複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

要約

ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。

要約

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

概要

B型肝炎ウイルス（HBV）による慢性感染は、慢性肝疾患¹の主要な危険因子です。現在の治療戦略は、HBV polで機能および/または感染した個体における免疫反応を活性化するだけでなく、間接的にインターフェロン刺激遺伝子機能^2を介して、HBVの増殖を抑制するI型インターフェロンの投与を阻害するヌクレオチド類似体に基づいているが、これらの治療は、HBVを排除することはできませんDNA完全に^3。さらに、抗POL剤に対して耐性であるHBVSの出現が懸念⁴です。直接ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）のライフサイクルの異なる段階を標的と組み合わせた抗ウイルス剤の投与は、正常抑制またはウイルス（ES）を根絶することが示されました。この考え、Hの異なるステージに直接作用する抗HBV剤の開発に類似BVのライフサイクルは、将来のHBV療法を確立するために重要です。

一般的に、標的ウイルスの単純なインビトロ培養系の確立は、抗ウイルス剤の開発を容易にします。しかしながら、抗HBV剤をスクリーニングするためのin vitro培養系の開発に少なくとも二つの障壁があります。第一は、HBV感染/増殖のための便利なインビトロ細胞培養系の欠如です。株化細胞内で増殖しているようなHIVおよびHCVなどの他のウイルス、とは異なり、原因狭い宿主範囲を含む実験的な制約のため、in vitroで HBVを育成することは困難です。このようなHBV感染^、5,6に対して感受性であるヒト肝癌細胞株HepaRG、などの特定の細胞培養系の使用は^{、 図7は、}これらの問題を克服するために開発されました。また、ウロキナーゼ-TYから分離されたPXB細胞、PEプラスミノーゲンアクチベーター、トランスジェニック/一次ヒト肝細胞（PHH）を接種したSCIDマウスに、HBV感染および複製⁸に感受性であることが示されました。しかし、HepaRGにおけるHBV複製のレベルは、HBV感染/複製レベルの一貫性がなく、再現性のない結果が発生する可能性があり、培養後の細胞分化状態に依存しています。 PXBは、一般に、HBV感染実験に使用されているが、その利用可能性によって制限されます。テトラサイクリン誘導HBV発現細胞株、HepAD38は、また広くHBVの複製を研究するために使用されてきたが、このシステムは、転写後ではなく、HBV感染⁹の入口段階で評価することができます。最近、HBVのための機能的受容体としてタウロコール酸ナトリウムのcotransportingポリペプチドの同定（NTCP）は、変数HBV培養システム¹⁰の開発を可能にしました。実際、このようなHuh7細胞などの非感受性の肝細胞におけるNTCP発現とHepG2細胞は、HBV感染^10を可能^にし 、従って、HBV感受性の細胞株の選択は、実験的制限の多くを解決する、拡張されました。第二の問題は、HBV感染および複製を評価するための単純なアッセイ系の欠如です。 HBV感染の評価は、通常、HBV DNA、RNAおよびタンパク質を分析することによって行われます。しかし、これらのウイルスマーカーの定量化は、多くの場合、費用がかかり、必ずしも簡単ではない時間がかかります。したがって、単純なアッセイ系の開発は、このようなレポーター遺伝子を使用するなど、HBVアッセイ系に関連する問題を克服する可能性があります。

しかしながら、HBVキャプシドにパッケージングすることができるゲノムサイズが制限されるため、 - 3.7未満kbの¹¹ -レポーター遺伝子の大きさはできるだけ短くあるべきです。また、ウイルスの複製に必須であるゲノム全体に散在複数のシスエレメントの存在が、中に利用可能な位置を制限しますゲノムへのレポーター遺伝子のsertion。いくつかの報告は、HBVゲノム^11、12、13に、HIV-1 Tatの、緑色蛍光タンパク質、およびDsRedを含む、外来遺伝子を挿入することを試みてきました。しかしながら、これらの組換えHBVSはHBV感染/複製をスクリーニングするための、またはHBV感染/複製に影響する因子のハイスループットスクリーニングのために有用ではありません。これは主に、組換えウイルスの低い生産性と非効率的なウイルス産生によって引き起こされるレポーター遺伝子の発現の低減強度です。

これらの問題を克服するために、我々は、ウイルス産生の高収率でレポーターHBVを構築しました。このウイルスは、エントリからの転写に、HBVの複製サイクルの初期段階を監視するのに非常に敏感です。それは小さい（171アミノ酸）であるため、これを達成するために、NanoLuc（NL）をマーカー遺伝子として選択した蛍光レポーターを操作クラス= "外部参照"> 14。また、NLは約ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼよりも明るく150倍、および発光反応が偽ヒット率が高スループットスクリーニングのために低くなることを示唆し、ATP非依存です。組換えHBVの生産効率は約1/5、親HBVの、および以前のHBV組換えウイルスについて報告されたレベルに似ています。それは、抗HBV剤のマススクリーニングのために使用することができるように、しかし、NLの輝度は、ウイルス生産性の問題を克服します。

初代肝細胞を用いて抗HBV剤のスクリーニングは、HepaRG、HepAD38とNTCP形質導入した肝細胞は、従来の方法（複数可）による抗HBV剤のスクリーニングに有用であるかもしれません。しかしながら、ここで説明するシステムは、簡単な取り扱い、高感度、およびスクリーニングのための低コストのような種々の利点を有します。これらの利点は、治療目的のために新たなHBV剤を開発し、同定するためのハイスループットアッセイに適しています。

プロトコル

レポータータンパク質をコードする組換えHBVの1.生産

1. HepG2細胞の調製
   1. 細胞培養培地を準備し（10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び100 U / mlの非必須アミノ酸）。
   2. 培養液10mlのトランスフェクションの前日で10 cmのコラーゲンコートディッシュでプレート4×10 ⁶ HepG2細胞。加湿5％CO ₂インキュベーター中37℃でHepG2細胞をインキュベートします。
      注：約4×10 ^6個のHepG2細胞を培養培地10ml中10cmのコラーゲンコートディッシュに播種されている場合、それらは次の日に70〜90％コンフルエントとなります。
2. トランスフェクション
   1. トランスフェクションを使用してpUC1.2HBV / NL ¹⁵のpUC1.2HBVデルタイプシロン¹⁵および5μg5μgのでトランスフェHepG2細胞製造元の指示に従って試薬。
   2. 翌日、培地を除去し、新鮮な培養培地10mlを追加します。
   3. 一週間は、トランスフェクション後、50ミリリットルチューブに組換えHBVを含む培地を転送し、1.3.1に進みます。トランスフェクトされた細胞を含むプレートに新鮮な培養培地の10ミリリットルを追加します。
      注：組換えHBVの産生は4週間維持されます。組換えHBVを含む培養培地は、1ヶ月間、4℃で保存することができます。
3. 組換えHBVの精製
   1. 遠心分離による組換えHBV（5分間、2300×gで）を含有する培養培地から細胞破片を除去します。
   2. 0.45μmのメンブレンフィルターを通して上清を渡します。
   3. 培地に26％PEG / 1.5MのNaClを（130 gのNaClを49 gの0.5 M EDTAをpH8.0の1mlの1 M HEPES pHを5 mlの7.6 500 mlのポリエチレングリコール6000）の等量を追加含有する組換えHBV、穏やかに混合します。 4℃で一晩インキュベートします。
   4. 4℃で20分間、2300×gで遠心分離します。
   5. 上清を捨て、TNE（10mMトリス、50mMのNaCl、1mMのEDTA）0.5mlにペレットを溶解します。
   6. 5分間、2300×gで遠心分離することによってゴミを取り除きます。
   7. TNE 0.8 mlの20％スクロースにロード組換えHBVを含むTNEの0.5ミリリットル。
   8. 15℃で3時間、100,000×gで遠心分離します。
   9. できるだけ上清の限りを捨て、ペレットを保存します。培地を開始40mlのあたりの無血清DMEM 1ml中に再懸濁します。
   10. 4℃で一晩インキュベートします。
   11. 0.45μmのフィルターを通して濾過。 -80℃で0.5ミリリットルのアリコートとストアを準備します。
       注：元のウイルスサンプルのレポータータンパク質の汚染が観察された場合、2時間を100,000×gでTNE 5〜30％のショ糖密度勾配超遠心分離によってウイルスを精製する、または往復のCsCl密度平衡化し、遠心分離50時間150,000×gでメートル1.1〜1.6グラム/ミリリットル。

組換えHBVの2.感染

1. 10％FBS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 / mlのG-418及び100 U / mlを補充したDMEM中のHBV感染に感受性である安定NTCP（HepG2細胞/ ^NTCP）15を発現^する培養HepG2細胞加湿5％CO ₂インキュベーター中で37℃で非必須アミノ酸。
2. 感染の1日前に、プレートは約5×10 ⁴のHepG2 /培地の0.1ミリリットルで96穴コラーゲンコートプレートにNTCP細胞^14。
3. 37℃の水浴中で解凍組換えHBVバイアルに残っている氷の小さなビットがあるまで。
4. 以下を組み合わせることによって感染するための媒体を準備：1×リン酸で40％PEG800010μlの緩衝生理食塩水（PBS）、ジメチルスルホキシド（DMSO）2μlの、組換えHBV10μlの、新鮮な培養液の78μlの96ウェルプレートのウェルあたり。
5. 96ウェルプレートの1ウェルに組換えHBV溶液100μlを加えます。
6. ある日感染後、ウイルス画分から汚染レポータータンパク質を除去するために、ウェルあたり300μlのPBSに感染した細胞を3回洗浄します。
7. 1週間またはそれ以下の場合は2％のDMSOを含む培地200μlに感染した細胞をインキュベートします。

3.分析

1. 一週間感染後、PBSに感染した細胞を3回洗浄します。
2. 感染細胞を溶解緩衝液50μlを加えます。
3. 5分間培養プレートをロックし、その後5分間2000×gで遠心します。
4. ルミノメータープレートにレポーター基質50μlのを追加します。
5. レポーター基質を含むルミノメータープレートに細胞溶解物の20μlのを追加します。簡単にボルテックスで混和します。
6. ルミノメーターでプレートを置き^、15を読ん^で開始します。

結果

図1は、ゲノム上のHBVゲノム、転写されたRNA、ウイルスタンパク質およびそのコード領域の概略図を示します。ゲノム中のレポーター遺伝子とその位置も示されています。 図2は、レポーター遺伝子を含むHBVレポータープラスミドとヘルパープラスミドを示します。 pUC1.2HBV / NLレポーターはpUC1.2HBV ¹⁶のプレコアmRNAの転写開始?...

ディスカッション

HBVゲノムは、コア、ポリメラーゼ、表面、およびXのORF（ 図1）を含む4つの主要なオープンリーディングフレーム（ORF）を有します。エンハンサーI ^18を含むエンハンサーII、S1プロモーター、S2プロモーターおよびXプロモーターを含むプレコア/コアプロモーター：これら四つのHBVのORFの転写はしっかり4プロモーターによって調節されます。 3.5キロバイトと3.4キ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393