoptose ^6.

Alternative pre-mRNA Splicing und seine komplizierten Regelung haben kürzlich beträchtliche Aufmerksamkeit als eine neue Entität empfangen , die Medikamentenresistenz von Krebszellen ⁷ diktieren kann. Bis zu 95% der menschlichen Gene werden alternativ in normalen Zellen mittels dieser gespleißtenstark regulierten Prozess, der viele verschiedene Protein-Isoformen aus dem gleichen Gen produziert. Alternatives Spleißen wird häufig in Krebs dereguliert und mehrere Tumoren werden durch veränderte Spleißen von einer wachsenden Anzahl von Genen in den Arzneimittelmetabolismus (dh Desoxycytidinkinase, folylpolyglutamate synthetase oder Multidrug - Resistenz - Proteine) ^6,8 beteiligt gekennzeichnet. Eine umfassende Analyse der Splicing Profile von arzneimittelresistenten Zellen ist schmerzlich fehlt. Daher ist es zwingend notwendig, Hochdurchsatzverfahren für alternative Splicing-Analyse zu entwickeln. Dies könnte helfen, effektiver Therapieansätze zu entwickeln.

Während des letzten Jahrzehnts, die rasante Entwicklung der nächsten Generation Sequenzierung (NGS) Technologien hat die biomedizinische Forschung , angereichert mit neuen Einsichten in die molekularen Mechanismen Regulation der Genomexpression regeln und ihre Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen ^9. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine leistungsfähige Unteranwendungvon NGS im Bereich der Transkriptomik. Es ermöglicht eine genomweite Profilierung (qualitativ und quantitativ) der Expressionsmuster von Tausenden von Genen gleichzeitig und ist gut geeignet für die Charakterisierung von neuen Codierung mRNAs sowie lange nicht-codierende RNA, miRNA, siRNA und andere kleine RNA Klassen (zB snRNA und piRNA) ^10,11.

RNA-Seq hat viele Vorteile gegenüber den bisherigen Technologien zur Charakterisierung Transkriptom (zB Sanger Sequenzierung und Expression Microarrays). Es ist nicht auf bestehende Genomannotation basiert, hat es einen single-nucleotide Höhe der Auflösung und es hat einen breiteren Dynamikbereich für Expressionsniveau Schätzung. Kurz gesagt, besteht die grundlegende experimentelle Workflow von RNA-seq Experimente von polyadenylierte Transkript (mRNA) Selektion und Fragmentierung, gefolgt von der Umwandlung in cDNA, Bibliothekskonstruktion und schließlich massiv parallele tiefe Sequenzierung ^12,13. Aufgrund der schnellen Tropfen sequencing Kosten in den letzten Jahren, RNA-seq ersetzt nach und nach anderen Technologien und erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die Bibliothek Vorbereitung Protokolle zu verbessern. Zum Beispiel ist es nun möglich, den Strang mit Informationen von mRNA-Transkripten zu erhalten, indem der zweite Strang cDNA mit Desoxyuridintriphosphat Markierung (dUTP) und vor der PCR-Amplifikation, Verdau des markierten Strangs mit Uracil-DNA-glycosilase (UDG). Dieser Prozess erhöht die Genauigkeit der Gen - Annotation und Abschätzung der Expressionsniveaus ^14,15.

Die Analyse und Interpretation von RNA-seq Daten erfordern komplexe und leistungsfähige Berechnungssoftwarepakete und Verarbeitung in bioinformatischen Pipelines ^16,17. Zuerst liest die rohe durch Beseitigung der technischen und biologischen Artefakte Qualitätskontrolle zu unterziehen und zu verwerfen (Trimmen), um die Sequenzen, die keine strengen Qualitätsanforderungen erreichen. Anschließend liest die für jede Probe zu einem Referenzgenom abgebildet werden und indiziertin Gen-Ebene, Exon-Ebene oder Transkript-Ebene, um die Fülle der einzelnen Kategorien zu bestimmen. Je nach Anwendung werden verfeinerten Daten dann durch statistische Modelle zur Identifizierung von Allel-spezifische Expression, alternative Spleißen, Genfusionen und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) ¹² berechnet. Schließlich auf ausgewählte Ebene Differentialanalyse (dh Genexpression oder alternatives Spleißen) können verwendet werden , um Proben unter verschiedenen Bedingungen erhaltenen zu vergleichen.

Differential Splicing-Analyse beschreibt die Unterschiede in Spleißstelle Verwendung zwischen zwei Proben. Eine zunehmende Anzahl von Software zu diesem Zweck gewidmet Pakete stehen zur Verfügung auf der Grundlage verschiedener statistischer Modelle, Performances und Benutzeroberfläche ^18. Unter diesen MATS (Multivariate Analyse von Transcript Splicing) entpuppt sich als frei verfügbar und präzise Berechnungstool auf der Basis eines Bayes-statistischer Rahmen und zu erkennen verschie entworfenrenz Splicingereignisse aus einzelnen oder paarweise Ende RNA-seq Daten. Ausgehend von den ausgerichteten (.bam) Dateien können MATS erkennen alle gängigen Arten von alternativen Splicingereignisse (Exon - Skipping, alternative 3'Spleißstelle, alternative 5'Spleißstelle, sich gegenseitig ausschließende Exons und Introns Bindung - auch siehe Abbildung 1).

Zuerst liest die Software identifiziert, die eine bestimmte Spleiß-Ereignis, zum Beispiel Exon-Skipping unterstützen und klassifiziert sie in zwei Typen. "Inklusion liest" (für die kanonische Spleiß-Ereignis) Karte innerhalb des untersuchten Exons und die Übergänge zwischen diesen spezifischen Exon und den beiden vor- und nachgelagerten flankierenden Exons erstrecken. "Skipping liest" (für die alternative Spleiß-Ereignis) zwischen den beiden flankierenden Exons der Kreuzung erstrecken. Anschließend kehrt MATS die normierte Aufnahme Ebene sowohl für die kanonische und alternative Veranstaltungen und vergleicht Werte zwischen den Proben oder Bedingungen. Letztlich berechnet es P-Wert einnd falsche Entdeckung Rate (FDR) unter der Annahme , dass die Differenz in der Variante Verhältnis eines Gens zwischen zwei Zuständen überschreitet einen bestimmten benutzerdefinierten Schwelle für jeden Spleißvorgang ^19,34.

Nach Differential Splicing - Analyse in Verbindung mit RNA-seq eine umfangreiche experimentelle Validierung ist gerechtfertigt , um wahr-positive Gen - Kandidaten ¹⁸ zu identifizieren. Quantitative Reverse Transkription-Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) ist die am häufigsten verwendete und optimale Verfahren bei der Validierung von Kandidaten von RNA-Seq - Analyse ²⁰ erhalten. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Methode zur Verfügung zu stellen drug resistance bezogenen Spleißen Profile in soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten zu untersuchen. Unser Ansatz nutzt RNA-seq-basierte Transkriptom Profilierung ausgewählter Zelllinie Modelle von arzneimittelresistenten Krebserkrankungen in Kombination mit einer etablierten qRT-PCR-Verfahren zur Validierung von Kandidatengenen in Arzneimittelresistenz beteiligt.

Die menschliche Leukämiezelllinie Modelle in dieser Studie verwendeten pädiatrischen enthalten T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL) Zelllinie CCRF-CEM (CEM-WT), seinen zwei Glucocorticoid (GC) -resistenten Subklone CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) und CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 und die Methotrexat (MTX) -resistenten subline CEM / R30dm ^23. Obwohl die derzeitigen Therapien auf Basis von GCs und MTX in etwa 90% der Fälle klinischer Nutzen schaffen, stellt die Entstehung von GC-Resistenz noch ein ungelöstes Problem mit einem unklaren molekularen Mechanismus. GC-resistente Subklone, CEM-WT-Zellen wurden in 1 uM Dexamethason (Dex) für 2 bis 3 Wochen isolieren. MTX-resistente subline CEM / R30dm wurde durch wiederholte kurzfristige (24 h) Exposition von CEM-WT-Zellen auf 30 & mgr; M MTX als Mimik der klinischen Protokolle entwickelt. Interessanterweise ist auch diese Zelllinie angezeigt Kreuzresistenz gegen Dex (unveröffentlichte Ergebnisse), für die der Mechanismus nicht vollständig verstanden wird.

Der feste Tumoder das Modell in der vorliegenden Studie untersucht ist duktalen Adenokarzinom des Pankreas, berüchtigt für seine außergewöhnlichen refractoriness auf die Chemotherapie. Zu diesem Zweck wählten wir Panc-1 - Zelllinie und die Gemcitabin-resistenten Subklon Panc-1R durch kontinuierliche Inkubation mit 1 & mgr; M des Medikaments ^24. Hier beschreiben wir einen Ansatz neuartige Mechanismen zu entdecken , in-vitro - Arzneimittelresistenz zugrunde liegenden durch die Kombination von drei Protokolle: kolorimetrisch Cytotoxizitätsassays Arzneimittelempfindlichkeit in leukämischen Zellen und Krebszellen von soliden Tumoren, RNA-seq-basierte Pipeline zu identifizieren , neue Splice - Varianten zu beurteilen , in Bezug auf Arzneimittelempfindlichkeit / Widerstand und RT-PCR und qRT-PCR-Analyse potenzielle Kandidaten zu validieren.

Protokoll

1. Charakterisierung von Arzneimittelresistenz Profile durch Cytotoxizitätsassays

1. Leukämische Zelllinie Kultur
   1. Pflegen Sie die elterliche T-Zell - ALL - Zelllinie CCRF-CEM (CEM-WT) sowie seine arzneimittelresistente Subleitungen, einschließlich CEM / R30dm, CEM-R5 und CEM-C3, in 25 cm ² in 10 ml RPMI-1640 - Medium , das 2,3 uM Folsäure mit 10% fötalem Kälberserum und 100 Einheiten / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin supplementiert.
   2. Kultur die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
   3. Lassen Sie das Zellwachstum zu Konzentrationen zwischen 2 - 3 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   4. Aufgeteilt , die Zellen zweimal in der Woche mit einer Anfangskonzentration von 0,3 x 10 ⁶ Zellen / ml (beispielsweise , wenn die Zellkonzentration 3 x 10 ⁶ Zellen / ml, 1 ml Zellsuspension in einen neuen Kolben mit 9 ml frisches Medium). Entsorgen Sie die Kultur nach 20 aufeinander folgenden Passagen.
2. Pankreaskarzinom - Zelllinie Kultur
   HINWEIS: Pflegen der menschlichen Pankreas - Karzinomzelllinie Panc-1 in 75 cm ² Kulturflaschen in 10 ml DMEM - Medium mit hoher Glukose und L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum und 100 Einheiten / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin . Die arzneimittelresistente Variante Panc-1R, kultiviert wird, in dem gleichen Kulturmedium, das 1 uM Gemcitabin in sterilem Wasser gelöst. Weitere Einzelheiten sind in ²⁴ zur Verfügung gestellt.
   1. Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
   2. Aufgeteilt, die Zellen alle 2 - 3 Tage in einem Verhältnis von 1: 5, wenn die Zellen Konfluenz erreichen, von etwa 90%.
   3. Um die Zellen zu spalten, waschen Sie die zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 1 ml Trypsin / EDTA pro 75 cm ² Kulturkolben und Inkubation bei 37 ° C für 3 min.
   4. In 9 ml Medium und ernten die abgelösten Zellen in einem 15-ml-Tube. Seed 2 ml Zellsuspension in einen neuen Kolben containing 8 ml Medium. Entsorgen Sie die Kultur nach 20 aufeinander folgenden Passagen.
3. MTT - Assay für leukämischen Zellen
   1. Bereiten Sie die MTT-Lösung im voraus: Man löst 500 mg MTT Formazan in 10 ml PBS zugeben und umrühren (lichtgeschützt) mit einem Magnetrührer für ca. 1 Std. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,22 um-Filter. HINWEIS: Die Lösung kann in 10 ml Aliquots bei -20 ° C gelagert werden. Schutz vor direktem Licht nach dem Auftauen.
   2. Bereiten Sie die angesäuerte Isopropanol im Voraus: 50 ml 2 M HCl auf 2,5 l Isopropanol. Hinweis: Bewahren Sie mindestens einen Monat bei Raumtemperatur vor der Anwendung die Lösung für. Wenn das Isopropanol nicht richtig angesäuert wird, könnte es Niederschläge mit dem Medium bilden, und die spektrophotometrische Anzeige beeinträchtigen.
   3. Bereiten Sie eine separate 96-Well-Flachboden "Tag 0" (Kontrolle) Platte, um sicherzustellen, genauere Schätzung der Wachstumshemmung: widmen 3 bis 6 Wells pro Zelllinie, fügen Sie 30 ul WachstumMedium und 120 & mgr; l der Zellsuspension (8000 Zellen) pro jeder Vertiefung und 150 ul Wachstumsmedium in die Vertiefungen zu Rohlingen (keine Zellen) entspricht. Gehen aus Schritt 1.3.9 1.3.13 dieses Abschnitts zu Schritt der optischen Dichte (OD) zu messen. HINWEIS: Weitere Details werden in ⁴ zur Verfügung gestellt.
   4. Bereiten Sie eine 96-Well-Flachboden experimentellen Platte: widmen 30 Brunnen zu Wirkstoffkonzentrationen (10 Konzentrationen, die jeweils in dreifacher Ausführung), 10 Brunnen Zellen zu steuern und 10 Brunnen zu steuern Medium ohne Zellen (Rohlinge) und bereiten Sie ein Medikament Verdünnungsbereich von Dexamethason ( Dex) unter Verwendung von Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel.
      HINWEIS: Für CEM-WT-Zellen der Dex Verdünnungsbereich liegt zwischen 2 & mgr; M und 0,97 nM. Für CEM / R30dm, CEM-R5 und CEM-C3-Zellen der Dex Verdünnungsbereich liegt zwischen 640 & mgr; M und 0,33 nM.
   5. In 30 ul von jeder Dex Verdünnung in eine entsprechende Vertiefung der 96-Well-Platte. Achten Sie darauf, die jede Konzentration in einem dreifach aufzunehmen.
   6. Zugabe von 30 & mgr; l Wachstumsmedium guts entsprechend Rohlingen entsprechenden Zellen und 150 & mgr; l Wachstumsmedium zu den Vertiefungen zu steuern.
   7. Ernten Sie die Zellen und resuspendieren bei ihrer optimalen Aussaat Konzentration exponentiell wächst.
      HINWEIS: Um eine optimale Ausgangszellkonzentrationen zu bestimmen, wird empfohlen, das Wachstumsprofil von jeder Zelllinie Zelllinie in einer 96-Well-Platte zu beurteilen, die von Zellen bei verschiedenen Konzentrationen der Aussaat und es täglich für mindestens 4 Tage zu messen. Wählen Sie eine Seeding-Konzentration, die übermäßiges Wachstum von Zellen nach 72 Stunden verhindert, da dies das Experiment durch sättigender die OD-Werte beeinflussen. Für CEM-WT, CEM-C5 und CEM-R5 die optimale Seeding Konzentration beträgt 8.000 Zellen / Vertiefung, während für CEM / R30dm es 5.000 Zellen / Vertiefung ist.
   8. Zugabe von 120 ul Zellsuspension zu jeder Vertiefung, die entweder die Arzneimittellösung oder dem Wachstumsmedium (wells entsprechenden Zellen zu kontrollieren). Füllen Sie die leeren äußeren Vertiefungen der Platte mit 150 & mgr; l PBS gut Feuchtigkeit in der Platte, um sicherzustellen, und Inkubation the - Platten für 72 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO ₂ in einem Zellkulturbrutschrank.
   9. In 15 ul der MTT-Lösung in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 5 Minuten mit einem Plattenschüttler bis zu einem Maximum von 900 Shakes / min.
   10. Legen Sie die Platten wieder bei 37 ° C mit 5% CO ₂ in einer Zellkultur - Inkubator und Inkubation für eine weitere 4 - 6 Std.
   11. In 150 ul des angesäuerten Isopropanol in jede Vertiefung und mischen gut mit einer Mehrkanalpipette gründlich alle Formazankristallen wieder zu suspendieren. Beginnen Sie mit den leeren Brunnen und stellen Sie sicher, die Spitzen gut zu spülen, bevor zu einer anderen Zeile der Platte verläuft.
   12. Die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 10 min.
   13. Mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader, bestimmen die OD bei 540 und 720 nm eine genaue Messung zu gewährleisten, für die Hintergrund OD durch Korrektur. Dann werden die Daten in einer Tabellendatei speichern und ⁴ zu analysieren.
4. SRB - Assay für Pankreas - Karzinom - Zellen
   1. Auflösen SRB Reagenz in 1% Essigsäure bei einer Endkonzentration von 0,4% (w / v).
   2. Auflösen Trichloressigsäure (TCA) in Reinstwasser in einer Endkonzentration von 50% (w / v).
   3. Auflösen Tris (hydroxymethyl) -aminomethan in Reinstwasser in einer Endkonzentration von 10 mM.
   4. Bereiten Sie eine separate 96-Well-Flachboden "Tag 0" Steuerplatte genauere Schätzung der Wachstumshemmung zu gewährleisten: Samen 6 Vertiefungen mit Zellen in der exponentiellen Phase in 100 ul Medium in geeigneten Seeding Konzentration und mit 100 & mgr; l Medium wächst nur in die Vertiefungen entsprechend Rohlinge. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren , mit 5% CO ₂ ordnungsgemäße Adhäsion der Zellen an die Platte zu sichern. Dann werden 100 & mgr; l Medium in jede Vertiefung und zu den Schritten 1.4.8 vorgehen - 1.4.16 dieses Abschnitts.
   5. Bereiten Sie eine 96-Well-Flachboden experimentellen Platte: Samenzellen in der exponentiellen Phase in dreifacher Ausfertigung in 96 Vertiefungen Flachbodenplatten in der geeigneten Dichte in 100 ul mir wächstdium durch einen mehrkanaligen Pipette.
      HINWEIS: Um eine optimale Ausgangszellkonzentrationen zu bestimmen, wird empfohlen, das Wachstumsprofil von jeder Zelllinie Zelllinie in einer 96-Well-Platte zu beurteilen, die von Zellen bei verschiedenen Konzentrationen der Aussaat und es täglich für mindestens 4 Tage zu messen. Wählen Sie eine Seeding-Konzentration, die übermäßiges Wachstum von Zellen nach 72 Stunden verhindert, da dies das Experiment durch sättigender die OD-Werte beeinflussen. Für Panc-1 und Panc-1R-Zellen, die eine optimale Aussaat Konzentration ist 8000 Zellen / Vertiefung.
   6. Füge 100 & mgr; l Medium zu Medium-only Vertiefungen und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO ₂ ordnungsgemäße Adhäsion der Zellen an die Platte zu sichern.
   7. Bereiten Sie eine Droge Verdünnungsbereich von Gemcitabin zwischen 1 & mgr; M und 10 nM für Panc-1 und 1 mM und 100 nM für Panc-1R-Zellen. In 100 ul von jeder Verdünnung in eine entsprechende Vertiefung der 96-Well-Platte durch einen mehrkanaligen Pipette. Achten Sie darauf, die jede Konzentration in dreifacher Ausführung zu haben. In Ergänzung,mit 100 & mgr; l Medium zu den mittel nur Brunnen und den Kontrollzellen. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 72 Stunden.
   8. Zugeben von 25 & mgr; l kaltem TCA-Lösung in die Vertiefungen durch eine Mehrkanal-Pipette und inkubiere die Platten für mindestens 60 min bei 4 ° C, um die Proteine ​​am Boden der Vertiefungen zu präzipitieren und zu fixieren.
   9. Leeren Sie die Platte durch das Medium und kurz antrocknen auf einem Gewebe zu entfernen.
   10. Waschen Sie 5-mal mit Leitungswasser, dann die Platte entleeren und trocknen lassen bei Raumtemperatur.
   11. Werden 50 & mgr; l SRB-Lösung pro Vertiefung unter Verwendung einer repeat-Pipette und Färbung für 15 min bei Raumtemperatur.
   12. Leeren Sie die Platte durch die SRB Fleck zu entfernen.
   13. Waschen Sie 4-mal mit 1% Essigsäure, dann die Platte leer und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen.
   14. Zugabe von 150 & mgr; l Tris-Lösung pro Vertiefung durch einen mehrkanaligen Pipette und auf einem Plattenschüttler bis zu einem Maximum von 900 Shakes / min für 3 min mischen.
   15. Lesen Sie die optische Dichte bei 540 nm (oder 492 nm, wenn ter OD-Werte sind zu hoch).
   16. Analysieren Sie die Daten.
5. Datenanalyse für MTT und SRB - Assays
   1. Berechnen Sie die OD - Werte von Zellen bei "Tag 0" mit der folgenden Formel: OD _{Tag 0} = OD _{Kontrollzellen} - Durchschnittliche OD _{leere Brunnen}
   2. Berechnen Sie den Prozentsatz der überlebenden Zellen für jede Arzneimittelkonzentration nach folgender Formel:% Die behandelten Zellen = Mittelwert [OD _{behandelten Zellen} - Durchschnittliche OD _{leere Brunnen} - OD _{Tag 0]} / [OD _{Kontrollzellen} - Durchschnittliche OD _{leere Brunnen} - OD _Tag0] * 100
   3. Plotten der Dosis-Wirkungs-Kurve (Arzneimittelkonzentration vs. Wachstumsinhibierung in%).
   4. Berechnen der Konzentration des Arzneimittels , die das Wachstum der Zellen um 50% (IC ₅₀₎ unter Verwendung der Dosis-Wirkungskurve hemmt.

2. RNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung für die RNA-Sequenzierung

1. Beispiel Collection und RNA-Isolierung
   1. Für CEM - Zellen: Ernte 10 ⁶ Zellen direkt aus dem Kulturmedium.
   2. Für Panc-1 und Panc-1R: entfernen Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und lösen durch Zugabe von Trypsin-EDTA und 3 min bei 37 ° C inkubiert werden. In Kulturmedium und ernten 10 ⁶ Zellen.
   3. Spin down Proben bei 300 g für 3 Minuten, entfernen Sie den Überstand und extrahieren Gesamt-mRNA im Handel erhältlichen Silica-Membran-Spin-Säulen verwenden, indem der Hersteller `Protokoll folgen.
   4. Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der Gesamt-RNA durch ein UV-Vis-Spektralphotometer.
      HINWEIS: RNA wird als von hoher Reinheit, wenn die 260 nm / 280 nm Absorptionsverhältnis über 1,8 liegt. 80 ° C - Die Proben können gespeichert werden.
   5. Gesamt-RNA beurteilen Integrität durch Elektrophorese von 200 ng der Probe auf 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt.
      HINWEIS: Der Nachweis von zwei intakten Bänder zu entsprechenden Säuger 28S und 18S rRNAs bei ca.2 kb und 1 kb in der Größe von guter Gesamt-RNA Integrität anzeigt.
2. Sequencing Bibliothek Vorbereitung
   1. Verwenden Sie 2 ug Gesamt-mRNA für jede Probe. Folgen mRNA-Bibliothek Präparationsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Bestimmen Sie die Qualität und Konzentration jeder Bibliothek durch ein Bioanalyzer System. Pool, die Bibliotheken in einer einzigen Probe bis zu einer Endkonzentration von 10 nmol / L und messen Sie es mit dem Bioanalyzer.
   3. Verwenden Sie Hochdurchsatz-Sequenzierung System mit Single Read 100 bp-Modus.
      Hinweis: Lesen Sie Länge von> 80 bp ist notwendig für die Transkriptions Isoformen identifiziert.

3. Nachweis von Differential Splicing von Sequencing Liest

1. Die Angleichung der Liest Genome und Qualitätsprüfung auf Referenz
   1. Stellen Sie ein beliebiges Gen-Annotation (.GTF-Datei) von der NCBI refGene Tabelle mit UCSC Tabelle Browser (25.963 Gene).
   2. AusführenAnnotation-aware gapped Ausrichtung der Sequenzierung liest auf dem Referenzgenom (GRCh37) unter Verwendung von STAR.
   3. Sortieren und Index die resultierenden Ausrichtung Dateien mit picard-Tools.
   4. Führen Sie die nach-Mapping Qualitätskontrolle von RSeQC und samtools verwenden.
2. Differential Splicing - Erkennung zwischen Probengruppen
   1. Installieren Sie Python und entsprechende Versionen von NumPy und SciPy. Downloaden und installieren Sie samtools. Downloaden und installieren Sie Bowtie und Zylinderhut,
   2. Fügen Sie die Python, Bowtie, Zylinderhut und samtools Verzeichnisse auf die Umgebungsvariable $ PATH. Herunterladen vorgefertigte Bowtie-Indizes (hg19). Herunterladen rMATS Version 3.0.9.
      HINWEIS: Weitere Details über rMATS sind in ¹⁹ und ³⁴ zur Verfügung gestellt.
   3. Erkennen alternative Splicingereignisse durch jede Dex-resistenten Zelllinie CEM-WT und Panc-1 bis Panc-1R in getrennten MATS Vergleich läuft nach 5A.
   4. Zur Erkennung von Differential Splicingereignisse von previonuierlich ausgerichtet Sequenzierung liest (.bam - Dateien), führen MATS mit den Befehlen aus 5B für CEM-WT vs. CEM - C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT vs. CEM / R30dm und Panc1 zu Panc- 1R Vergleiche.
      HINWEIS: MATS wird einen Ausgabeordner mit zwei TXT-Dateien mit den Ergebnissen je nach Art der Spleißereignis analysiert (SE erstellen - Exon-Skipping, A5SS - Alternative 5'Spleißstelle, A3SS - Alternative 3'Spleißstelle, MEX - gegenseitig aus Exons und RI - Intron Retention): eine Datei mit Ergebnissen basierend auf Kreuzung zählt nur, und eine zweite Datei mit den Ergebnissen basierend auf Kreuzung zählt und liest am Ziel. Darüber hinaus wird eine zusätzliche .txt-Datei mit einem Ergebnis-Übersicht im selben Ordner erzeugt.
   5. Für SE, A5SS, Import A3SS und RI die TXT-Dateien in Tabellen basierend auf Kreuzung zählt und liest am Ziel. Für MEX importieren die TXT-Dateien basierend auf Kreuzung zählt nur.
      HINWEIS: MATS Ausgabedatei durch aufsteigende P-Werte sortiert und enthält mehrere Parameter: Gen-ID, Gen-Symbol, Chromosom und Strang Position, genomische Koordinaten der alternativ Fragmente Kanten verbunden, zählt sowie die Länge der Aufnahme und Formen für beide untersuchten Proben, die Länge der Aufnahme und das Überspringen Form verwendet für die Normalisierung, p-Wert, False Discovery Rate (FDR-Skipping ), Einbeziehung Ebene für jede Probe basierend auf normalisierte Zählungen und der differenzierten Inklusion Score (Durchschnitt (IncLevel1) - Durchschnitt (IncLevel2)).
   6. Wählen Sie statistisch signifikante Kandidatengene mit einem FDR <10% für eine weitere Validierung (zB DDX5 und PKM2).
   7. Visualisieren Sie alternative Splicingereignisse mit Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), wie in Abbildung 5 angegeben.

4. Validierung der Ergebnisse durch RT-PCR und qRT-PCR-Assays

1. Primer - Design
   HINWEIS: Um eine zuverlässige Validierung von Ergebnissen, um die bioinformatischen Pipeline unter Verwendung der mRNA transcripts von alternativen Spleißvorgängen resultieren, werden unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert und durch Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte sichtbar gemacht. Cyanine grünen Farbstoff wie SYBR grün qRT-PCR-Assay verwendet wird, spezifische Spleiß zu quantifizieren Varianten relativ zu einem Housekeeping-Gen. Abbildung 7 zeigt die Strategie angewendet , um die Exon - 12 - Skipping - Ereignis des DDX5 Gens zu visualisieren und die sich gegenseitig ausschließende Exon 9 und Exon 10 des PKM - Gens zu quantifizieren.
   1. Für RT-PCR - Assay - Design Primer - Paare , die zu einer konstitutiven anneal Exons (Exon 10 und Exon 13) stromaufwärts und stromabwärts der alternativen Spleißstellen (7A).
      HINWEIS: Die Amplicongröße sollte zwischen 100 und 800 bp abdecken, um eine klare Trennung der vorhergesagten PCR-Produkte auf einem Agarosegel zu gewährleisten. Die Annealingtemperatur der Primer sollte zwischen 55 und 65 ° C und der GC-Gehalt 60% nicht überschreiten sollte.
   2. Cyaningrün Assay (7B).
      1. Überprüfen Sie die Sequenzhomologie der beiden gegenseitig aus Exons und Design zwei Primerpaare, von denen jedes spezifisch und ausschließlich erkennt nur eine der beiden Spleißvarianten.
         HINWEIS: Für die PKM, der Reverse-Primer anlagert 11 für beide Varianten zu Exon, während die Vorwärts-Primer sind variantenspezifische und Ausheilung zu Exon 9 (PKM1) oder Exon 10 (PKM2).
      2. Um DDX5 Gens voller Länge, tempern der Rückwärtsprimer innerhalb des übersprungenen Exon (Exon 12) zu erfassen.
         HINWEIS: Für die spezifische Erkennung der DDX5 ΔEx12 Variante der Rückwärtsprimer überspannt die exon11 / exon13 Grenze. Verwenden Sie die gleiche Vorwärtsprimer, die zu einer konstitutiven Exon anlagert 10 für beide Reaktionen.
         HINWEIS: Die Amplicongröße zwischen 80 und 200 bp sein sollte.
2. Erststrang - cDNA - Synthese
   1. Set up reverse Transkription von 1 ug der isolierten RNA in cDNA unter Verwendung von 200 U / ul Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverse Transkriptase in seiner Reaktionspuffer 1: 5 verdünnt mit sterilem Wasser. Hinzufügen DTT 1 uM, 0,05 ug zufällige Hexamere, Desoxynucleotid-Mix (dNTP) 1 mM und 40 U / ul Ribonuclease-Inhibitor.
   2. Vortex kurz und Inkubation des Reaktionsgemisches bei 37 ° C für 2 Stunden.
   3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 70 ° C für 5 min, um die reverse Transkriptase, übertragen Sie die Mischung auf Eis zu inaktivieren und Spin-down von einer Mikro verwenden. Die Proben können sofort oder gelagert bei verwendet werden - 20 ° C.
3. RT-PCR - Reaktion und Agarose Gel
   1. Stellen Sie die PCR-Reaktion in einer PCR-gefäß für jede Probe durch Mischen von 12,5 & mgr; l 2x konzentrierten PCR Mastermix, 1,25 & mgr; l von 10 & mgr; M Vorwärts-Primer und die gleiche Menge für den reverse-Primer bis zu einem Endvolumen von 25 & mgr; l mit sterilem Wasser.
   2. In 1 ul cDNA auf die Mischung und legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler. Führen Sie das Programm wie folgt: Anfängliche Denaturierung: 95 ° C für 2 min.Reite die folgenden Schritte für 35 Zyklen: Denaturierung bei 95 ° C für 25 Sekunden; Annealing bei 52 ° C für 35 sec; Verlängerung bei 72 ° C für 1 min. Set abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min.
   3. Vorbereitung 1% Agarosegel durch Lösen von 1 g Agarose in 100 ml 1x TBE-Puffer. Hinzufügen, 2,5 & mgr; l Ethidiumbromid zur Lösung. ACHTUNG: Ethidiumbromid ist krebserregend, mit Vorsicht hand durch einen chemischen Abzugshaube verwenden.
   4. Legen Sie die Proben und das Gel in 1x TBE-Puffer laufen bei 100 V für ca. 30 min in einem Elektrophorese-System.
   5. Reveal das Gel mit einem digitalen UV-Kamera und das Bild zu speichern.
4. qRT-PCR und Datenanalyse
   1. Stellen Sie die Cyanine green PCR Reaktion für jede Probe um 12,5 & mgr; l 2x grün PCR Mastermix Mischen, 2 & mgr; l von 5 & mgr; M Vorwärts-Primer und die gleiche Menge für den reverse-Primer bis zu einem Endvolumen von 15 & mgr; l mit sterilem Wasser in einem PCR-Röhrchen . Bereiten Sie eine Mischung für jede spezifische SpleißVariante nachgewiesen werden (PKM1, PKM2, DDX5 in voller Länge, DDX5 ΔEx12) und für das Housekeeping-Gen (GUS) zu werden.
   2. Legen Sie das Mastermix auf einem weißen 96-Well-Platte und bereiten Duplikate pro jede Probe.
   3. Verdünnen Sie die cDNA 10x in Wasser, fügen Sie 5 ul zu jeder Mischung und legen Sie die Platte in den Thermocycler. Führen Sie das Programm wie folgt: anfängliche Denaturierung: 95 ° C für 5 min. Reite die folgenden Schritte für 45 Zyklen: Denaturierung bei 95 ° C für 10 Sekunden; Annealing bei 58 ° C (für DDX5 und DDX5 ΔEx12 Mischungen) oder 60 ° C (für PKM1 und PKM2 mischt) für 20 sec. Set abschließende Extension bei 72 ° C für 20 sec. Sollkurve Schmelzen durch einen Gradienten von 65 bis 97 ° C aufgebracht wird.
   4. Um sich die Spezifität der Primer-Sets zu ihrem Ziel, überprüfen Sie die Schmelzkurven und stellen Sie sicher, dass eine einzelne Spitze zu beurteilen, für jeden Primersatz gebildet.
   5. Berechnen Sie die zweite Ableitung Werte der Verstärkungskurven und exportieren Sie die Zyklus Schwellenwerte (Ct).
   6. Calculate die relativen Expressionsniveaus (REL) der mRNA Spleiß-Varianten mit dem "Delta Ct (ACt)" Verfahren in jeder Probe mit dem GUS-Housekeeping (Referenz) Gen verglichen. Die Formel lautet: REL = 2 ^{- ACt,} wo ACt = Ct _{Ziel Splice} - _Variante - Ct _Referenz - _Gen
   7. Um die relative Häufigkeit von Splice - Varianten, die Berechnung der REL - Verhältnis unter Verwendung der Formel zu quantifizieren: Verhältnis REL - Verhältnis = REL _Splice - _{Variante 1} / REL _Splice - _{Variante 2.}

Ergebnisse

Die Cytotoxizität - Assays in dem Protokoll beschrieben bieten eine zuverlässige und robuste Methode der Beständigkeit von Krebszellen gegenüber chemotherapeutischen Mitteln in vitro zu beurteilen. CEM / R30dm, CEM-R5 und CEM-C3: mittels des MTT-Assay, Empfindlichkeit gegen Dex wurde in vier T-ALL-Zellinien, einschließlich Dex empfindlichen parentalen CEM-WT-Zellen und drei Dex-resistente Unterlinien bestimmt. Zwei verschiedene Konzentrationsbereiche hatten aufgrund von CEM...

Diskussion

Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, der gut etablierten Zytotoxizität Techniken Screening kombiniert und leistungsstarke NGS-basierte Transkriptom-Analysen in Bezug auf Arzneimittelresistenz Differential Splicingereignisse zu identifizieren. Spektrophotometrische Assays sind bequem und robust Hochdurchsatzverfahren Arzneimittelempfindlichkeit in in - vitro - Krebsmodellen und stellen die erste Wahl für viele Labors durchführen Zytotoxizität Screenings zu bewerten. Fehlerbehebung sowie möglich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140