Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em&gt; In Vitro</em&gt; система

Резюме

Этот протокол описывает методы для количественной оценки и определения характеристик хромосомных аберраций в пробирке в RAW264.7 макрофагах мышей после обработки воздуха твердыми частицами окружающей среды.

Аннотация

Воздействие твердых частиц (ТЧ) является одной из основных проблем здравоохранения в мире, которые могут повредить различные клеточные компоненты, в том числе ядерного генетического материала. Для того, чтобы оценить воздействие ТЧ на ядерной генетической целостности, структурные хромосомные аберрации забиты в метафазных макрофагами клеток мыши RAW264.7. PM собирается из окружающего воздуха с большим объемом общей взвешенных частиц сэмплер. Собранный материал солюбилизировали и фильтруют, чтобы сохранить водорастворимого тонкую часть. Частицы характеризуются для химического состава методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии. Различные концентрации суспензии частиц добавляют на в культуре в пробирке RAW264.7 макрофагов мышей в течение общего времени экспозиции 72 ч, вместе с необработанными контрольными клетками. В конце экспозиции, культура обрабатывают колцемид арестовывать клеток в метафазе. Затем клетки собирают, обрабатывают гипотонический раствор, нелетучие в acetomethanol, дropped на стеклах и, наконец, окрашивали раствором Гимза. Слайды рассматриваются для оценки структурных хромосомных аберраций (КАН) в метафазных при увеличении 1,000X с использованием светлого поля микроскопа. От 50 до 100 спрэд метафаза подсчитываются для каждой группы лечения. Этот метод адаптирован для обнаружения структурных хромосомных аберраций (ЦС), таких как разрывы хроматидный типа, обмены хроматидный типа, ацентричностью фрагменты, дицентрических и кольцевых хромосом, двойных минут, эндоредупликации и робертсоновского транслокаций в пробирке после воздействия ТЧ. Это мощный метод, чтобы ассоциировать хорошо изученного цитогенетическую конечную точку эпигенетических изменений.

Введение

Было подсчитано , что воздействие твердых частиц (ТЧ) вызывает более 3 миллионов случаев смерти в год, в первую очередь от сердечно - сосудистых и онкологических заболеваний легких ^1. Действительно, PM был признан канцерогенным для человека Международным агентством по изучению раковых заболеваний (группа 1), так как повышенный риск развития рака легких с увеличением уровня воздействия ТЧ было показано ^2. Интересно, что почти все раковые клетки питают численные и / или структурные хромосомные аномалии. Твердые частицы органического углерода представляет собой вариант, сложный и гетерогенную смесь, состав которой и размер распределение зависит от выбросов, а также физических и химических превращений. На его долю приходится от 35-55% городского ТЧ _2,5 массы (ТЧ 2,5 мкм и меньше) и более 60% сельского и континентального фона ТЧ _2,5 масс ^{3, 4.} Водорастворимая фракция составляет 30-90% органического аэрозоля. Большое количество органических соединенийбыли выявлены, в том числе алифатические углеводороды, полициклические ароматические углеводороды и их окисленные и азотированных производных, алифатических альдегидов и спиртов, свободных жирных кислот и их солей, ди-карбоновых кислот, полифункциональных соединений, белков и гуминовых макромолекул (HULIS), с использованием хроматографические методы в сочетании с масс - спектрометрических методов ^5-8. Эти соединения представляют собой менее 10-20% твердых частиц органического углерода, таким образом , большая часть органического углерода, неизвестно ^9.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что цитотоксичность, окислительный стресс и воспаление вовлечены в развитие ПМ-ассоциированных патологических состояний. Недавно было показано, однако, что воздействие ТЧ приводит также к ряду эпигенетических изменений, в том числе изменения в метилирование ДНК повторяющихся элементов, как в экспериментальном в системах пробирке и у человека ^10-12. Особый интерес представляют эффектыPM на сателлитной ДНК - больших и малых спутников - которые находятся в гетерохроматина области вокруг центромеры хромосом. Было показано , что эти эффекты могут быть постоянными по своей природе, так как они могут быть обнаружены в течение по крайней мере 72 ч после воздействия ^12. Изменения в метилирование ДНК, особенно в районе центромеры, может привести к накоплению мРНК транскриптов сателлитной ДНК, целостность хромосомной компромиссного во время клеточного деления и, как следствие, приводит к развитию различных патологических состояний ^13.

Адаптация цитогенетического подхода к анализу центров сертификации в качестве конечной точки эпигенетических изменений, вызванных ТЧ, таким образом, имеет большое значение. Здесь мы сообщаем подход для сбора ТЧ в атмосферном воздухе и подготовки, в пробирке воздействия и анализа с использованием центров сертификации мышиной макрофагальной системы RAW264.7 модели. Макрофаги составляют первую линию обороны против ингаляционных посторонних предметов и, следовательно, тего клеточная линия служит признанным и наиболее часто используемой модели в токсикологии частиц ^{11, 12, 14, 15.}

протокол

1. Сбор и подготовка частиц

1. Калибровка большого объема общей взвешенных частиц пробоотборник
   1. Отключите сэмплера двигатель от контроллера массового расхода и подключить двигатель к стабильному источнику питания переменного тока (Рисунок 1).
      Примечание: Фильтр не используется во время этой процедуры.
   2. Установите калибратор отверстие и верхней загрузкой переходную пластину к сэмплер. Затянуть верхние загрузки адаптера прижимные гайки надежно, чтобы гарантировать, что никакие утечки воздуха нет. Дайте пробоотборник двигателю прогреться до нормальной рабочей температуры (примерно 10-15 мин).
   3. Провести испытание на герметичность, закрывая отверстия на верхней части отверстия и давления крана на отверстие с руками. Слушайте высокой пронзительный звук, издаваемый выходящего воздуха. Если этот звук слышен, повторно затянуть верхней загрузкой адаптера прижимные гайки, как утечка присутствует. Если звук ниже, утечка находится вблизи одного из других прокладок в SYSTEM.
   4. Подключение одну сторону воды манометру к крану давления на стороне сопла с резиновой вакуумной трубкой. Оставьте противоположную сторону открытой манометру в атмосферу. Удерживая манометр вертикально для обеспечения точности показаний. Касание заднюю сторону записывающего устройства непрерывного потока поможет центру пера и обеспечивают точные показания.
   5. Повторите шаг 1.1.2 с использованием пяти скоростей потока , представляющих операционные скорости потока от 30 до 60 фут / мин (примерно каждые 5-6 фут ³ / мин). Отрегулируйте ручку на переменной отверстия для пяти различных позиций и занять пять различных чтений.
   6. Запись температуры окружающего воздуха, окружающего барометрического давления, пробоотборник серийный номер, серийный номер отверстия, наклон отверстия и перехватывать с датой последней сертифицированной, дата, месторасположение и инициалы оператора на листе калибровки.
2. Общее собрание взвешенных частиц образца и гравиметрический анализ
   1. Оберните8 из кварцевого волокна фильтра "х 10" в два слоя алюминиевой фольги. Поместите обернутый фильтр в печи и установить температуру при 550 ° С. Выпекать фильтр в течение по крайней мере 4 ч. Пусть печи остыть и извлечь фильтр. Поместите фильтр в эксикаторе с СаСО _3.
   2. Взвесить фильтр в микровесов с точностью до 10 мкг. Повторите измерения три раза в течение дня. Индивидуальные измерения должны находиться в пределах 25 мкг. Если это не будет достигнуто, вернуть обернутую фильтр в эксикатор и повторить процесс на следующий день.
   3. Откройте крышку укрытия (рисунок 2). Снять держатель фильтра рамы, ослабив четыре крыла гайки, позволяя медные болты и шайбы, чтобы качаться вниз из пути. Открываются фильтр из алюминиевой фольги, а также использовать очищенные щипцов тщательно центрировать его, грубее стороной вверх, на опорном экране. Правильно выровнять фильтр на экране.
   4. Поместите рамку на экране и закрепите его с помощьюмедные болты и шайбы при применении достаточного давления, чтобы избежать утечки воздуха по краям. Сотрите накопление пыли со всего держателя фильтра чистой тканью. Закрыть укрытие крышки тщательно и закрепить его.
   5. Убедитесь, что все кабели подключены к своим соответствующим разъемам на сосуды и трубки между краном давления электродвигателя вентилятора и записывающего устройства непрерывного потока подключен.
   6. Подготовьте рекордер потока. Выжмите ручку рычага подъема, чтобы поднять ручки и вставить новую таблицу. Совместите вкладку диаграммы к ступице привода записывающего устройства и нажмите с большим пальцем, чтобы понизить центр диаграммы на ступице. Установите время, вращая ступицу привода по часовой стрелке, пока правильное время на графике не совпадет с указателем индекса времени.
   7. Вручную включите пробоотборник и начать сбор. Монитор рекордера, чтобы убедиться, что он правильно красочного и истекшее индикатор времени, чтобы убедиться, что он работает правильно.
   8. В конце периода выборки, выключите сэмплер, записьистекшее время и получить диаграмму. Снимите раму, чтобы выставить фильтр. Удалить обнаженную фильтр из опорного экрана, удерживая его аккуратно на концах с пинцетом. Сложите фильтр по длине так, чтобы образец прикасается образца дважды и завернуть его в оригинальной алюминиевой фольги.
   9. Хранить фильтр в эксикаторе с СаСО ₃ в течение по крайней мере 24 ч перед взвешиванием. Повторите шаг 1.2.2 для измерения веса фильтров после отбора проб. Поместите фильтр в полиэтиленовый пакет на молнии и не храните его в -80 ° C до проведения анализа.
3. Анализ собранной пробы всего взвешенных частиц
   1. Получить сохраненный фильтр, разворачивают алюминиевой фольги и перенести фильтр на чистой тефлоновой поверхности. С помощью пинцета и скальпеля, разрезать внешний (белый) часть фильтра и утилизировать.
      1. Затем разрезать фильтр в 0,5 "х 0,5" куски и поместить штук в колбу емкостью 100 мл. Добавляют 50 мл сверхчистой воды. Поместите колбу в ультразвукеванна и гомогенат, в течение 60 мин при температуре 33 ± 3 кГц.
   2. Фильтр экстракт через 0,45 мкм шприц-фильтр из полипропилена до 100 мл круглодонную колбу. не испарить воду, используя роторном испарителе прибор под давлением при 50 & deg; С до около 5 мл экстракта остается в колбе.
      1. Выпаривают оставшуюся воду в 15 мл грушевидную колбу с известной массой. Взвешивают колбу сухого экстракта и записывают массу сухого экстракта.
   3. Растворить сухой пробы с 400 мкл D ₂ O путем обработки ультразвуком в течение 15 мин и переносят в стандартной ЯМР - трубки 5 мм. Центрифуга в течение 5 мин при 12000 х г при комнатной температуре, чтобы удалить нерастворенные вещества.
   4. Повторите с 300 мкл D ₂ O. Добавляют 10 мкл NaN ₃ 1,4% (конечная конц .: 0,02% вес / об) в трубке ЯМР. Добавляют 10 мкл (32 мкг) общей концентрации взвешенных частиц (TSP) -d4 (3,2 мг / мл) в D ₂ O (конечная концентрация 0,258 мМ) в трубке ЯМР.
   5. Приобретать ¹ спектров ЯМР с использованием ЯМР - спектрометра , работающего на 600.17 МГц.
      1. Вставьте ЯМР трубку в тройной резонансной криозондом. Калибровка прибора в следующем порядке: замок, мелодия, подкладку, калибровку длины 90 ° импульса и регулировки усиления приемника.
      2. Измерение спектров при 25 ° С с 1 D последовательности в скульптурной возбуждения с использованием 180 водно-селективным импульсов в режиме обнаружения Digital Quad, 8192 сканирование, 4 фиктивных сканирования, ширина развертки 8012.57 Гц, сдвиг частоты для подавления сигнала воды, установленной на 4,70 частей на миллион, 1,70 сек время обнаружения, 32768 временных точек данных домена (TD), 1 мс длительность градиента (P16), 100 мкс задержки восстановления после того, как градиент (D16).
   6. Процесс ¹ Н ЯМР - спектры с применением уширение линии 1 Гц и нулевым заполнением на коэффициент 2 (65536 точек данных). Исправьте фазы и базовой линии вручную и интегрировать. Установить пик ТСП-d4 0,0 промилле.

2. Частица экспозиции

1. Культура создана
   1. Теплый полную среду для роста, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин-стрептомицин раствор (100 ед / мл), 0,25% раствора трипсина и магния кальция фосфатный буферный солевой раствор (PBS), в водяной бане (при 37 ° С) в течение по крайней мере за 30 минут до начала культивирования.
   2. Выньте T75 колбу с 5% СО ₂ инкубатора , содержащий культивированные клетки RAW264.7 и промыть клетки с 2 мл подогретого PBS в два раза.
   3. Выбить прилипшие RAW264.7 клетки со дна сосуда для культивирования тканей с использованием 1 мл подогретого раствора трипсина с последующим соскоб.
   4. Собирают клетки из культуры ткани сосуда и сделать клеточную суспензию повторным пипетированием. Подсчитайте количество клеток с трипанового синего и пластины с плотностью 8000 / см ² (500 000 клеток всего) в 100 мм культуре ткани блюдо с подогретого полной среде. Отрегулируйте громкость воспроизведения мультимедийных файлов до 10 мл для конечной концентрации 50000 клетокна мл.
      Примечание: Удвоить количество пластин, если анализ ДНК метилирования также выполняется.
   5. Поместите вновь плакированные RAW264.7 клетки обратно в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С и оставляют прикрепляться в течение 24 часов.
   6. Кроме того, в кабинете биологической безопасности, ресуспендируют отфильтрованные частицы. Например, разбавленные частицы в концентрации 0,5 мг / мл в стерильном PBS в течение 5 мкг / мл в дозе лечения и при 5 мг / мл в течение 50 мкг / мл дозы лечения. Разведения могут быть подготовлены до месяца заранее и хранить при -80 ° С.
2. Лечение с твердыми частицами
   1. Вынимают клетки от 5% СО ₂ инкубатора и проверить под 10 - кратным увеличением с помощью инвертированного микроскопа для роста клеток, клеточной морфологии, состояния культуры и загрязнения. Следует ожидать, чтобы иметь по крайней мере 30% сплошности клеток на этой стадии.
   2. Консерванта, аспирация СМИ с помощью стерилизованное пипетки и промыть культуры сосуд с 2 мл 37 ° C PBSдва раза, чтобы полностью удалить средства массовой информации и плавающие или мертвые клетки.
   3. Добавить предопределенную дозу частиц со свежей средой в культуре сосудов и инкубировать в течение требуемого времени при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ инкубаторе. В этом исследовании, лечить клетки RAW264.7 с ПМ в течение 72 ч, чтобы параллельно экспозиции используется для одновременного генотоксичного и epigenotoxic анализа.
      Примечание: Цитотоксичность может негативно повлиять на качество цитогенетического анализа. Таким образом, дополнительные анализы, такие как цитотоксичность, метилирование ДНК, Вестерн-блоттинга или анализа экспрессии генов, как правило, выполняются на обработанных клетках. Expose клетки, как описано и приступить к конкретным анализом желаемого. Неопытные пользователи могут также хотеть включать положительный контроль, такой как метил метансульфонат, чтобы проверить их способность обнаруживать центры сертификации.

3. Анализ Цитогенетическое

1. Лечение арестовывать клеток в метафазе
   1. Подогреть колцемид таклюция (10 мкг / мл) на водяной бане 37 ° С в течение 30 мин. Протрите крышку с 70% -ным спиртом под шкафом биологической безопасности, чтобы свести к минимуму риск загрязнения
   2. Полностью удалить носитель асептических и мыть культуры сосуды с 2 мл подогретого PBS в два раза.
   3. Добавить подогретого свежего носителя (2 мл среды / 10 ⁶ клеток) , содержащих колцемид раствор (5 мкл / мл) в сосуд и инкубировать в течение 2 часов.
2. урожай клеток
   1. Теплый раствор трипсин и PBS, в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 30 мин. С этого этапа и далее, нет необходимости поддерживать асептические условия.
   2. Полностью удалить средства массовой информации, мыть культуры сосуды с 2 мл 37 ° C PBS в течение два раза, добавить требуемый объем подогретого раствора трипсина (обычно 2 мл на 60 мм блюдо культуры или T25 колбу и 4 мл на 100 мм блюдо или T75 колбу ), и поместите культуральный сосуд обратно в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° с в течение 1 мин.
   3. Takе из культурального сосуда, открепления клеток с помощью скребка, и добавляют 10 мл PBS, чтобы остановить трипсина действие.
   4. Пипеток вверх и вниз, по крайней мере в десять раз, чтобы суспензии отдельных клеток и клеток переноса в 15 мл коническую центрифужную пробирку дном.
   5. Центрифуга клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин в центрифуге качаться при комнатной температуре.
   6. Удалить супернатант, сломать осадок клеток путем осторожного постукивания, добавляют 10 мл PBS, и вновь центрифуге в течение пяти минут.
3. Гипотоническая лечение и фиксация
   1. Предварительно теплый 0,075 раствор хлорида калия М в водяной бане при 37 & deg; по крайней мере, в течение 30 мин.
   2. Удалить супернатант, не нарушая гранул клеток и оставить примерно 0,5 мл PBS.
   3. Аккуратно разбить осадок клеток и сделать одноклеточной суспензии с помощью пипетки P200.
   4. Добавляют 4 мл подогретого капли раствора хлорида калия по каплям при осторожном встряхивании.
   5. Инкубируйте клетки в гипотонической рotassium раствор хлорида в водяной бане при 37 ° С в течение 20 мин.
   6. Сделать свежий раствор acetomethanol добавлением 3-х частей метанола с 1 часть ледяной уксусной кислоты. Держите этот свежеприготовленный закрепитель при комнатной температуре.
   7. После гипотонической обработки, добавляют равный объем (4 мл) фиксирующих в пробирку и осторожно перемешать раствор путем переворачивания пробирки.
   8. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант. На этом этапе осадок клеток с увеличением размера, становятся беловато и более заметными.
   9. Удалить супернатант, добавить 4 мл свежей закрепитель и хранить при комнатной температуре в течение 30 мин.
   10. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант, и дать еще два промывок 4 мл закрепителя.
4. Чистка слайдов и метафазы подготовка распространения
   1. Погружают стеклянные слайды полностью в 10% жидкого моющего средства в течение 30 мин.
   2. Промыть слайды тщательно в холодной проточной водопроводной водой в течение 30 мин.
   3. RinС.Е. скользит три раза дистиллированной водой до полного удаления моющих средств, погружают в дистиллированную воду, и хранить в холодильнике для использования в будущем.
      Примечание: Очистка слайдов перед использованием способствует равномерности распространения и повышает качество метафазного.
   4. Отбросьте суспензии 10 мкл клеток на охлажденной мокрой слайд и дайте ему высохнуть на воздухе в течение ночи при комнатной температуре.
5. Окрашивание и монтаж
   1. Приготовьте 50 мл раствора для окрашивания Giemsa путем смешивания одной части раствора красителя Гимза с одной частью PBS и вылить в банку Коплин.
   2. Погрузитесь слайдов в окрашивании растворе в течение 20 мин.
   3. Промыть слайды в дистиллированной воде, чтобы удалить избыток пятно и немедленно высушить слайды, используя фен.
   4. Оставьте слайды при комнатной температуре в течение ночи.
   5. Нанесите одну каплю монтажа среды на слайде, осторожно положите покровное на монтажной среде, позволяют среду распространиться на слайде медленно, и удалитьизбыточная среда с бумажным полотенцем. Дайте смонтированный слайд высохнуть в течение по крайней мере 1 часа до перемещения или просмотра под микроскопом, чтобы избежать перемещения покровного.
      Внимание: Важно тщательно поместить покровное без образования пузырьков во время этого шага. Использование высоких температур для удаления пузырьков не рекомендуется.
6. Микроскопические наблюдения и аберраций типов
   1. Изучить структурные центры сертификации в метафазных при 100-кратном увеличении с использованием хорошего качества светлого поля микроскопа.
   2. Оценка по крайней мере от 50 до 100 метафазных для каждой группы обработки для обработки, которые индуцируют большое количество центров сертификации. Для меньших размеров эффекта, анализ до 300 метафазных рекомендуется.

Результаты

Большое внимание должно быть принято при выборе расположения ПБО пробоотборник, а также время года, когда выполняется сбор. Химический состав, а также размер частиц может существенно повлиять на результаты. Материал, собранный должен быть виден на фоне белого фильтра...

Обсуждение

Цитогенетические исследования или микроскопический анализ числа или структуры хромосом, в первую очередь в метафазных, предоставляет информацию решающее значение для прогнозирования, оценки риска и лечения различных заболеваний. В настоящее время точно установлено, что цитогенетич...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA