Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Riepilogo

Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.

Abstract

L'infiammazione delle vie aeree è spesso associata a infezioni batteriche e rappresenta un determinante importante della malattia polmonare. La determinazione in vivo delle capacità proinfiammatorie di vari fattori è impegnativa e richiede procedure terminali, come lavaggio broncoalveolare e rimozione dei polmoni per analisi in situ , escludendo la visualizzazione longitudinale nello stesso topo. Qui, l'infiammazione del polmone è indotta attraverso l'instillazione intratracheale del supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa (SN) in topi transientemente transgeniati che esprimono il gene reporter del luciferasi sotto il controllo di un promotore bovino eterologo IL-8. L'espressione della luciferasi nel polmone è controllata dall'analisi bioluminescente (BLI) in vivo su un tempo di 2,5 a 48 ore dopo l'instillazione. La procedura può essere ripetuta più volte entro 2 - 3 mesi, consentendo così la valutazione della risposta infiammatoria negli stessi topi conLa necessità di terminare gli animali. Questo approccio consente di monitorare in tempo reale i fattori pro e anti-infiammatori che agiscono nel polmone e sembra adatto per studi funzionali e farmacologici.

Introduzione

Malattie polmonari croniche, come l'asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (CF) e la bronchiectasia, sono caratterizzati da infiammazioni delle vie aeree. L'infiammazione delle vie aeree è caratterizzata da edema, infiltrazione cellulare, linfocita T e attivazione delle cellule mastiche, aumento delle secrezioni delle vie aeree e deposizione eccessiva di collagene. CF è un disturbo multisystem e la sua principale causa di mortalità e morbilità è l'infezione batterica polmonare con aggravamento dell'esacerbazione polmonare. Il declino della funzione polmonare prevede un risultato significativamente più povero ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Lo stato infiammatorio del tratto respiratorio è solitamente osservato attraverso la valutazione di marcatori immunologici reclutati durante il processo infiammatorio in materiale derivato dalle vie aeree inferiori e superiori, come l'espettorato, che fornisce resistenza variabileULT. Le broncoscopie sono anche eseguite ⁵ . I modelli murini sono strumenti preziosi per indagare la patogenesi e l'evoluzione delle malattie caratterizzate da infiammazioni delle vie aeree e per i quali non sono ancora stati identificati trattamenti o cure efficaci. I modelli animali di infezione polmonare e infiammazione sono stati utilizzati per studiare l'interazione tra asma e patogeno, compreso il ruolo di sostanze chimiche che simulano le condizioni umane ( es. Esposizione al fumo di sigarette, LPS, elastasi, ovalbumina, poli I: C ecc. Nonché combinazioni di quanto sopra) ⁶ . La misura dei parametri legati all'infiammazione richiede il sacrificio degli animali, in quanto sono necessari approcci invasivi per misurare fattori quali il carico batterico, le citochine nei polmoni e il fluido di lavaggio broncoalveolare (BAL). Inoltre, gli esami istologici sono spesso necessari. La possibilità di ottenere informazioni sulla cinetica di risposta infiammatoria richiede l'uso di numTopi erosi. Pertanto, una tecnica che consentirebbe di ottenere tali informazioni senza la necessità di sacrificare gli animali è preziosa su basi tecniche, etiche, economiche e operative.

IL-8 è un giocatore essenziale nel processo infiammatorio, recluta leucociti al tessuto infiammato. Rappresenta una lettura molecolare per lo studio dell'attivazione della via infiammatoria. MIP-2 e KC possono essere omologhi funzionali di umano IL-8 nei topi. I topi esprimono solo un potenziale recettore IL-8, un omologo del CXCR2 umano ^{7 , 8} , ma sono in grado di modulare un promotore di gene ET-8 eterologo che guida un gene reporter. Un modello murino di infiammazione polmonare è stato recentemente sviluppato dopo l'osservazione che un topo bovino IL-8 promotore / luciferasi reporter construct può essere transactivated nei topi. Questa caratteristica consente l'utilizzo della bioluminescenza imaging (BLI) per monitorare la risposta infiammatoria nel vivere unNomi ⁹ .

Questo modello è stato adattato per studiare l'infiammazione attivata da esoproduzioni batteriche ( ad es. LPS o prodotti rilasciati da ceppi batterici) o TNFalfa ^{10 , 11} . Il processo di scoperta di droga è incentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di vecchie e nuove molecole antinfiammatorie che possono trattare le malattie polmonari, come CF, asma e BPCO. Queste nuove entità chimiche devono essere testate rapidamente e convenientemente in modelli animali che possono essere collegati a specifici fenotipi clinici per facilitare la progettazione di studi clinici intelligenti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti animali descritti sono stati approvati dal comitato intramurale per la sperimentazione animale del Centro Interdipartimentale di Ricerca Sperimentale presso l'Università degli Studi di Verona e rispettano la Direttiva Europea 2010/63 UE, il D.Lgs 26/2014 e la revisione "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Questo protocollo e la sperimentazione sono stati approvati dal National Institutes of Health (n 273/15). Gli animali avevano accesso libero ai normali mangimi di roditori e all'acqua del rubinetto ammorbidito e sono stati acclimatati per almeno 5 giorni alle condizioni locali del vivarium (temperatura ambiente: 20 - 24 ° C, umidità relativa: 40-70%, ciclo chiaro e scuro: 12 h ) Prima di qualsiasi trattamento.

1. In Vivo Gene Delivery

1. Utilizzare un cappuccio di flusso laminare per preparare i complessi di reagenti / nucleic acido di erogazione in vivo .
2. Definire il protocollo sperimentale aNd parametri seguendo le istruzioni in vivo del produttore.
   1. Utilizzare un volume totale di iniezione di 200 μL di complessi per mouse.
   2. Inizia con 40 μg di DNA sospeso in acqua senza endotossina; L'intervallo di ottimizzazione può raggiungere 60 μg.
      NOTA: La concentrazione finale dell'acido nucleico nel volume di iniezione non deve superare 0,5 μg / μL, secondo le istruzioni del produttore.
   3. Utilizzare un rapporto N / P di 6 - 8 (0,12 - 0,16 μL di reagente di erogazione per μg di acido nucleico). Calcolare il corrispondente volume di reagente di erogazione.
      NOTA: i complessi dovrebbero essere cationici per un'entrata efficace delle cellule. Il rapporto N / P è definito come il numero di residui di azoto (N) sul reagente di erogazione in vivo per fosfato acido nucleico (P) e rappresenta la misura dell'equilibrio ionico all'interno dei complessi.
3. Diluire l'importo calcolato (vedere la fase 1.2.1) dell'acido nucleico nel 5% di glucosio (concentrato finale) Utilizzando la soluzione di zucchero da 10% (fornita) e l'acqua sterile. Assicurarsi che il volume di diluizione sia la metà del volume di iniezione finale. Vortice dolcemente o mescolate pipettando su e giù.
4. Diluire l'importo calcolato (vedere la fase 1.2.3) del reagente di erogazione a metà del volume d'iniezione del 5% di glucosio (concentrazione finale) utilizzando la soluzione di base del glucosio al 10% (fornita) e l'acqua sterile. Vortice dolcemente e giri a 13.000 xg per 15 s.
5. Aggiungere immediatamente i reagenti di erogazione suddetti diluiti all'acido nucleico diluito. Mescolarli con vortice dolce e spin giù a 13.000 xg per 15 s.
6. Incubare la miscela dal punto 1.5 per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Da questo punto i complessi sono stabili per 4 ore a temperatura ambiente e per un massimo di 7 giorni se conservati a 4 ° C.
7. Eseguire iniezioni di coda-vena utilizzando complessi equilibrati a temperatura ambiente. Mettere la coda del topo in acqua calda (50-53 ° C) per 30 s per consentire la dilatazione delle vene.
   1. Posizionare il mouse all'interno del dispositivo di ritenzione. Inserire un ago da 27 a 30 gauge nella vena della coda ad un angolo di 20-30 ° e iniettare lentamente 200 μL. Al termine, rimuovere l'ago e applicare pressione sul sito di iniezione.
      NOTA: Un leggero sporgimento nella coda durante l'iniezione indica un posizionamento errato. Se ciò accade, rimuovere l'ago e ripetere il processo prossimale al sito precedente.
8. Visualizzare l'espressione genica eseguendo BLI in vivo (vedere la fase 2) a 24 e 48 h dopo l'iniezione endovenosa.

2. In Vivo BLI

NOTA: Prima di tutto, preparare una soluzione di stock fresca di D-luciferina da 15 mg / ml in DPBS, sterilizzarla a filtro utilizzando un'unità di filtraggio da 0,22 μm e conservarla a -20 ° C.

1. Posizionare i topi in una chiara camera di anestesia in plexiglass. Assicurarsi che la camera isoflurana sia piena. Quando è pronto ad anestetizzare gli animali, assicurarsi che la pompa (lEft) e gli interruttori a camera (destra) sono accesi. Ruotare il quadrante isoflurano al 2,5% per l'induzione e il 2% per la manutenzione. Gli animali all'interno della camera IVIS sono tenuti sotto l'anestesia isofluorena del 2,5% durante l'acquisizione di immagini.
2. Dopo che i topi sono completamente anestetizzati, iniettare 10 ml / kg di peso corporeo della soluzione D-luciferina per via intraperitoneale 15 minuti prima dell'immagine.
   NOTA: Si deve eseguire uno studio cinetico su D-luciferina per determinare il tempo del picco del segnale dopo la somministrazione di D-luciferina.
3. Aprire il sistema di imaging in vivo e preparare la camera di imaging avvolgendola con un pezzo di cardstock nero (scartare al termine). Posizionare i coni del naso come necessario per una corretta anestesia (utilizzare un cono per mouse).
   NOTA: Il tubo che fornisce l'anestesia allo strumento viene suddiviso in modo che la stessa concentrazione di anestesia venga plasmata ai collettori di anestesia situati all'interno del sistema di imaging.
4. Trasferire i topi (fino a 5) dalla bBussare ai coni del naso collegati al collettore del sistema di imaging e chiudere la porta. L'acquisizione di immagini dura 5 min.
5. Acquisire un BLI utilizzando il software del produttore, come segue.
   1. Inizializzare il software. Nel pannello di controllo dell'acquisizione del sistema di imaging in vivo , mettere un segno di spunta accanto a Luminescente . Confermare che l'impostazione Filtro di eccitazione sia Blocco e l'impostazione Filtro emissioni sia aperta.
   2. Fare clic sulle frecce: per la modalità Imaging Luminescente, selezionare un tempo di esposizione di 5 minuti, Binning 8 e F / Stop 1; Per la modalità Imaging fotografica, selezionare Binning 4 e F / stop 8.
   3. Dall'elenco a discesa Vista campo, selezionare D, 19 cm e un'altezza soggetto di 1,5 cm. Fare clic su Acquisisca quando è pronto per acquisire l'immagine.
6. Quando l'acquisizione dell'immagine è completa, posizionare i topi nelle loro gabbie.
7. Quantificare i fotoni emessi da regioni specifiche utilizzando il software del produttore.
   1. Clic Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti. Negli strumenti ROI , selezionare la misurazione ROI dall'elenco a discesa Tipo.
   2. Fai clic sull'icona quadrata e disegna un ROI quadrato con le giuste dimensioni per coprire il torace di un animale. Copia e incolla il ROI per ogni animale per ottenere ROI con le stesse dimensioni. Nel pannello Strumenti ROI, fai clic su Misura ROI per ottenere le misure dell'intensità totale nei ROI.
   3. Osserva i dati di misurazione ROI per tutti i ROI creati nelle immagini o nelle sequenze durante una sessione (un ROI per riga). Fare clic su Esporta e selezionare la cartella in cui verrà salvato il file.

3. Mouse Challenge con stimoli pro-infiammatori

NOTA: Prima della sfida del mouse con stimoli pro-infiammatori, controllare l'attivazione di base tramite i n vivo BLI (vedere passo 2). Almeno 7 giorni devono passare tra la consegna del gene in vivo e il mousLa sfida per permettere che l'infiammazione lieve e transitoria scompaia.

1. Preparare l'apparecchiatura per l'instillazione intratracheale (vedere la Figura 1 e la Figura 2 ).
   1. Collegare le siringhe monouso da 5 ml con la molla (C, E), una siringa da 100 μL (B) e un misuratore monouso (D) al rubinetto a 3 vie (A). Posizionare il sistema sul supporto (H). Posizionare il sistema sul supporto (H).
   2. Collegare il tubo micro medico PE190 (F) al misuratore monouso (D) e alla penna secolo (G).
   3. Riempire la siringa da 5 ml con 800 μl di aria e girare il rubinetto a 3 vie.
      NOTA: Riempire il tubo con supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa aspirando 50 μl nella siringa da 100 μl.

Figura 1: Riprese SchematicheNazione di una singola componente del dispositivo intratracheale.
( C) siringa da 5 ml, (D) calibro monouso, (E) siringa da 5 ml da gettare con molla, (F) PE190 micro tubo medico (A) , (G) penna secolo e (H) sostegno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione del dispositivo intratracheale assemblato.
Le identificazioni sono identiche a quelle della figura 1 . Fare clic suQui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Anestetizzare i topi usando una camera di vaporizzatore isoflurana impostata al 2,5% di isoflurano mescolata all'ossigeno.
3. Monitorare l'animale per valutare gli effetti dell'anestesia dopo 3-5 minuti.
   NOTA: Per verificare che il mouse sia completamente anestetizzato, controllare attentamente i seguenti segni: la velocità di respirazione rallentata dovrebbe rallentare, la mancanza di sollecitazione del braccio quando viene prelevata dal collo e la mancanza di risposta quando gli arti posteriori sono stimolati. Attendere qualche minuto e controllare di nuovo prima di procedere al passaggio successivo se questi criteri non vengono soddisfatti.
4. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma di intubazione del plexiglass, appendendola dai suoi incisivi, posizionati sul filo.
5. Accendere il laringoscopio con la mano sinistra (per i ricercatori di destra) e afferrare un paio di pinze a punta dritta. Usate la punta del laringoscopio e le pinze per aprire delicatamente la bocca.
6. Estrarre la lingua e hVecchio a lato usando le pinze. Guida la lama del laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Tenere il laringoscopio premuto molto dolcemente ad un angolo di 90 ° fino a quando l'apertura della trachea è visibile. Tenere il laringoscopio in posizione.
7. Utilizzando l'altra mano, prendere il tubo di mandata collegato alla fine del tubo PE e inserirlo nella trachea. Ruotare la valvola a tre vie per fornire l'inoculo. Estrarre il tubo dalla trachea appena possibile. Tenere il mouse in posizione verticale per alcuni secondi per permettere l'inoculo inalato nei polmoni.
   NOTA: I topi soffocano e muoiono se la trachea è bloccata troppo a lungo.
8. Rimuovere il mouse dalla piattaforma. Il tempo di recupero può variare in base ai ceppi; Monitorare il mouse con diligenza, assicurandosi che l'animale sia completamente sveglio entro 30 minuti dopo la procedura.
9. Intraperitonealmente inietta 150 mg / kg di D-luciferina e immagini i polmoni utilizzando un sistema di imaging in vivo 4, 24 e 48 h dopo l'intratrachealeInstillazione degli stimoli. Quantificare i fotoni emessi da regioni specifiche utilizzando il software del produttore.

Risultati

Il modello del topo transgenico bIL-8-Luc è stato utilizzato per il monitoraggio in vivo dell'infiammazione polmonare nei topi sfidati con supernatante batterico concentrato (30x) contenente fattori di virulenza di secrezione. La risposta infiammatoria indotta è stata rilevata dall'immagine in vivo come aumento del segnale BLI. L'attività proinfiammatoria è stata chiaramente rilevabile dopo 2,5 h post-instillazione, anche se il segnale BLI ha raggiunto i...

Discussione

In un precedente lavoro ¹¹ , è stato mostrato un contrasto tra i marcatori BLI e BAL dipendenti da bIL-8-Luc. Si è basata sul grado differenziale di sensibilità all'interno dei ceppi del mouse ¹² . Per questa ragione, la prima applicazione del modello bIL-8-Luc su un diverso ceppo di topi richiede uno studio iniziale della risposta infiammatoria, sia in termini di BLI che di marcatori infiammatori più standardizzati.

La trasfezione dei ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC	Harlan Laboratories Italy		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid	Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy		Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector	Promega	E1751	Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent	Polyplus transfection	201B-001G	The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protect from light, store at -20 °C
Living Image software	Caliper Life Sciences,	Experimental Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip