JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מודל מהדק hilar כבד עכברוש ייחודי שפותח עבור הבוחנים את שפעת מולקולות תרופתיות לטיוב פגיע reperfusion-איסכמיה. מודל זה כולל cannulation ישיר של אספקת הפורטל למגזר הכבד איסכמי באמצעות סניף של וריד השער, המאפשר למסירה כבדה ישירה.

Abstract

ניתוח בכבד סרן עם חסימת זרימה, השתלה כבדה, להצריך תקופה של איסכמיה החמה, ותקופה של reperfusion המוביל איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעה עם השלכות שליליות עצומות. פציעת I / R פוטנציאל באיברים שוליים המיועד להשתלת כבד תורם המחסור התורם הנוכחי משתיים לשיעור ניצול איבר ירד. צורך משמעותי קיים לחקור שאני בכבד / פציעה R כדי לתווך והשפעתו על תפקוד שתל בהשתלות. כבד עכברוש דגמי מהדק hilar משמשים כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות שונות על פציעת I / R בכבד. בהתאם לדגם, מולקולות אלה הועברו באמצעות אינהלציה, עירוי אפידורל, הזרקת intraperitoneal, עירוי לוריד או הזרקה לווריד mesenteric מעולה הפריפריה. מודל מהדק עכברוש כבד hilar פותח לשימוש לומד את ההשפעה של מולקולות תרופתיות לטיוב פציעת I / R. describדגם ed עבור מהדק hilar עכברוש הכבד כולל cannulation ישיר של אספקת הפורטל למגזר הכבד איסכמי באמצעות סניף צד של וריד השער, המאפשר למסירת כבד מגזרית ישירה. הגישה שלנו היא לגרום איסכמיה באונות לרוחב ו חציון שמאל 60 דקות, במהלכן החומר נחקר הוא חדיר. במקרה זה, סופראוקסיד דיסמוטאז-PEGylated (PEG-SOD), נבלות רדיקלים חופשיים, הוא החדיר ישירות בקטע איסכמי. סדרת ניסויים זו ממחישה כי עירוי של PEG-SOD הוא מגן מפני פגיעה I / R בכבד. יתרונות של גישה זו כוללים הזרקה ישירה של המולקולה לתוך קטע איסכמי עם ירידה סוגרת נפח פיזור וצמצום תופעות לוואי מערכתיים.

Introduction

ניתוח בכבד סרן עם חסימת הזרימה, השתלת כבד, להצריך תקופה של איסכמיה חמה, ותקופה של reperfusion המוביל איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעה 1. ההשלכות של פגיעה I / R בכבד פורטו 1 בהרחבה, 2, 3. השלכות של I / פציעת R המפורטים בספרות כוללות: דור של מיני חמצן תגובתי, חניכה של המפל הדלקתי כולל הפעלה של נויטרופילים, תאי Kupffer, ותאי אנדותל, הפעלת מערכת oxygenase heme והפעלה של קולטנים דמוי אגרה, גידול חוסר איזון בין אנדותלין ו תחמוצת חנקתית, הפעלת גורם-κB גרעיני, וקידום של ציטוקינים מעודדי דלקת ו מולקולה הדבקה סינתזה 1, 2, 3. אירועים אלה עשויים מעודדי דלקת lהתפוצץ אפופטוזיס, נמק, תפקוד איברים כשל איברים הסופי 3.

I / R פגיע באיברים המיועדים להשתלת כבד יכול להוביל לאובדן שתל מוקדם תורם המחסור התורם הנוכחי כמו איברים שוליים רגישים יותר לפגיעה 3. ישנם כיום 15,226 נמענים פוטנציאליים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד בארצות הברית 4 ורק 5950 השתלות כבד בוצעו ב 2015 5. בשל מגבלה קיצונית זו זמינה איבר, מחקר לחקור פציעת I / R כבד נחוצה על מנת לייעל פונקצית שוחד ניצול איברים.

מודלים בבעלי חיים המשמשים ללמוד פציעת I / R כבד כוללים מודלי מהדק hilar עכברוש ומודלי השתלת חולדה כבדות. יש מגוון של מודלים מהדק עכברוש hilar כיום בשימוש. הנפוץ ביותר הוא אחד שבו הוריד הפורטלי, עורק הכבד והמרה duct לספק את האונות לרוחב ו חציון שמאל הם הדקו באמצעות קטעי מייקרו 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 30 עד 60 דק '6, 7, 10, 13, 14, ולאחר מכן תקופה של reperfusion מ 60 דק' 7 כדי 24 שעות, 9, 10, 13, 14 מותר. האונות לרוחב ו החציוני השמאלי של הכבד עכברוש מהווים כ 70% של parenchyma הכבד 9. פרוטוקולים מסוימים שנועדו ללמוד נפשי מראש איסכמי כוללים הידוק לסירוגין של כלי hilarאו לפני-הגפיים האחוריים כדי לתקופה ארוכה של איסכמיה הנגרמת על ידי כיווץ כלי hilar 9, 13. ישנם גם מספר שינויים המתוארים בספרות. הראשון הוא מהדק הוריד הפורטלי ו עורק הכבד לספק את האונות לרוחב ו חציון שמאל, אבל להוציא את צינור המרה 15. שינוי שני הוא לגרום איסכמיה כבד הכולל על ידי כיווץ וריד הפורטלי, עורק כבד והמרת הצינור לפני חלוקתם 16, 17, 18, 19, 20. שינוי שלישי כולל הידוק של כלי hilar אל האונה הימנית במשך 30 עד 60 דקות 8. שינוי של תוספת כרוכה מהדק את הצרור וסקולרית איבר אחד אחורי כדי לגרום לפגיעה בכבד 13, 21 . גישות שונות כדי ההליך מהדק hilar הם באיור 1A-D.

עכברוש הכבד שימשו מודלים מהדק hilar ללמוד את ההשפעה של מולקולות ותרכובות שונות על שאני בכבד / R. בהתאם המודל המשמשים מולקולות אלה הועברו באמצעות אינהלציה 11, עירוי אפידורל 12, הזרקת intraperitoneal 17, 18, 21, 22, עירוי לוריד 10, 14, 15, 19, 23, 24 או הזרקה לוריד mesenteric המעולה ההיקפי 8 .

המודל עבור מהדק hilar כבד עכברוש המפורט includ דוח זהes cannulation הישירה של אספקת הפורטל למגזר איסכמי באמצעות סניף צד של וריד השער (איור 2), אשר מאפשרת למסירת כבד מגזרית ישירה של החומר התרופתי נחקר. הגישה שלנו היא לגרום איסכמיה באונות לרוחב ו חציון שמאל 60 דקות, במהלכן עירוי של חומר תחת מחקר, במקרה זה, PEGylated-דיסמוטאז סופראוקסיד, נבלות רדיקלים חופשיים 25, הוא החדיר ישירות בקטע איסכמי . דגימות דם נלקחו לפני אינדוקציה של איסכמיה ובבית 120 דק-רה-פרפוזיה פוסט. בשלב זה, העכברוש הוא הקריב ודגימות לקוחים מתוך אונות שמאל החציוני. בנוסף, דגימות נלקחות מהאונה הימנית כדי לשמש בקרה פנימית.

ישנם יתרונות רבים לגישה זו. בראש ובראשונה, כאשר המהות התרופתית תחת מחקר ניתן להזריק ישירות בקטע איסכמי O את הנפחהפצת F היא נמוכה למדי בהשוואה להיקף ההפצה של הזרקה לתוך המחזור המערכתי או חלל הצפק. בנוסף, גישה זו מפחיתה, אם כי אינו מבטל, את האפשרות של תופעות לוואי מערכתיות.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים במדריך המועצה הלאומית למחקר עבור טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה (IACUC) ו עברה לאישור הוועדה IACUC באוניברסיטת אוהיו.

1. הגדרה ראשונה

  1. הגדרת מיקרוסקופ הכירורגים ותיאטרון ההפעלה (איור 3, איור 4). הפעל את כל הציוד כולל שעבור שמירת הרדמה וניטור סימנים חיוניים. הפעלת לוח היחידה והתחממות electrosurgical. מקמו את משאבת אינפוזיה ליד שולחן הניתוחים.
    1. צייר את 10 מיליליטר של isoflurane נוזלי משאיפת (משקל מולקולרי 184.5) בתוך מזרק ההרדמה ולמקם אותו ביחידת ההרדמה.
    2. הגדרה מיכל מיליליטר 200 של חנקן נוזלי ליד שולחן הניתוחים ועוד ליד צנטריפוגה שבו דגימות דם תעובדנה.
    3. Position מכשירי ניתוח, 4-0 ו 7-0 תפר משי קלוע, צמר גפן סטרילי, 4x4 ספוגים הלא ארוגים, 5 מזרקים מ"ל, ו- 27 מזרקים מד אינסולין ליד שולחן הניתוחים.
  2. להכין את חדר isoflurane ולהבטיח כי isoflurane מספיק מוטמע במערכת מסירת אינדוקצית הרדמה.

