JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Benzersiz bir sıçan karaciğer hilar kelepçe modeli iskemi-reperfüzyon zedelenmesinin iyileşmesi farmakolojik moleküllerin etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu model, doğrudan karaciğer taşınmasına izin veren, portal damar dalı ile iskemik karaciğer segment portal kaynağının doğrudan kanül içerir.

Özet

akış oklüzyonu ve karaciğer transplantasyonu ile başlıca karaciğer cerrahi, sıcak bir iskemi sürecini ve iskemi / reperfüzyon (I / R) sayısız olumsuz sonuçlarla birlikte yaralanmaya yol açan bir reperfüzyon dönemi gerektirmektedir. karaciğer transplantasyonu için tahsis marjinal organların potansiyel I / R hasarına azalma organı kullanım oranı ikincil akım donor açığı katkıda bulunur. Önemli bir ihtiyaç transplantasyon greft fonksiyonu üzerindeki etkisini aracılık etmek üzere hepatik I / R yaralanması keşfetmek için mevcuttur. Fare karaciğer hilar kelepçe modelleri hepatik I / R hasarına olan farklı moleküllerin etkisini araştırmak için kullanılır. modeline bağlı olarak, bu moleküller periferal üst mezenterik damar içine inhalasyon, epidural yoldan, intraperitoneal enjeksiyon, damar içi uygulama ya da enjeksiyon ile teslim edilmiştir. Bir fare karaciğeri hilar kelepçe modeli, I / R zedelenmesinin iyileşmesi farmakolojik moleküllerin etkilerini inceleyen kullanım için geliştirilmiştir. describSıçan karaciğeri hilar kelepçesi için ed modeli, doğrudan segmental karaciğer taşınmasına izin veren, portal damar yan dal ile iskemik karaciğer segmente portal kaynağının doğrudan kanül içerir. Yaklaşımımız çalışmanın altında madde infüze edilir ve bu süre içinde 60 dakika, sol yanal ve medyan loblarda iskemi başlatmaktır. Bu durumda, pegile-süperoksit dismutaz (PEG-SOD), bir serbest radikal toplayıcısı, iskemik kesimi doğrudan infüze edilir. Bu deney serisi, PEG-SOD infüzyonu hepatik I / R hasarına karşı koruyucu olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı, sistemik yan etkiler dağıtım ve redüksiyon hacmi azalmayla birlikte iskemik segmentine molekülün doğrudan enjeksiyonu bulunmaktadır.

Giriş

Akış oklüzyonu ve karaciğer transplantasyonu ile başlıca karaciğer cerrahi, sıcak bir iskemi sürecini ve iskemi / reperfüzyon (I / R) yaralanmasında 1 giden bir reperfüzyon dönemi gerektirmektedir. Karaciğerde I / R yaralanma sonuçları yoğun 1, 2, 3 detaylandırılmıştır. I sonuçları / literatürde ayrıntılı R zedelenmesi, reaktif oksijen türlerinin üretimi, nötrofil aktivasyonu, Kupffer hücrelerinde ve endotelial hücreler, Toll benzeri reseptör heme oksijenaz sisteminin aktivasyonu ve aktivasyonu, bir de dahil olmak üzere enflamatuar kaskadın başlatma endotelin ve nitrik oksit, nükleer faktör-KB'nin aktivasyonu ve proenflamatuar sitokin ve adezyon molekülü sentezi 1, 2, 3 iyileştirilmesi arasındaki dengesizlik. Bunlar proinflamatuar olaylar l mayapoptoz, nekroz, organ yetmezliği ve nihai organ yetmezliği 3 EAD.

I / karaciğer transplantasyonu için tahsis organlarda R hasarına erken greft kaybına yol ve marjinal organları yaralanma 3 daha duyarlı olarak mevcut donor açığı katkıda olabilir. 2015 5'de yapıldı ABD'de 4 karaciğer nakli bekleyen listesindeki 15.226 potansiyel alıcılar ve sadece 5950 karaciğer nakli şu anda vardır. Nedeniyle verici organ bu uç sınırlama, araştırma hepatik I / R hasarına aşı fonksiyonu ve organ kullanımını optimize etmek için gerekli olan keşfetmek.

hepatik I / R hasarı çalışma için kullanılan hayvan modelleri sıçan hilar kelepçe modelleri ve fare karaciğer nakli modellerini içerir. Şu anda kullanımda olan sıçan hilar kelepçe modelleri çeşitli vardır. En yaygın birdir portal ven, hepatik arter ve safra duct sol yanal ve orta loblar mikro klipleri 6, 7, 8, 9, 10, 11, 60 min reperfüzyon sonra 30 dakika ila 6, 7, 10, 13, 14 ve 60 bir süre için 12 ile kenetlenir tedarik h 7, 9, 10, 13 ila 24, 14 sağlanır. Sıçan karaciğerin sol yanal ve orta loblar karaciğer parankimi 9 yaklaşık% 70 içermektedir. iskemik ön şartlandırma incelemek için dizayn Bazı protokoller, hilar damarlarının aralıklı sıkıştırma içerirveya hilar damarları 9, 13 kıstırma neden olduğu iskemi daha uzun bir süre için, arka bacak önce. literatürde tarif edilen çeşitli modifikasyonlar da vardır. İlk sol yanal ve medyan lobu besleyen portal ven ve hepatik arter kelepçe, ancak safra kanalı 15 hariç tutmaktır. İkinci bir modifikasyon öncesinde bölme 16, 17, 18, 19, 20 portal ven, hepatik arter ve safra kanalı sıkma toplam hepatik iskemi indüklenmesidir. Üçüncü bir modifikasyon 30-60 dakika 8 doğru loba hilar damarların sıkıştırma içerir. Ek bir modifikasyon, 21 karaciğer 13'te hasara yol için bir arka bacak vasküler demeti sıkıştırma kapsar . Hilar kelepçe prosedüre çeşitli yaklaşımlar Şekil 1A-D 'de gösterilmiştir.

Fare karaciğer hilar kelepçe modelleri hepatik I / R farklı moleküller ve bileşiklerin etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Periferik üst mezenterik ven 8 içine inhalasyon 11 epidural infüzyon 12, intraperitoneal enjeksiyon 17, 18, 21, 22, intravenöz uygulama, 10, 14, 15, 19, 23, 24 ya da enjeksiyon ile teslim edilmiştir, bu moleküllerin modeline kullanılan olarak .

Bu rapor includ ayrıntılı fare karaciğeri hilar kelepçe modeliçalışılan farmakolojik maddenin direk segmental hepatik uygulama sağlar portal ven yan dal ile iskemik segmenti portal kaynağı (Şekil 2), doğrudan kanül es. Yaklaşımımız Bu durumda incelenen maddenin bir enfüzyonu pegile-süperoksit dismutaz, bir serbest radikal toplayıcı 25, iskemik kesimi doğrudan infüze edilir ve bu süre içinde, 60 dakika boyunca, sol yanal ve orta loblarda iskemi indükleme olan . Kan numuneleri, iskemiden önce indüklenmesine ve 120 dakika sonrası reperfüzyon alınır. Bu noktada, sıçan öldürülür ve numuneler, sol ve orta lobundan alınır. Ayrıca, numuneler bir iç kontrol olarak hizmet etmek sağ lob alınır.

Bu yaklaşıma sayısız avantajı vardır. İlk ve en önemlisi, incelenen farmakolojik madde ile doğrudan iskemik kesimi içine enjekte edilebilir hacmaf dağılımı sistemik dolaşım içine enjeksiyon hacim dağılımı ya da periton boşluğuna karşılaştırıldığında oldukça düşüktür. Buna ek olarak, bu yaklaşım azaltır, sistemik yan etkiler olasılığını ortadan kaldırmak olmasa da.

Protokol

Tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı (IACUC) için Ulusal Araştırma Konseyi'nin Kılavuz kurallarına göre yapılmıştır ve Ohio State Üniversitesi IACUC komitesi tarafından onaylanması uğramıştır.

1. İlk Kurulum

  1. Ayar cerrahi mikroskop ve ameliyat odasına (Şekil 3, Şekil 4). anestezi bakımı ve yaşamsal sinyalleri izlemek için de dahil tüm ekipman açın. elektro ünitesi ve elektrikli battaniyeden açın. ameliyat masasına yakın infüzyon pompası yerleştirin.
    1. Anestezi şırınga inhalasyon (molekül ağırlığı 184.5) için, sıvı izofluran 10 mL hazırlayın ve anestezi birimi içine yerleştirin.
    2. Ayar kan örnekleri işlenecek santrifüj yakın bir 200 mL çalışma masasının yakınında sıvı azot kabı ve bir.
    3. Sıracerrahi aletler, 4-0 ve 7-0 örgülü ipek dikiş steril pamuklu çubuk, 4x4 dokunmamış süngerler, 5 ml şırıngalar ve ameliyat masasına yakınındaki 27 gauge insülin şırıngası yerleştirme.
  2. izofluran odası hazırlamak ve yeterli izofluran anestezi indüksiyon iletim sisteminde damlatılır emin olun.

Anestezinin 2. İndüksiyon

  1. Aşağıdaki kişisel koruyucu donanımlar (PPE) koymak sıçan sevkinden önce: Cerrahi maske, cerrahi eldiven ve tek kullanımlık önlük.
  2. sıçan tartılır ve ağırlığı kaydedilir.
    NOT: Sprague Dawley sıçan kullanılmalıdır.
  3. anestezi bölmesi sıçan yerleştirin ve izofluran ve oksijen açın. izofluran odacığı kullanılarak anestezi neden.
  4. Temizleyici karşılaşması (Şekil 5) sağlamak için elektrikli saç tokası kullanılarak hayvanın karın saçlarını Klip.
  5. Bir additio için izofluran odasında hayvan geri koyunnal bir dakika. Anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak parmağı tutam gerçekleştirin.

3. Prosedür

  1. hayvanın burun konisi burun ve ısınma pad üzerinde kısıtlamalar veya bantla hareketsiz dört ekstremite ile sıçan yerleştirin.
  2. den daha büyük 250 g ağırlığındaki hayvanlar için% 200 ve 250 g ve 4 ağırlığındaki hayvanlar için% 3,6 anestezi ile anestezi dağıtım sistemi, burun konisine ve izofluran ile anestezi devam edin. Bir ayak tutam ve cilt tutam yaparak anestezi derinliğini kontrol edin.
  3. Keskin bir makas (Şekil 6) kullanılarak deriden xiphoid pubis bir orta hat abdominal yarma olun.
  4. xiphoid ve mesane veya bağırsak zarar vermemeye karın özen göstererek girmek pubis linea alba boyunca karın zarı bir kesi olun. Karaciğer öne kılıç şeklinde bir süreç yakın periton sopa gibi, önce bu ar karın duvarı insizyonu için serbest bırakıldıktan sağlamakad.
  5. deri yoluyla enine kesi ve karaciğerin sağ lobunun alt sınırının düzeyinde periton olun.
  6. den daha büyük 250 g ağırlığındaki hayvanlar için% 200 ve 250 g ve 2 ağırlığındaki hayvanlar için% 1.6 anestezi aşağı doğru çevirin.
  7. eğimli bir sivrisinek kelepçe kullanılarak kılıç şeklinde işlemi geri çekin.
  8. Orta hat olarak birbirlerinden mümkün olduğunca uzak kaburga çekme yer yiv retraktör (Şekil 7). frenik falsiform ve mide bağlar kesin. nemlendirilmiş steril pamuk ile karaciğer yukarı kaldırın.
  9. porta erişmek için ek bağlar gerektiği kesin. Tuzlu çözelti ile nemlendirilmiş gazlı bez (Şekil 7) ile iç organ dönme gerçekleştirir.
  10. Keskin veya künt diseksiyon kullanılarak portalı hilusu örten gevşek bağ dokusu çıkarın. Portal ven uzunluğunu örten gevşek bağ dokusu çıkarın.
  11. gevşek bağ t ile itmek için forseps kullanınBir pencereyi yapma sol portal ven, arter ve safra kanalına konu posterior ve 4-0 Potts dikiş yerleştirmek ancak (Şekil 8) aşağı cinch yoktur.
  12. Sağ böbreğin yaklaşık düzeyinde gelir portal ven posterior dalı örten gevşek bağ dokusu kapalı temizleyin. Bu damar kanülasyon için kullanılacaktır.
  13. Bir insülin şırıngasına (Şekil 9) ile inferior vena cava (IVC) üzerinden kan 0.5 mL çizin. 12 dakika süre ile 135 x g'de, küçük bir şişe içinde santrifüj kan 0.5 mL yerleştirin. serum kendine çekmek için deneyin.
    1. 135 x g'de 3 dakika - bir tat çizgi kırmızı kan hücreleri ve serum arasında takdir edilemezse, fazladan bir 2 süreyle santrifüj deneyin. alanin-amınotransferaz (ALT) bir şişe içinde serum ve yerde kapalı çizin. Ek bileşen doğrudan sıvı azot içine yerleştirerek bu örnek dondurma.
  14. kanül için kullanılacak 7-0 dikiş ve ven yakın yerin iki parça kesinsiyon. bildiğim kadarıyla medial mümkün olduğunca bu damarın çevresinde ilk 7-0 döngü yerleştirin. Bu döngü bağla ve kavisli bir sivrisinek kelepçe (Şekil 10) kullanılarak geri çekmek için kullanabilir. Portal ven ile kesiştiği yakın kanülasyon için kullanılan ve bir kravat yerleştirin olacak ven üzerinde ikinci 7-0 döngü yerleştirin ancak aşağıya cinch yoktur.
  15. reaktif 3 mL olan 5 mL'lik bir şırınga ile infüzyon pompası hazırlayın. Başbakan boru.
  16. Bir mikrocerrahi kelepçe kullanarak uzak portal ven Kelepçe.
    NOT: ven kanülasyon için çizi olduğunda bu kanamayı azaltacaktır.
  17. 7-0 kalmak dikiş ve küçük mikro makas kullanılarak portal ven ile kesiştiği arasında ven 0.5 mm'lik bir delik açın. Sol portal ven sistemi (Şekil 11, Şekil 12) kanüle 27-0 kateter kullanın. Sol ve sağ portal damarların bifurkasyonu geçmiş kateter yerleştirin.
  18. Infus tarafından kanül yerleştirilmesini kontrolnormal tuzlu su içinde 1 mL ing ve ağartma, karaciğerin sol yanal ve orta loblar için dikkat edin. El ile bu kateter sağ portal ven Kalkış geçmiş, ancak medyan lobu besleyen portal ven kalkış ötesine onaylayın.
  19. Potts dikiş aşağı Cinch ve iskemi başlangıç ​​zamanı. ven etrafında 7-0 dikiş ve onu yerinde tutacak ve distal portal venden kelepçenin çıkartılması 27-0 kateteri sıkın.
  20. infüzyon pompası kullanılarak polietilen glikol-süperoksit dismutaz (PEG-SOD, 0.00067 gr / ml) infüzyonu başlatın. iskemik zamanın başlangıcına mümkün olduğunca yakın infüzyon başlatın.

4. İzleme

  1. infüzyon boyunca hayvanın yaşam belirtilerini izlemeye devam edin. % 0.9 normal serum fizyolojik 2 ml veya 15 dakikalık bir süre boyunca% 0.9 normal serum fizyolojik içinde eritilmiş, PEG-SOD 2 mL (0.00067 gr / ml) iletmek.

5. reperfüzyon

  1. bir saat i başlangıcından itibaren geçmesine izin verschemic saati. Bu sıcak iskemi zaman 1-h.
  2. Potts dikiş çıkarın. 27-0 kateteri çıkarın. ven etrafında 7-0 dikiş aşağı Cinch. zaman unutmayın. Bu reperfüzyon zamanını işaretler.

6. Devam Örnekleme

  1. 120 dakika sonra Reperfüzyonda IVC üzerinden kan 0.5 mL çizin. kırmızı kan hücrelerini parçalayan önlemek için yavaş yavaş kan çizin. Yavaş yavaş bir şişe içine kan damla. IVC kanama her kan alımından sonra kontrol emin olun.
    1. kanamayla devam edilirse, steril bir pamuk bez ya da gazlı bez 1 cm kesit kesik ile küçük bir 1 cm hafif bir basınç uygulanır.
  2. 12 dakika boyunca 135 x g'de santrifüjleyin. 135 x g 3 dakika - yeterli ayırma elde değilse, ek bir 2 deneyin.
  3. ALT sonraki işlemler için, bir şişe içinde, serum yarı yerleştirin. Çekin bu örnekleri dondurun.

7. Ötenazi

  1. Sıçan anestezi altında iken IVC ve s kesilmişUperior vena cava (SVC) ve kan akışı, solunum ve kalp atışları sona erene dek, monitör.
  2. diyafram insizyon ve bir daire şeklinde diyaframı insizyonu ve periton boşluğuna karaciğer bağlantı kalır ilave bağ dokusu incising kısa bir hepatektominin gerçekleştirin. periton boşluğundan karaciğeri çıkarın.
  3. Karaciğerin sağ lobunun gelen karaciğerin sol ve medyan lobu dört örnekleri ve dört örnekleri alın. Numuneler mümkün olduğu kadar büyük olması gerekmesine ve boyutları sadece karaciğer dokusunun miktarı ile sınırlı olacaktır. Küçük, etiketlenmiş şişelerde bu yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurularak ek. Doku adenozin trifosfat (ADP), malondialdehit (MDA) ve glutation (GSH) için daha sonra işlenmek için bu kullanım.

8. Sonrası deney Analizi

  1. kullanılan diyagnostik kitler kullanan glutatyon (GSH), malondialdehit (MDA) ve alanin aminotransferaz (ALT) karaciğer dokusunda aktivitelerini ve serum örnekleri belirlemeküreticinin talimatlarına göre.
  2. liziz tamponu ile karaciğer dokusu homojenize ve Bradford tahlili kullanılarak miktarı belirlenir. bölünmüş Capase-3 ve aktine karşı antikorlar kullanılarak, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ve immunoblotting doku lizat analiz edin. kamuya açık yazılım ile gerçekleştirilen batı lekelerinden niceliğini.

Sonuçlar

Bu deney, n 2 grup = 3 sıçan her biri ile gerçekleştirildi. Üç fare karaciğerleri, 15 dakikalık bir süre boyunca infüzyon pompası ile normal salin 2 mL (NS) enjekte edilmiştir. Üç fare karaciğerleri, 15 dakikalık bir süre boyunca infüzyon pompası ile pegile-süperoksit dismutaz (PEG-SOD, 0.00067 gr / ml) ile karıştırılmış, normal tuzlu su, 2 mL (NS) enjekte edilmiştir. Yukarıdaki protokol tarif edildiği gibi, kan örnekleri önceden hilar kelepçe ve 120 dakika sonra reperfüzyon alınmıştır. reperfüzyon dört karaciğer doku örneklerinde, 120 dakika tamamlanması sol ve orta bölge ve dört karaciğer örnekleri alınmıştır sonra ek olarak, sıçan karaciğer sağ lob alınmıştır.

Serum Alanin amino transferaz (ALT), önceden hilar kıskacı ve kontrol 120 dakika sonra reperfüzyon (NS) ve deneysel (PEG-SOD) hayvanlarda ölçülmüştür. kontrolün ALT düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu (NS)Hayvanlar ön hilar kelepçe ve 120 dakika sonra Reperfüzyonda. ALT kontrol düzeyi (NS) ve deney hayvanları (PEG-SOD) 120 dakika boyunca (Şekil 13A) ile arasında anlamlı bir fark yoktu. Doku Malondialdehit (MDA) kontrol (NS) ve deneysel (PEG-SOD), karaciğerin sağ ve sol lob hem de hayvanlar için ölçüldü. kontrol enjeksiyonu (NS) ve deneysel enjeksiyon (PEG-SOD) ile sağ lob (non-hilar kelepçe) Doku MDA anlamlı bir fark göstermektedir. kontrol enjeksiyonu ile sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) doku MDA (NS) sağ lob (non-hilar kelepçe) p <0.001 önemli ölçüde farklıdır. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) deney enjeksiyonu (PEG-SOD) p <0.005 (Şekil 13B) karşı kontrol enjeksiyonu (NS) doku MDA açısından ciddi farklılıklar vardır. Doku glutatyon (GSH) ölçülür ve kontrol enjeksiyonu (NS) a sahip doku glutatyon sağ lob (non-hilar kelepçe) içerisinde yapıldınd deneysel enjeksiyonu (PEG-SOD) anlamlı bir fark göstermektedir. kontrol enjeksiyonu ile sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) GSH (NS) kontrol enjeksiyonu (NS) p <0.05 ile sağ lob (non-hilar kelepçe) önemli ölçüde farklıdır. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) deney enjeksiyon (PEG-SOD) p <0.005 (Şekil 13C) karşı kontrol enjeksiyonu (NS) doku glutatyon açısından ciddi farklılıklar vardır. Batı benek kontrol hayvanların sağ ve sol lob karşılaştırılması yapılmış ve gösterir artan kaspaz-3, hilar kıskaç ve reperfüzyon (Şekil 13D) sonra sol lob yarılır. İkinci bir western blot kontrolü ile ve PEG-SOD (Şekil 13E) ile tedavi edilmiş hayvanların sol lobları karşılaştırılarak yapıldı. Bu, PEG-SOD ile tedavi edilmiş hayvanların karaciğer dokusunda bölünmüş kaspaz-3 azalma gösterir. Dansitometrisi da demonstra yapıldıklivaj kaspaz-3 karaciğer dokusunda seviyesi önemli ölçüde kontrol hayvanları (Şekil 13F) sağ lob karşı sol arttığını mmm. Normal Tuzlu su infüzyonu, PEG-SOD ile aşılanmış deney hayvanlarında sol lob karaciğer dokusu, ve kontrol hayvanlarına sol lob karaciğer dokusu, karşılaştırıldığında, dansitometre hayvanlara kıyasla, PEG-SOD ile tedavi edilen hayvanlarda bölünmüş kaspaz-3 azalma önemli ölçüde ortaya koyduğunu kontrol (Şekil 13G) ile muamele edilmiştir.

figure-results-3416
Şekil 1: Anatomik Çizimler. Sıçan karaciğer A. anatomik gösterimidir. Sıçan karaciğer B. anatomik gösterimidir. Karaciğerin sol ve medyan lobu portal pedikül kenetlenir. sol ve medyan lob iskemik bulunmaktadır. C anatomikSıçan karaciğer gösterimidir. Sol lob portal pedikül kenetlenir. sol lob iskemik. Sıçan karaciğer D. anatomik gösterimidir. Sağ lobun portal pedikül sıkıştırıldığı ve sağ lob iskemik olduğunu.

figure-results-4081
Şekil 2: anatomik Çizimler. portal sıçan karaciğer anatomik örnekleme damar yan dal ile kanüle edildi. Karaciğerin sol ve medyan lobu portal pedikül bir dikiş ile çevrilidir ve bir mikrodamar kelepçe damar demeti çevresinde sıkılaştırmak için kullanılmıştır. sol ve medyan lob iskemik bulunmaktadır.

figure-results-4564
Şekil 3: Enstrüman Kurulum. Bu rakam th gösteriyor E enstrüman set-up.

figure-results-4825
Şekil 4: Ameliyathane Kurulumu. Bu rakam ameliyathane kurulumu gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-5232
Şekil 5: Karın Saç kırpılması. Bu rakam karın saç kırpma göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

yük / 54729 / 54729fig6.jpg"/>
Şekil 6: immobilizasyon ve Cilt İnsizyonunun. Bu rakam sıçan ve cilt kesisi immobilizasyon göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-6029
Şekil 7: Kaburga Retraktör Yerleştirme ve Eviserasyon. Bu rakam kaburga retraktörü yerleştirme ve eviserasyon göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-6489
Şekil 8: bir yer Sütür olumlu yönde etkilemiştir. Bu rakam dikiş yerleşimini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-6922
Şekil 9: İnferior Vena Cava dan Kan Kurası. Bu rakam vena kava kan beraberlik göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-7350
Şekil 10: Ven Şubesi Kapalı bağladı ve geri çekildi. şube bağladı ve geri çekilmiş ven Bu rakam gösteriyor. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7800
Şekil 11: kanülasyon yöntem. Bu rakam Kanülasyonu sürecini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-8212
Şekil 12: kanülasyonu. Bu rakam kanülasyonunu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

içerik" fo: keep-together.within sayfalık = "1"> figure-results-8603
Şekil 13: Temsilcisi Sonuçlar: Rat Hilar Kelepçe Modeli Kullanarak Pegileinterferon-Süperoksit Dismutaz Doğrudan Segmental İntrahepatik Teslim. NS normal tuzlu =. PEG-SOD = pegile-süperoksit dismutaz, ALT = alanin aminotransferaz, MDA = malondialdehit. C. Serum Alanin amino transferaz (ALT, mU / ml), önceden hilar kelepçe ve 120 dakika sonra reperfüzyon arasında karşılaştırıldı. kontrol (NS) ön hilar kelepçe ve kontrol 120 dakika sonra Reperfüzyonda (NS) (p <0.001) arasında önemli bir fark vardır. 120 dakika sonra reperfüzyon (p <0.05) kontrol (NS) ve deney grupları (PEG-SOD) arasında önemli bir fark vardır. Bir öğrencinin T-testi kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Kontrol enjeksiyonu (NS) Bir sağ lob (non-hilar kelepçe) B. Doku malondialdehitd deney enjeksiyonu (PEG-SOD) anlamlı bir fark göstermektedir. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) kontrol enjeksiyonu (NS) ile doku malondialdehid sağ lob (non-hilar kelepçe) p <0.001 önemli ölçüde farklıdır. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) deney enjeksiyonu (PEG-SOD) p <0.005 versus kontrol enjeksiyonu (NS) doku Malondialdehit önemli ölçüde farklı seviyelerde yer alır. Bir öğrencinin T-testi kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Kontrol enjeksiyonu (NS) ve deneysel enjeksiyon (PEG-SOD) C. sağ lob (non-hilar kelepçe) doku glutatyon anlamlı bir fark göstermektedir. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) kontrol enjeksiyonu (NS) ile doku glutatyon kontrol enjeksiyonu (NS) p <0.05 ile sağ lob (non-hilar kelepçe) önemli ölçüde farklıdır. Sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) kontrol injectio doku glutatyon açısından ciddi farklılıklar vardırDeneysel enjeksiyon karşı N (NS) (PEG-SOD) p <0.005. Bir öğrencinin T-testi kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. D. Batı benek kontrol hayvanların sağ lob (non-hilar kelepçe) karşı, sol lob (sonrası hilar reperfüzyon) (normal tuz) karaciğer dokusunda bölünmüş kaspaz-3 artış ortaya konuldu. E. Batı benek gösteren kontrol (normal tuz) ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla, PEG-SOD ile tedavi edilmiş hayvanların karaciğer dokusunda bölünmüş kaspaz-3 azalmıştır. Bölünmüş kaspaz-3 karaciğer dokusunda F. seviyesi önemli ölçüde sonrası hilar reperfüzyon hayvanlar (p <0.05) 'de artar. Bir öğrencinin T-testi kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. G. (PEG-SOD ile aşılanmış), deney hayvanları sol lob karaciğer doku ve (Normal Tuzlu su infüzyonu) kontrol hayvanlarının sol lob karaciğer dokusu karşılaştırıldığında, bir in bölünmüş kaspaz-3 orada azalma önemli olduğukontrol (normal tuz) ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla, PEG-SOD ile muamele imals. Bir öğrencinin T-testi kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir.

Tartışmalar

Bu deney serisi göstermiştir ki, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, sol içine PEG-SOD ve ALT salınımında önemli düşüşlere yol açmıştır ortalama lob, hücre zarlarının lipid peroksidasyonu (MDA) ve glutatyon bakım (GSH) enjeksiyonu (normal tuz ). Alanin amino transferaz (ALT) de dahil olmak üzere karaciğer doku transaminaz hepatoselüler hasar belirteçlerini kurulmuştur. sol lob PEG-SOD ile enjekte edilir ALT azalma, PEG-SOD koruyucu bir etki gösterir. Artan MDA artmış lipid peroksidasyonu gösterir ve oksidatif stres ve doku hasarının bir işaretleyici olarak kabul edilir. Reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi MDA 26 üretiminde bir artışa neden olur. PEG-SOD enjekte hayvanın sol ve medyan loblarda doku MDA önemli azalma PEG-SOD koruyucu bir etki gösterir. Bu PEG-SOD zarar hücreleri koruduğunu akım anlayışı ile tutarlıdırKısmen düşük reaktif oksijen türlerinin 27 kaynaklanır. Buna ek olarak, reaktif oksijen türlerinin varlığında, glutatyon disülfid glutatiyon (GSH), 28 düşürülür. ayrıca, PEG-SOD enjekte karaciğer sol ve orta loblarda GSH bakım PEG-SOD koruyucu etkisini güçlendirir. Ek olarak, iskemi-reperfüzyon hasarı maruz dokuda, yarılmış kaspaz-3, apoptoz bir ürün artmış olduğu kanıtlanmıştır. PEG-SOD ile muamele sol lob bölünmüş kaspaz-3 azalma PEG-SOD apoptozda bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir.

Süperoksit dismutaz (SOD), reaktif oksijen türlerinin detoksikasyonuna kritik bir enzimdir. enzim bir hidrojen peroksit ve su içinde iki süperoksit anyonlar dönüşümünü katalize eder. Enzim katalazın sonra işlemi 25 tamamlayan, su ve oksijene hidrojen peroksit dönüştürür. yarı ömrüdoğal SOD konjüge polietilen glikol-süperoksit dismutaz (PEG-SOD) gelişimine kadar, deneysel modellerde kullanımı sınırlıdır. polietilen glikole SOD Konjugasyon 14 saat 6 dakika ila yarılanma ömrünü uzatır. Nguyen ve diğ. sistemik olarak verilmesini 29 kullanarak, bir fare modelinde, hepatik iskemi lipid peroksidasyonu azaltmak için yeteneğini göstermiştir.

tekniğinin burada ayrıntılı ve bazı daha önce literatürde tarif edilmiştir potansiyel değişikliklerin bir çeşitlilik vardır. Modeli kullanılmıştır moleküller bağlı olarak inhalasyon 11 epidural infüzyon 12, intraperitoneal enjeksiyon 17, 18, 21, 22, intravenöz uygulama 10, 14, 15 kullanılarak serbest bırakılabilir 8 içine> s, 19, 23, 24 ya da enjeksiyon.

Bu protokolde pek çok kritik adımlar vardır. En önemli portal vende kanülasyon olduğunu. Bakım damarda kesilmiş delik çok büyük olmadığı alınmalıdır. Doku çok elastik olan ve delik kendi başına büyütmek olacaktır. Biz mikrocerrahi makas ile 0.5 mm bir delik keserek başlamanızı öneririz. Kanül elle prosedürün bu kısmını gerçekleştirmek için çalışırken, eğer daha büyük çeviklik sağlayan bir cihaz kullanılarak delikten beslenebilir. Başlangıçta kanül beslerken Ayrıca, damarın arka duvarda bir delik alay önlemek için sol ve sağ portal damarların bifurkasyonu doğru doğrudan hedeflenmelidir. Kanülün ucu çatallanma ulaştığında, daha sonra özel sol damar içine beslenebilirmüttefik. kanül sol ve medyan lobu hem besleyen sol portal ven içine beslenir sonra, konumu ven içine hissederek el teyit edilebilir. Onun konumu da karaciğerin verilen segmentlerde ağarması etkisi soğuk tuz az miktarda enjekte ve görerek teyit edilebilir.

Sıçan karaciğer hilar kelepçe modeli karaciğer iskemik-reperfüzyon hasarı gösteren bir tekrar üretilebilir ve kararlı bir platform sağlar. Değişken hilar kelepçe modelleri, anti-oksidanlar ve diğer küçük moleküller 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, koruyucu etkilerini incelemek için araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. varyasyon Nokta olan kaplar kelepçe aşağıdakiler bulunmaktadır safra kanalı dahil olup olmadığı iskemik yapılır kademeli baskı, ve reperfüzyon 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 süresinin uzunluğu, 19, 20, 21. Bu model, bir molekülün uygulama yolu ve uygulama etkilerini incelemek için kullanılır Ayrıca, heterojen olan 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Açıklanan yaklaşım çeşitli avantajları vardır. Önce, iskemik segmente portal kaynağının doğrudan kanülasyon doğrudan segmental hepatik uygulama sağlar çalışılan farmakolojik madde içerir. Bu, bir iç kontrol olarak karaciğerinin diğer lobların kullanımını sağlar. İkincisi, segmental karaciğer kanülasyon çalışılan molekülü için bir dağıtım düşük hacmi mümkün kılar. Bu yaklaşım, böylece sistemik yan etkilerin riskini azaltır madde. ilgi karaciğer segment doğrudan enjekte hepatik segmentin doğrudan kanülasyon ön-iskemi teslim edilecek madde için izin verirIçi iskemi ya da post-iskemi. Bu iskemi-reperfüzyon hasarı döngüsünün herhangi bir noktada molekülün etkisi üzerindeki çalışma için izin verir. iskemik zamanın giderek uzunluğu ve mevcut olacağını karaciğer rejenerasyon çalışması için yaralanma ek fırsat artan düzeyde.

Bu yaklaşımın bazı sınırlamalar da vardır. İlk başlangıç ​​maliyetidir. Cerrahi mikroskop satın zaten bir tane sahip olmayan bir laboratuar için önemli bir başlangıç ​​maliyeti olabilir. Bu teknik, bir mikroskop olmadan zor ya da imkansız olabilir. İkinci eğri öğrenme süresi edilir. Bu prosedür oldukça basit olmasına rağmen bazı pratik gerektirir ve bir acemi bir uzman olmak için prosedürlerin önemli sayıda gerektirecektir olasıdır.

Özetle, bu model hepatik iskemi reperfüzyon hasarını incelemek için, tekrarlanabilir, basit ve uygun maliyetli bir platform sağlar. protokolde polietilen gl burada tarif edilmiş olmasına rağmenycol-süperoksit dismutaz, bir serbest radikal toplayıcı 25, infüze edildi, bu model karaciğerde I / R hasarı üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla, farklı farmakolojik maddelerin çeşitli aşılamak için kullanılabilir.

Açıklamalar

Tüm yazarlar hiçbir açıklama var bildirmektedir.

Teşekkürler

Biz onun açıklayıcı çalışmaları için Dennis Mathias kabul etmek istiyorum. Bu çalışma NIH T32AI 106704-01A1 ve Ohio State Üniversitesi Organ Nakli, Perfüzyonunun, Mühendislik ve Yenilenme T. Flesch Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc. 200- 250 grams 
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5 Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacan MV-7A
Warming PadBraintree Scientific HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuiteKent Scientific PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber Kent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
Oxygen Praxair98015
27-0 Micro-CannulaBraintree Scientific MC-28
Rib retractors Kent Scientific INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD)Sigma Aldrich S9549 SIGMA
GenieTouchKent Scientific
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges Criterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5 mL SyringeBD REF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex Medical REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific 1418-7410
Microsurgical Instruments
NameCompany Catalog NumberComments
Small Scissors Roboz RS-5610
Large ScissorsS&T SAA-15
Forceps - Large AngledS&T JFCL-7
Forceps - Small Angled S&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight Tip S&T FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Other Instruments
NameCompany Catalog NumberComments
Small Mosquito ClampsGeneric 
Analysis 
NameCompany Catalog NumberComments
Alannine aminotransferase (ALT) assay BiovisionK752-100
Malondialdehye (MDA) assay Abcam ab118970
Glutathione (GSH) assayCayman Chemical7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin Cell Signaling TecnologyAntibody 9661
ImageJ Software National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer Millipore10-188

Referanslar

  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. . Overall by Organ. Current US Waiting List. , (2016).
  5. OPTN. . Transplants in the US by Recipient ABO. , (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. , 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. , 3196431 (2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. , (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 122hilar kelep eiskemi reperf zyon hasarkaraci er transplantasyonupolietilen glikol s peroksit dismutaz PEG SODs andirekt kan lasyon hepatik da t m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır