Élaboration d'un modèle de coiffage pulpaire direct pour l'évaluation des pulpaire Wound Healing et Formation reconstructrice Dentin chez la souris

Résumé

Nous décrivons une méthode étape par étape de réalisation coiffage pulpaire direct sur les souris des dents pour l'évaluation de la cicatrisation pulpaire et la formation de dentine réparatrices in vivo.

Résumé

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

Introduction

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals^1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)₂) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.

To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs^3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties^6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.

Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Protocole

Les souris ont été achetées auprès de Jackson Laboratory et conservés dans un vivarium exempt d'agents pathogènes dans la Division UCLA de médecine de laboratoire animale (DLAM). Les expériences ont été effectuées selon les directives institutionnelles approuvées du Comité de la recherche animale du chancelier (ARC N ° 2016-037).

1. Souris Anesthésie

1. Utilisez huit semaines vieille souris C57 / BL6 femelles (n = 3).
2. Anesthésier les souris en utilisant de la kétamine (80 à 120 mg / kg de poids de souris) / xylazine solution (5 mg / kg de poids de souris) et à administrer par voie intraperitoneale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
3. Préparer la kétamine (80-120 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) des solutions et les administrer par voie intrapéritonéale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
4. Vérifiez que les souris sont complètement anesthésiés en effectuant une pincée d'orteil.

2. Procédure de coiffage pulpaire

1. Placer le porte-embouchure dans la bouche de la souris.
2. Fixer le porte-bouche sur la table telle que la luiannonce est orientée vers le haut.
3. Placer le microscope (10X) au-dessus de la bouche de sorte que la première molaire du maxillaire est entièrement visible.
4. Utilisation du ¼ de tour bur dans une pièce à main haute vitesse à 200 000 rpm, retirer la partie de l'émail de la dent dans le milieu jusqu'à ce que la pâte est visible à travers la dentine transparente. Ne pas exposer la pulpe avec le bur.
5. L'utilisation d'un endodontique K-fichier # 15 (diamètre de 150 um), perforent par la dentine et d'exposer la pulpe.
   NOTE: Des précautions particulières doivent être prises pour que les débris de dentine ne soit pas poussé dans la pâte. Ceci peut être évité en faisant tourner le K-file trimestrielle, puis en tirant le K-déposer sur.
6. Mélanger MTA avec H ₂ O stérile conformément aux instructions du fabricant. Livrer et placez le MTA sur la pulpe exposée à la pointe de l'explorateur. Utilisez le côté arrière du point de papier (fine) pour emballer le MTA dans la pulpe exposée en tapotant doucement. Le côté le plus épais du point de papier est plat et permet doncpour la bonne condensation du MTA dans la pulpe exposée.
7. Graver la dent pendant 15 s en plaçant l'agent d'attaque d'acide phosphorique à 35%, où elle couvre juste la dent. Prendre des précautions particulières afin de limiter le placement de l'agent d'attaque, car il peut irriter les tissus gingivaux.
   Remarque: le réactif d'attaque est dans une seringue et est utilisée pour rendre rugueuse la surface des dents de telle sorte que les adhésifs dentaires peuvent circuler pour médier la liaison micromécanique sur la dent. Parce qu'ils sont visqueux, il peut être autonome en appliquant de petites quantités directement sur la dent.
8. Utilisez aspiration négative sous pression pour enlever le décapant. Utilisez une boulette de coton qui est légèrement imbibé d'H ₂ O pour éliminer les résidus de la gravure. Répétez cette étape jusqu'à ce que la gravure est complètement retiré de la dent.
9. L'utilisation d'un dépoussiéreur à air comprimé, sécher délicatement la dent.
10. Appliquer les adhésifs dentaires à l'aide de l'arrière du point de papier.
11. Faire la couche adhésive mince en utilisant l'air comprimé pendant 3 s.
12. Cure les adhésifs dentaires pour 20 s à l'aide de l'unité de durcissement-lumière.
13. Placer le composite fluide en petites quantités sur la dent qui a été coiffé avec MTA. Utilisez la pointe de l'explorateur à couler le composite dans les rainures des dents.
14. Cure le composite pendant 30 s en utilisant une unité de photopolymérisation à polymériser. Vérifiez que le composite est complètement guéri et en utilisant l'explorateur dur.

3. Post-op Soins

1. Administrer le carprofène (5 mg / kg) par voie sous- cutanée (sc) immédiatement après la procédure de pâte de coiffage.
2. Placez la souris sur un coussin chauffant à faible puissance pour garder les animaux au chaud avant qu'ils ne se réveillent.
3. Retour les souris au vivarium pour le logement.

4. Tissue Procurement

1. Après 5 - 6 semaines euthanasier les souris par dislocation cervicale sous une condition d'anesthésie avec l'isoflurane.
2. Retirez délicatement le maxillaire hors de la base du crâne et le mettre dans un tube de 50 ml. Fixer le entire maxillaires qui contient à la fois de la dent de la pâte à coiffe et la dent non coiffé controlatérale dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4, à 4 ° C pendant une nuit, puis la stocker dans une solution d'éthanol à 70%.
   NOTE: Le paraformaldéhyde est toxique et cancérigène. L'utilisation appropriée paraformaldéhyde doit être surveillé comme indiqué dans les procédures d'utilisation normalisées (SOP).
3. Balayez les maxillaires de souris à l'aide de l'analyse μCT. Pour sécuriser les maxillaires lors de la numérisation, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les placer dans le tube de culture de cellules de 15 ml.

5. μCT Numérisation

1. Préparer les échantillons pour la numérisation μCT. En bref, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les fixer dans 15 ml de culture cellulaire tube conique générique. Monter le tube sur la scène de balayage μCT, comme indiqué dans les instructions du fabricant.
2. Réglez la source de rayons X à un courant de 145 uA, une tension de 55 kV, et un temps d'exposition de 200 ms.
3. Effectuer l'acquisition d'image avec le scanner μCT à une résolution de 20 um et avec un Al filtre de 0,5 mm.
4. Reconstruire l'image et le visualiser ^11.
5. Une fois l'analyse de μCT est terminé, commencer décalcification avec 5% d'EDTA et 4% de saccharose dans du PBS (pH 7,4) pendant 2 semaines.

6. Traitement des tissus et Coloration

1. Incluez les tissus décalcifiés dans la paraffine. Avant l'intégration, de l'assiette du maxillaire en faisant une coupe sagittale immédiatement antérieure à la première molaire. Bien que l'insertion, la position de cette surface vers le bas, de telle sorte que la section longitudinale de la première molaire est la surface de coupe.
2. Utilisation du microtome, préparer 5 lames um d'épaisseur. Les zones de pâte de coiffage coïncident généralement avec la racine distopalatal (DP), qui peut être utilisé comme point de repère. Déterminer la zone précise d'intérêt en examinant l'histologie au microscope optique et en comparant les images μCT.
3. Pour coloration H & E, Deparaffinize et réhydrater les lames avec du xylène (2 fois) et de l'éthanol dilué en série (EtOH 100% 2 x, 95% de EtOH 2x et 70% de EtOH 1 x).
4. Rincer les lames avec de l'eau courante du robinet.
5. Colorer avec une solution hématoxyline pendant 2,5 minutes et rincer à l'eau du robinet.
6. Plonger les lames dans 95% d'éthanol pendant 1 min.
7. Colorer avec une solution éosine pendant 1 min et rincer à l'eau du robinet.
8. Déshydrater avec de l'éthanol dilué en série (70% de EtOH 1x, 2x EtOH à 95% et 100% de EtOH 3x) et du xylene (3 x).
9. Monter les lames avec une solution de montage.

Résultats

Ici, nous avons montré les procédures étape par étape pour effectuer le coiffage pulpaire sur souris des dents. L'un des aspects clés de coiffage pulpaire chez la souris est d'avoir l'appareil approprié. A cet égard, comportant le microscope avec un grossissement de 10X puissance est essentielle (figure 1A). Pour créer une préparation de classe I comme dans la dent, nous avons utilisé une fraise ¼ tour dans une pièce à main haute vitesse électri...

Discussion

À l' heure actuelle, il existe plusieurs modèles expérimentaux disponibles pour valider les effets in vivo des matériaux dentaires, échafauds, ou des facteurs de croissance sur la différenciation odontogène des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) ^13. Ces modèles comprennent une transplantation autologue de ectopique DPSC dans un organe tel que la capsule rénale, ou d'une transplantation sous - cutanée dans des souris immunodéprimées DPSC avec échafauds ^14,15. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BM-LED stereo microscope	MEIJI Techno		Microscope
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	Electic motor engine
isoflurane	Henry schein animal health	NDC 11695-0500-2
1/4 round bur	Brasseler	001092T0
Endodontic K-file	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
Paper point	Henry schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent product Inc.		Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	Adhesives
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	Curing light unit
Characterization tint	Bisco	T-14012	Flowable composite
Skyscan	Breuker	1275	uCT scanner
Microm	Thermo	HM355S	Microtome
Hematoxyline-1	Thermo Scientific	7221
Eosin-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	Mounting solution