אינדוקציה 2. הרדמה

  1. לפני טיפול העכברוש לשים על הציוד אישי המגן הבא (PPE): מסכת מנתחים, כפפות מנתחים, ואת שמלת הפנויה.
  2. לשקול את העכברוש ולהקליט את המשקל.
    הערה: חולדות ספראג Dawley צריכות לשמש.
  3. מניחים את החולדה בתא הרדמה ולהדליק את isoflurane ואת החמצן. להשרות הרדמה באמצעות תא isoflurane.
  4. קליפ שיער הבטן של החיה באמצעות גוזז שיער חשמלי כדי לאפשר חשיפה מנקה (איור 5).
  5. מניחים את הגב חיה בתא isoflurane עבור additioדקה אחת סופית. בצע קמצוץ הבוהן לאמת עומק ההרדמה.

נוהל 3.

  1. מקם את העכברוש עם האף של בעלי חי חרטומו והארבעה בגפיים משותקים עם ריסון או קלטת על כרית החימום.
  2. המשך הרדמה באמצעות מערכת המסירה הרדמה, חרוט האף isoflurane עם הרדמה ב 3.6% לבעלי חיים במשקל בין 200 לבין 250 גרם ו 4% עבור חיות במשקל העולה על 250 גרם. אשר עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן קמצוץ העור.
  3. ביצוע חתך בבטן קו אמצע מן החיק אל xiphoid דרך העור באמצעות מספריים חדים (איור 6).
  4. עושים חתך הצפק לאורך linea alba מן חיק אל xiphoid והזן את טירחתו הבטן שלא לפגוע שלפוחית ​​השתן או המעי. כמו הכבד גם מקלות הצפק anteriorly סמוך תהליך xiphoid, לוודא שהוא משחרר לפני חריטת דופן הבטן ב ar זהEA.
  5. ביצוע חתך רוחבי דרך העור הצפק ברמה של מעבר לגבול התחתון של האונה הימנית של הכבד.
  6. סובב את הרדמה עד 1.6% לבעלי חיים במשקל בין 200 לבין 250 גרם ו 2% לבעלי חיים במשקל העולה על 250 גרם.
  7. לחזור בו תהליך xiphoid באמצעות מהדק יתושים מעוקל.
  8. כתיבה צלע מקום המשייך הצלעות רחוקות ככל האפשר מן קו האמצע (איור 7). חותך את falciform, הסרעפת ורצועות קיבה. Flip הכבד של דבר באמצעות צמר גפן סטרילי טבול.
  9. חותכים רצועות נוספות ככל שיידרש כדי לקבל גישה פורטה. בצע סיבוב קרבי עם גזה טבולה מלוח (איור 7).
  10. הסר את רקמת חיבור הרופפת שמעל hilum הפורטל באמצעות לנתיחה חדה או קהה. הסר את רקמת חיבור רופף שמעל אורך הוריד הפורטלי.
  11. שימוש במלקחיים כדי לדחוף דרך t רופף חיבורposterior הנושא אל הוריד הפורטלי השמאלי, העורק צינור המרה שהופך חלון ולמקם תפר 4-0 פוטס אבל לא להדק למטה (איור 8).
  12. לנקות את רקמת חיבור הרופפת שמעל הסניף האחורי אל הווריד הפורטלי שמגיע בכ ברמה של הכליות התקינות. וריד זה ישמש עבור cannulation.
  13. צייר 0.5 מיליליטר של דם מתוך הווריד הנבוב הנח (IVC) עם מזרק אינסולין (איור 9). מניחים את 0.5 מ"ל של דם בתוך בקבוקון קטן, צנטריפוגות ב 135 XG במשך 12 דקות. ניסיון לצייר את בסרום.
    1. אם קו ברור שלא ניתן להערכה בין תאי דם אדומים בדם, לנסות צנטריפוגות במשך תוספת 2 - דקות 3 ב 135 גרם x. צייר את סרום ומכניסים בקבוקון עבור אלאנין-aminotransferase (ALT). הצמד להקפיא את הממצא הזה, על ידי הצבת אותו ישירות לתוך חנקן נוזלי.
  14. חותכים שתי חתיכות של 7-0 תפר ומקום ליד וריד אשר ישמשו עבור צינוריתtion. מניחים את הלולאה 7-0 בסיבוב הראשון ברוח זו ככל המדיאלי ככל האפשר. לקשור לולאה זה ולהשתמש בו כדי לחזור באמצעות מהדק יתושים מעוגל (איור 10). מניח לולאה שנייה 7-0 על הווריד אשר ישמש עבור cannulation ליד הצומת שלה עם הווריד הפורטלי ולמקם עניבה אחת, אבל לא להדק למטה.
  15. הכן את משאבת עירוי עם מזרק 5 מ"ל עם 3 מ"ל של ריאגנט. צינורות הממשלה.
  16. הצמד הוריד הפורטלי דיסטלי באמצעות מהדק מיקרו.
    הערה: זה יקטין דימום כאשר הווריד הוא חרות על cannulation.
  17. חותכים חור 0.5 מ"מ בתוך הווריד בין תפר 7-0 השהות לצומת שלה עם הוריד הפורטלי באמצעות מספריים מיקרו קטן. השתמש 27-0 קטטר cannulate את וריד השער השמאלי (איור 11, איור 12). הכנס את קטטר בעבר ההסתעפות של ורידי פורטל על ימין ועל שמאל.
  18. בדוק את המיקום של הצינורית ידי infusing 1 מיליליטר של תמיסת מלח רגיל ולצפות עבור האונות לרוחב ו החציוני השמאלי של הכבד מחוויר. ידנית לאשר קטטר כי הוא עבר את ההמראה של הוריד הפורטלי תקין, אך לא מעבר ההמראה של הוריד הפורטלי להאכיל את האונה חציון.
  19. להדק את תפר פוטס ולהתחיל זמן איסכמיה. הדק 7-0 תפר סביב וריד 27-0 קטטר כדי להחזיקו במקום ולהסיר את המהדק דרך וריד שער דיסטלי.
  20. התחל עירוי של סופראוקסיד דיסמוטאז גליקול-פוליאתילן (PEG-SOD, 0.00067 גרם / מ"ל) באמצעות משאבת אינפוזיה. התחל עירוי קרוב ככל האפשר אל תחילת זמן איסכמי.

.4 ניטור

  1. המשך לעקוב אחר הסימנים החיוניים של החיה לאורך העירוי. לספק 2 מ"ל של סליין 0.9% נורמלי או 2 מ"ל של SOD PEG (0.00067 גרם / מ"ל) מומס מלוחים 0.9% נורמלי על פני תקופה של 15 דק '.

Reperfusion 5.

  1. אפשר שעה אחת כדי לעבור מההתחלה של iזמן schemic. זהו 1-h של זמן איסכמיה חמה.
  2. הסר את תפר פוטס. הסר את הקטטר 27-0. להדק את תפר 7-0 סביב הווריד. הערת הזמן. זו הפעם של רה-פרפוזיה.

6. דגימת המשך

  1. צייר 0.5 מ"ל של דם מתוך IVC ב 120 דקות-רה-פרפוזיה פוסט. צייר את הדם באיטיות כדי למנוע lysing תאי דם אדומים. לאט לאט לטפטף את הדם לתוך בקבוקון. ודא כי דימום מן IVC נשלט לאחר כל לקיחת דם.
    1. אם יש דימום המשיך להפעיל לחץ עדין עם מקלון צמר גפן סטרילי או 1 ס"מ קטן על ידי קיצוץ בסעיף 1 ס"מ מן גזה.
  2. צנטריפוגה ב 135 XG במשך 12 דקות. אם ההפרדה מספיק אינה מושגת, לנסות תוספת 2 - דקות 3 ב 135 גרם x.
  3. מניחים מחצית בסרום בבקבוקון לעיבוד מאוחר עבור ALT. הצמד להקפיא דגימות אלה.

7. המתת חסד

  1. בעוד החולדה היא עדיין מורדם לחתוך את IVC ו- Superior הווריד הנבוב (SVC) ולנטר עד זרימת הדם, הנשימה הפסקת פעימות הלב.
  2. לחתוך את הסרעפת ולבצע כריתה קצרה על ידי חריטת הסרעפת במעגל חריטת רקמת חיבור נוספת שנשארת חיבור הכבד אל חלל הצפק. הסר את הכבד מן חלל הצפק.
  3. קח ארבע דגימות מן אונות שמאל החציוני של הכבד וארבע דגימות מהאונה הימנית של הכבד. הדגימות צריכות להיות גדולות ככל האפשר וגודלם יהיה מוגבל רק על ידי כמות רקמת כבד זמינה. מניח אלה בצלוחיות קטנות, שכותרתו, ולהצמיד הקפאה של החנקן הנוזלי. השתמש אלה לעיבוד מאוחר יותר אדנוזין אדנוזין רקמות (ADP), malondialdehyde (מד"א) ו גלוטתיון (GSH).

8. שאחרי ניסוי ניתוח

  1. לקבוע גלוטתיון (GSH), malondialdehyde (מד"א) ו aminotransferase אלאנין (ALT) פעילויות ברקמת הכבד דגימות סרום באמצעות ערכות אבחוןעל פי הוראות היצרן.
  2. Homogenize רקמת הכבד עם חיץ תמוגה ולכמת באמצעות assay ברדפורד. לנתח lysate רקמות ידי ג'ל אלקטרופורזה סולפט polyacrylamide dodecyl נתרן immunoblot באמצעות נוגדנים נגד capase-3 ביקע אקטין. לכמת כתמים מערביים בצעו עם תוכנה זמינה לציבור.

תוצאות

ניסוי זה בוצע עם 2 קבוצות של n = 3 חולדות בכל. שלושה כבדי עכברוש הוזרקו 2 מ"ל של תמיסת מלח רגיל (NS) עם משאבת אינפוזיה פני תקופה של 15 דק '. שלושה כבדי עכברוש הוזרקו 2 מ"ל של תמיסת מלח רגיל (NS) מעורבב עם PEGylated-דיסמוטאז סופראוקסיד (PEG-SOD, 0.00067 גרם / מ"ל) עם משאבת אינפוזיה פני תקופה של 15 דק '. כפי שתואר בפרוטוקול לעיל, דגימות דם נלקחו מהדק טרום hilar ובבית 120 דק 'פוסט-רה-פרפוזיה. בנוסף, לאחר השלים 120-דק של דגימות רקמת כבד reperfusion ארבעה נלקחו משמאל אונות חציון וארבע דגימות כבדות נלקחו מהאונה הימנית של כבד העכברוש.

סרום אלאנין אמינוטרנספראז (ALT) נמדדה מהדק טרום hilar ובבית 120-דק-רה-פרפוזיה פוסט בשליטה (NS) וניסיוני (PEG-SOD) חיות. היה הבדל משמעותי בין רמת ALT שליטה (NS)חיות מראש hilar מהדק ב 120 דק 'פוסט-רה-פרפוזיה. היה הבדל משמעותי בין רמת ALT שליטה (NS) ובעלי חיים ניסיוניים (PEG-SOD) ב 120 דק '(איור 13A). malonaldehyde רקמות (מד"א) נמדד על שליטה (NS) וניסיוני (PEG-SOD) חיות הן אונות ימין ושמאל של הכבד. רקמות מד"א (מהדק הלא hilar) תקין האונה עם הזרקה מלאה (NS) ו הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) להפגין שום הבדל משמעותי. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) רקמת מד"א עם הזרקה מלאה (NS) שונה משמעותית מ האונה הימנית (מהדק הלא hilar) p <0.001. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) יש רמות שונות משמעותית של רקמת מד"א עם הזרקה מלאה (NS) לעומת הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) p <0.005 (איור 13 ב). גלוטתיון רקמות (GSH) נמדד ו גלוטתיון רקמת אונה ימנית (מהדק הלא hilar) עם הזרקה מלאה (NS) אnd הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) להפגין שום הבדל משמעותי. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) רקמת GSH עם הזרקה מלאה (NS) שונה משמעותית מ האונה הימנית (מהדק הלא hilar) עם הזרקת מלאה (NS) p <0.05. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) יש רמות שונות משמעותית של גלוטתיון רקמה עם הזרקה מלאה (NS) לעומת הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) p <0.005 (13C איור). כתם מערבי בוצע השוואת אונה של חיות בקרת ימין ושמאל ומדגים בקע גדל caspase-3 באונה השמאלית לאחר מהדק hilar ו reperfusion (איור 13D). כתם מערבי שני בוצע השוואה בין אונות שמאל של חיות שטופלו מלא עם PEG-SOD (האיור 13E). זה מדגים ירד caspase-3 בקע ברקמת הכבד של חיות שטופלו PEG-SOD. צפיפות גם בוצעה demonstraטינג שרמת caspase-3 בקע ברקמת כבד גדל משמעותי שמאל לעומת אונה ימנית של חיות מלאות (איור 13F). בהשוואת רקמת כבד האונה השמאלית של חיות ניסוי, חדורי PEG-SOD, ואת רקמת כבד האונה השמאלית של חיות מלאות, חדורים רגילים מלוח, צפיפות מדגימה באופן משמעותי ירד caspase-3 בקע בחיות שטופלו PEG-SOD בהשוואה לבעלי חיים מטופלים עם שליטה (איור 13G).

figure-results-2939
איור 1: איורים אנטומיים. איור אנטומי א של כבד העכברוש. איור אנטומי B. של כבד העכברוש. Pedicle הפורטל אל אונות שמאל החציוני של הכבד הוא הדק. אונות שמאל החציוני הן איסכמי. ג אנטומיאיור של כבד העכברוש. Pedicle הפורטל לאונה השמאלית הוא הדק. האונה השמאלית היא איסכמי. איור אנטומי ד של כבד העכברוש. Pedicle פורטל אל האונה הימנית הוא הידק את האונה הימנית היא איסכמי.

figure-results-3589
איור 2: איורים אנטומיים. איור אנטומי של כבד העכברוש עם פורטל cannulated וריד דרך סניף בצד. Pedicle הפורטל אל אונות שמאל החציוני של הכבד מוקף תפר ו מלחציים microvessel שמש להדק סביב צרור וסקולרית. אונות שמאל החציוני הן איסכמי.

figure-results-4037
איור 3: Instrument קמה. נתון זה ממחיש ה מכשיר אלקטרוני הגדרה.

figure-results-4327
איור 4: הפעלת חדר Set-up. נתון זה ממחיש את חדר ניתוח ההגדרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4758
איור 5: קיצוץ של בטן שיער. נתון זה ממחיש את הזמירה של שיער הבטן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עומס / 54,729 / 54729fig6.jpg"/>
איור 6: קיבוע ו חתך בעור. נתון זה ממחיש את חוסר התנועה של העכברוש ואת החתך בעור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5597
איור 7: צלעות מפשקות שמת הוצאת הקרביים. נתון זה ממחיש את מיקום מפשק צלעות הוצאת הקרביים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6056
איור 8: מקום ment של תפרים. נתון זה ממחיש את המיקום של התפר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6494
איור 9: להקיז דם מן הווריד הנבוב הנחה. נתון זה ממחיש לקיחת דם מן הווריד הנבוב הנח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6947
איור 10: וריד הסניף ומחוזק ו בוטל. נתון זה ממחיש וריד סניף ומחוזק ו חזר בו. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7393
איור 11: תהליך של Cannulation. נתון זה ממחיש את תהליך cannulation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7833
איור 12: Cannulation. נתון זה ממחיש את cannulation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוכן" FO: keep-together.within-page = "1"> figure-results-8204
איור 13: תוצאות נציג: ישיר המגזרי intrahepatic משלוח PEGylated-Superoxide Dismutase באמצעות מודל קלאמפ עכברוש hilar. NS = מלח רגיל. PEG-SOD = PEGylated-דיסמוטאז סופראוקסיד, ALT = aminotransferase אלאנין, מד"א = malondialdehyde. א סרום אלאנין אמינוטרנספראז (ALT, mU / מ"ל) בהשוואה בין מהדק טרום hilar ו 120-דק-רה-פרפוזיה פוסט. יש הבדל משמעותי בין הביקורת (NS) טרום hilar מהדק ובקרה (NS) ב 120 דק 'פוסט-רה-פרפוזיה (p <0.001). יש גם הבדל משמעותי בין הביקורת (NS) וקבוצות ניסיון (PEG-SOD) ב 120 הדקה 'פוסט-רה-פרפוזיה (p <0.05). מבחן t של סטודנט שמש. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. ב malondialdehyde רקמות ב אונה ימנית (מהדק הלא hilar) עם הזרקה מלאה (NS) עלהזרקת ניסיוני ד (PEG-SOD) להפגין שום הבדל משמעותי. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) malondialdehyde רקמה עם הזרקה מלאה (NS) שונה משמעותית מ האונה הימנית (לא hilar מהדק) p <0.001. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) יש רמות שונות משמעותית של malonaldehyde רקמה עם הזרקה מלאה (NS) לעומת הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) p <0.005. מבחן t של סטודנט שמש. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. גלוטתיון רקמות ג ב אונה ימנית (מהדק הלא hilar) עם הזרקה מלאה (NS) ו הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) להפגין שום הבדל משמעותי. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) גלוטתיון רקמה עם הזרקה מלאה (NS) שונה משמעותית מ האונה הימנית (מהדק הלא hilar) עם הזרקת מלאה (NS) p <0.05. האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) יש רמות שונות משמעותית של גלוטתיון רקמה עם שליטה Injection (NS) לעומת הזרקת ניסיוני (PEG-SOD) p <0.005. מבחן t של סטודנט שמש. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. ד כתם המערבי הוכחה מוגברת caspase-3 בקע ברקמת כבד של האונה השמאלית (פוסט-hilar מהדק ו reperfusion) לעומת האונה הימנית (מהדק הלא hilar) של חיות מלאות (רגיל המלוחה). הוכחת כתם א המערבי ירד caspase-3 ביקע ברקמת הכבד של חיות שטופלו PEG-SOD בהשוואה חיות שטופלו שליטה (מלח רגיל). פ רמת caspase-3 בקע ברקמת כבד גדלה באופן משמעותי מהדק שלאחר hilar ו reperfusion חיות (p <0.05). מבחן t של סטודנט שמש. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. ג בהשוואת רקמת כבד האונה שמאלית של חיות ניסוי (רווי PEG-SOD) ואת רקמת כבד באונה השמאלית של חיות מלאות (רווי רגיל מלוח), יש באופן משמעותי ירד caspase-3 בקע בביתimals שטופל PEG-SOD בהשוואת חיות שטופלו שליטה (מלח רגיל). מבחן t של סטודנט שמש. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

Discussion

סדרת ניסויים זו הוכיחה כי הזרקה של PEG-SOD לתוך שמאל האונות חציון הוביל לירידה משמעותית ברמת שחרורו של ALT, חמצון השומנים של קרום התא (מד"א), ותחזוקה של גלוטתיון (GSH) בהשוואה לקבוצת הביקורת (מלח רגיל ). הטרנסאמינזות כבד רקמות כולל אלאנין אמינוטרנספראז (ALT) מבוססים סמנים של פציעה hepatocellular. ירידת ALT כאשר האונה השמאלית מוזרקת עם PEG-SOD מצביעה על אפקט מגן של PEG-SOD. רקמה מוגברת מד"א מציין גדל חמצון שומנים ונחשב סמן של עקה חמצונית פגיעות ברקמות. ייצור יתר של מיני חמצן תגובתי גורם לעלייה בייצור של מד"א 26. הירידה המשמעותית ברקמת מד"א אונות שמאל החציוני של החיה כאשר מוזרקת עם PEG-SOD מדגימה השפעה מגנה של PEG-SOD. זה עולה בקנה אחד עם ההבנה הנוכחית כי PEG-SOD ומגן על התאים מפני נזקנגרם על ידי מיני חמצן תגובתי קטינה באופן חלקי 27. בנוסף, בנוכחות של מינים חמצן תגובתי, דיסולפיד גלוטתיון מצטמצם גלוטתיון (GSH) 28. התחזוקה ב GSH באונות שמאל החציוני של הכבד מוזרק עם PEG-SOD מחזקת את אפקט מגן של PEG-SOD. בנוסף יוכח כי יש עליית caspase-3 בקע, תוצר של אפופטוזיס, ברקמת חשופים לפגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה. הירידה caspase-3 ביקע באונה השמאלית כאשר טופלו PEG-SOD עולה כי PEG-SOD מוביל לירידה אפופטוזיס.

סופראוקסיד Superoxide (SOD) הוא אנזים קריטי הרעלים של מיני חמצן תגובתי. האנזים מזרז את ההמרה של שני אניוני דיסמוטאז לתוך מי חמצן ומים. האנזים catalase אז ממיר מי חמצן למים וחמצן, השלים התהליך 25. זמן מחצית החיים שלSOD ילידי מוגבל השימוש בו דגמים ניסיוניים עד לפיתוח של סופראוקסיד דיסמוטאז גליקול-פוליאתילן מצומדות (PEG-SOD). נטייה של SOD כדי פוליאתילן גליקול מגבירה מחצית החיים שלו מ 6 דקות כדי 14 h. נגוין ואח '. הפגן יכולתה להקטין חמצון שומנים ב איסכמיה הכבד במודל חולדה, באמצעות משלוח מערכתי 29.

יש מגוון של שינויים פוטנציאליים של הטכניקה מפורטת כאן וכמה תוארו בעבר בספרות. בהתאם המולקולות לשמש המודל הועבר באמצעות אינהלציה 11, עירוי אפידורל 12, הזרקת intraperitoneal 17, 18, 21, 22, עירוי לוריד 10, 14, 15 , 19, 23, 24 או הזרקה לוריד mesenteric המעולה ההיקפי 8.

ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. החשוב ביותר הוא cannulation של וריד השער. יש להקפיד כי החור לחתוך בווריד אינו גדול מדי. הרקמה מאוד אלסטי והחור יגדיל בכוחות עצמה. מומלץ להתחיל על ידי חיתוך חור כי הוא 0.5 מ"מ עם מספריים מיקרו. הצינורית יכולה להיות מוזנת דרך החור באמצעות מכשיר, המאפשר גמישות רבה יותר מאשר אם מנסה לבצע חלק זה של ההליך ביד. בנוסף, בעוד בתחילה האכלת הצינורית, זה צריך להיות מכוון ישירות אל ההסתעפות של ורידי פורטל ימינה ושמאלה כדי למנוע תקיעת חור בקיר האחורי של הווריד. כאשר קצה הצינורית מגיע ההסתעפות, זה אז יכול להיות מוזן לתוך וריד השמאל ספציפיברית. לאחר הצינורית מוזן לתוך וריד הפורטלי השמאלי, המספק ומשמאל אונות חציון, מעמדה ניתן לאשר באופן ידני על ידי מרגיש את זה בתוך הווריד. המיקום שלו יכול גם להיות מאושר על ידי הזרקת כמות קטנה של מלח קר ולראות את ההשפעה הלבנה על המגזרים המסופקים של הכבד.

מודל מהדק הכבד hilar בחולדה מספק פלטפורמה לשחזור ויציבה עבור הוכחת פגיעה בכבד איסכמי-רה-פרפוזיה. מודלי מהדק hilar משתנים כבר בשימוש על ידי חוקרים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של אוקסידנטים אנטי ומולקולות קטנות אחרות 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. נקודות של וריאציה לכלול בה כלי הם מהדקים אד, אשר קטע מבוצעים איסכמי, או אם לא בצינור המרה נכלל ואת אורך תקופת reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. בנוסף, כאשר מודל זה משמש כדי ללמוד את ההשפעה של ממשל של מולקולת תוואי הממשל הוא גם הטרוגנית 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. ישנם מספר יתרונות הגישה המתוארת. ראשית, cannulation הישירה של אספקת הפורטל למגזר איסכמי מאפשרת למסירת כבד מגזרית ישירה של החומר התרופתי תחת מחקר. זה מאפשר ניצול של האונות השנייה של כבדי בקרה פנימית. שנית, cannulation כבד המגזרי מאפשר נפח פיזור מופחת עבור המולקולה הנלמדת. גישה זו ובכך מפחיתה את הסיכון של תופעות לוואי מערכתיות כמו החומר מוזרק ישירות בקטע הכבד של עניין. cannulation הישיר של המקטע הכבד מאפשר את החומר כדי להיות מועבר-איסכמיה מראש,-איסכמיה תוך או-איסכמיה פוסט. זה מאפשר לימוד של השפעת המולקולה בכל נקודה במחזור פציעת איסכמיה-רה-פרפוזיה. עם אורך מוגבר של זמן איסכמי ו רמה מוגברת של הזדמנות נוספת פציעה ללמוד התחדשות כבדה יהיה זמין.

ישנם גם מספר מגבלות של גישה זו. הראשון הוא עלות הזנק. הרכישה של מיקרוסקופ כירורגי יכול להיות עלות הזנק משמעותי עבור מעבדה שאינה כבר מחזיק אחד. טכניקה זו עשויה להיות קשה או בלתי אפשרית ללא מיקרוסקופ. השני הוא ללמוד זמן עקום. למרות הליך זה הוא יחסית פשוט זה דורש קצת תרגול וסביר להניח כי טירון ידרוש מספר משמעותי של הליכים להיות מומחה.

לסיכום, מודל זה מאפשר פלטפורמה לשחזור, פשוט, וחסכוני ללמוד פציעת reperfusion-איסכמיה כבדה. למרות בפרוטוקול המתואר כאן פוליאתילן GLסופראוקסיד דיסמוטאז ycol-, נבלות רדיקלים חופשיים 25, היה חדור, מודל זה יכול לשמש כדי להשרות מגוון של חומרים תרופתיים שונים על מנת להעריך את השפעתם על פציעה I / R בכבד.

Disclosures

כל המחברים מדווחים שאין להם גילויים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות דניס מתיאס עבור עבודתו המחשה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32AI 106704-01A1 וקרן ט פלש להשתלת איברים, זלוף, הנדסה והתחדשות באוניברסיטת אוהיו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc. 200- 250 grams 
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5 Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacan MV-7A
Warming PadBraintree Scientific HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuiteKent Scientific PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber Kent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
Oxygen Praxair98015
27-0 Micro-CannulaBraintree Scientific MC-28
Rib retractors Kent Scientific INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD)Sigma Aldrich S9549 SIGMA
GenieTouchKent Scientific
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges Criterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5 mL SyringeBD REF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex Medical REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific 1418-7410
Microsurgical Instruments
NameCompany Catalog NumberComments
Small Scissors Roboz RS-5610
Large ScissorsS&T SAA-15
Forceps - Large AngledS&T JFCL-7
Forceps - Small Angled S&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight Tip S&T FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Other Instruments
NameCompany Catalog NumberComments
Small Mosquito ClampsGeneric 
Analysis 
NameCompany Catalog NumberComments
Alannine aminotransferase (ALT) assay BiovisionK752-100
Malondialdehye (MDA) assay Abcam ab118970
Glutathione (GSH) assayCayman Chemical7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin Cell Signaling TecnologyAntibody 9661
ImageJ Software National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer Millipore10-188

References

  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. . Overall by Organ. Current US Waiting List. , (2016).
  5. OPTN. . Transplants in the US by Recipient ABO. , (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431 (2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122hilarPEG SODcannulation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved