ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Summary

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

Abstract

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה - יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo - מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

Introduction

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל ¹ , דיבור באפליה רעש ² , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים ³ . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר ⁴ . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי.

העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה ^{6 , 7} . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo ^{8 , 9} . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת ¹⁰ . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 ^{11 , 12} (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) ⁸ .

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת 'ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. טיפול ביצים

1. רכישת ביצים מופרות מספק מקומי. שמור ביצים על 13 מעלות צלזיוס במקרר לא יותר מ 5 ימים לפני הדגירה. עוברי הכדאיות יורדת באופן משמעותי לאחר שבוע 1.
2. ספוגית כל ביצה עם אתנול 70% לפני ההגדרה בחממה.
3. קבע 1-2 תריסר ביצים על צדם בחממה עם הטמפרטורה מוגדר 38 ° C ב לחות 50%. זה מבטיח מיקום העובר הנכון electroporation ואת הכדאיות האופטימלית, בהתאמה.
   הערה: לאחר 48-52 שעות של הדגירה, הביצים יהיו בבית המבורגר המילטון (HH) שלב ~ 12-13 ומוכן electroporation.

2. הכנה

1. פלסמיד מיXing
   1. הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (0.1% ב 18 MΩ deionized ו מזוקקים H ₂ O [DDH ₂ O]) עבור כל 7 μL של תערובת DNA.
   2. עבור שיתוף electroporation של פלסמידים מרובים, לערבב פלסמידים ביחס 1: 1. ריכוז ה- DNA הסופי צריך להיות 5-8 מיקרוגרם / μL.
2. מילוי הזרקת פיפטה
   1. משוך pipettes על משיכה micropipette. ממלאים את פיפטה עם 1-2 פלסמידים μL באמצעות מחט 28G מזרק.
   2. לשבור קצה פיפטה 10 - 20 מיקרומטר באמצעות מלקחיים. השתמש במיקרוסקופ כדי לסייע בקביעת גודל קצה פיפטה שבור. צרף את פיפטה לבעלים פיפטה של ​​picospritzer.

3. חלון

הערה: הליך החלונות פורסם לפני ¹³ . עיין באיגוד 13 למידע חזותי נוסף.

1. נגבו את כל המכשירים ואת אזור העבודה עם 70%אתנול.
2. קח את המספר הרצוי של ביצים להגדיר מתוך האינקובטור (בין 6-10), לעזוב בטמפרטורת החדר, בנפרד ביצים ספוג עם אתנול 70% שוב. ביצים להישאר קיימא לפחות 2 שעות לאחר הסרת חממה.
3. מניחים את הביצה על גבי אור אור כדי לזהות את המיקום העובר. מעגל את מרכז האזור הכהה ( כלומר , עובר) עם עיפרון.
4. באמצעות מחט 19G, לתקוע חור בקצה הסופי של הביצה.
5. תקעו חור נוסף ליד המעגל המצויר על הצד המחודד של הביצה. הסר חתיכה קטנה של קליפת החיצונית (כ 16 מ"מ ² ) עם מחט 19G ולאחר מכן להסיר חתיכה קטנה של קליפת הביצה הפנימית (כ 8 מ"מ ² ) עם מלקחיים.
6. עם מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 19G, למשוך 1.5-2.5 מ"ל של אלבומין מהביצה דרך חור קהה סוף. הקפד זווית המחט למטה ב 45 °.
7. מכסים את החור הקצה בקצה עם חתיכת סרט קטנה (1 ס"מ x 1 ס"מ). לכסות את המעגל נמשךד החור השני עם קלטת (2.5 ס"מ x 4 ס"מ).
8. עם מספריים מעוקל (חיתוך קצה = 2.5 ס"מ), לחתוך חלון בתוך המעגל. מספריים צריך להיות מקביל קליפה ואת הקוטר של החלון צריך להיות פחות מ 2 ס"מ.

4. הזרקה פלסמיד

1. הפעל את picospritzer. הגדר את הלחץ 18 psi ואת משך עד 5 μs. הפעל את טנק אוויר מנורה עבור מיקרוסקופ לנתיחה.
2. הפוך פתרון 30 מ"ל המניות של דילול 1:10 של חנות קנה דיו הודי מעורבב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חנות ב 4 ° C. הזרקת דיו הודית היא צעד חשוב כדי לקבל הדמיה טובה יותר של העובר עוף.
   1. ממלאים מזרק 1 מ"ל עם פתרון דיו הודי מדולל. צרף מחט 27G ו לגרש כל הבועות כי הם נמצאים מזרק.
   2. הכנס מחט רק מתחת לממברנה חלמון ~ 2 - 3 מ"מ מן העובר להזריק ~ 0.2 מ"ל של דיו הודית בעדינות מתחת לעובר. לַעֲשׂוֹתלא להזריק יותר מ 0.5 מ"ל של דיו הודית כפי שהוא עשוי להקטין את הישרדות העובר.
3. מניחים את הביצה בחלון על בעל ביצה מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. השתמש ההגדלה הגבוהה ביותר עבור הדמיה הטובה ביותר של האתר הזרקה פלסמיד.
4. בעזרת מלקחיים, להסיר את הממברנה על אזור ההזרקה. אזורי שמיעה שמיעה של אינטרסים ( כלומר , NM ו- NL) נובעים Rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). R5 / R6 ממוקמים סמוך לאוטוציסט (מבנה עוברי בחוליות המתפתח באוזן הפנימית), המשמשים כציוני דרך עבור זריקות פלסמיד R5 / R6.
5. להנמיך את פיפטה מלא DNA לתוך הצינור העצבי שמעל אזור R5 / R6 ובין otocysts באמצעות micromanipulator. סכמטי של מיקום אידיאלי מוצג באיור 1 א .
6. החל לחץ אוויר (18 psi, 5 μs משך) מן picospritzer להוציא את ה- DNA של הצינור העצבי.

5. Electroporation

1. הפעל את tהוא הנוכחי / מתח ממריץ.
2. מלאו מזרק 3 מ"ל עם PBS ו לצרף את מסנן מזרק. הוסף 1-2 טיפות של PBS על העובר.
3. להנמיך את האלקטרודה דו קוטבית לעובר באמצעות micromanipulator עם האלקטרודה השלילית מעל האתר ההזרקה (המדיאלי) ואת האלקטרודה חיובית לרוחב R5 / R6 ( איור 1 א ). הימנע מגע ישיר עם העובר. השתמש אלקטרודות דו קוטבית שבו חומר האלקטרודה הוא אירידיום פלטינה. התאם את המרווח בין הטיפים 0.5 מ"מ עם מלקחיים.
4. באמצעות מתח הנוכחי / מתח, דופק 20 פעמים ב 50 V עבור 1 אלפיות השנייה במרווחים של 1.
5. לאחר electroporation, להוסיף טיפה אחת של PBS על פני השטח חשוף. בעדינות להסיר את האלקטרודה ולנקות אותו עם רקמה מעבדה 70% אתנול. סגור את החלון לחשוף את העובר עם קלטת.
6. תווית ביצה עם סוג פלסמיד מוזרק ואת תאריך הצוהר.
7. מקום ביצים בחזרה לתוך חממה עם הצד החלון למעלה. דגירה על 38 מעלות צלזיוס עם 50לחות עד לשלב ההתפתחות הרצויה.
8. אם וקטור טט על הוא electroporated לשליטה הזמנית של ביטוי גנים, להחיל Doxycycline (Dox) כל 24 שעות כדי לעורר ביטוי גנטי (ראה סעיף 6).

6. Tet על מערכת עבור שליטה זמנית של ביטוי גנים

1. השתמש פלסמידים הבאים:
   PCAGGS-T2TP: טרנספוזאז להביע פלסמיד.
   PT2K-CAGGS-rtta-M2: פלסמיד כי ביציבות מבטא את חלבון דוקס מחייב.
   PT2K-BI-TRE-EGFP: פלסמיד המכיל מקדם דו-כיווני דו-כיווני (TRE), המביא לידי ביטוי את הכתב של EGFP ואת הגן השני המעניין.
   הערה: שלוש פלסמידים לעיל צריך להיות שיתוף electroporated ביחס 1: 1: 1.
2. הכנת פתרון המניות:
   1. ממיסים Dox סטרילי PBS לייצר פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​המניות. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
3. יישום Dox:
   1. כדי לעורר את האקספרסיביותN של הגן של עניין במהלך שלבי התפתחות מסוימים, להחיל Dox כל 24 שעות.
   2. כאשר החלת Dox, לקחת את הביצה החוצה, לפתוח את החלון, פיפטה 50 Dox μL על הממברנה chorioallointoic, לסגור את החלון והכניס את הביצה בחזרה לתוך החממה.

הכנת אזור הניתוח לפרוסות גזע המוח

הערה: הסעיפים הבאים (7 - 9) והנהלים פורסמו לפני ¹⁴ . עיין בפניות אלו לקבלת מידע חזותי נוסף.

1. הכן פתרון אגר (40 מ"ג / מ"ל ​​agarose, כלומר 4% ב DDH ₂ O). יוצקים פתרון אגר לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לחזק בטמפרטורת החדר. חנות מכוסה צלחת אגר במקרר לשימוש עתידי במהלך חיתוך גזע של רקמה.
2. רציף בועה מלאכותית של המוח השדרה (ACSF) עם 95% O ₂ ו 5% CO ₂ (pH 7.2-7.4 ו osmolarity: 295-310 mOsm / L).
3. נקו את אזור העבודה ואת vibratome עם EtOH 70% ולשטוף את הלהב עם מים מזוקקים.
4. מניחים משטח קליטת נוזל נקי על אזור העבודה עם כלי הניתוח המתאים.
5. קח את צלחת אגר מתוך המקרר, לחתוך קוביית אגר קטן (10 מ"מ x 10 מ"מ x 8 מ"מ). דבק את גוש אגר אל הבמה של החדר vibratome-sllicing באמצעות סרגלינג זמין מסחרית.

8. בידוד של עוף אודיורי המוח

1. פתח את הביצה באתר החלון מוקלט. לנקב את שק הממברנה עם אזמל ולהסיר את הראש של העוף עוף.
2. לערוף את העוף במספריים חדים.
3. מניחים את קצה הלהב מעט אחורי לעיניים. חתך דרך הגולגולת על קו האמצע מקורי אל הזנב. החל לחץ קל בהתאם לגיל העובר. עוברים מבוגרים דורשים יותר לחץ.
4. בעדינות לדחוף הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת ולאמת לחתוך קו האמצע.
5. הגשת בקשהלחץ trong, פרוסת החלק מקורי של הגולגולת עם סכין גילוח. מיד מקום להב האחורי לעיניים לחתוך דרך הגולגולת כולה ורקמת המוח.
6. הפוך חתכים midline ל-לרוחב עם מספריים באזור הזנב של הגולגולת, שרירי הצוואר הקדמי מעט על שני צידי הראש.לגלות המוח והמוח על ידי משיכת משם הגולגולת ורקמות עודף.
7. חותכים רקמות המצורפות גזע המוח עם מספריים ולהסיר את גזע המוח, אשר חופשיים חופשי מן הגולגולת.

9. הכנת פרוסות גזע עבור ויוו Electrophysiology או הדמיה

1. להצמיד את המוח דרך tecta אופטי.
2. הסר את המוח הקטן על ידי חיתוך peduncles עם מספריים, לחשוף את הרצפה של החדר הרביעי.
3. בעזרת פינצטה, להסיר את כל רקמות קרום וכלי הדם משטח גזע המוח.
4. כדי לחסום את גזע המוח, לעשות חתך אופקית בקצה מקורי ביותר של הרצפה של הארבעההחדר, רק הזנב אל קליפת המוח. הפוך חתכים לרוחב בניצב דרך tecta אופטי לבודד את גזע המוח.
5. מניחים כמות קטנה של דבק סופר על שלב vibratome ישירות מול בלוק אגר.
6. הרם את גזע המוח על חוט השדרה באמצעות פינצטה ומניחים אותו על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי לכיוון להב vibratome. הסר דבק עודף עם רקמות מעבדה או נייר סינון.
7. יוצקים ACSF חמצן לתוך שלב vibratome. הגדר את הלהב vibratome בזווית 20-22 מעלות. התחל vibratome ב-תנודה משרעת מקסימלית. להזיז את הבמה כלפי הלהב כך החלק העליון של הרקמה מקביל עם הלהב.
8. העבר במהירות להב אל רקמת המוח. להאט את הלהב במידה ניכרת לפני מגע הלהב עם רקמות.
9. פרוסת רקמה עם המהירות האיטית ביותר האפשרית קדימה. לאחר להב הוא דרך כל החלק רקמות העטרה, בעדינות להסיר את הפרוסה באמצעות פיפטה העברת/ Li>
10. תחתון את הבמה 200-300 מיקרומטר ו פרוסת שוב. חזור על עד ציוני דרך אנטומיים של גרעיני השמיעה להיות גלוי, למשל, באזור neuropil הגב / הגחון נפרדת של NL ואת המיקום המדיאלי של NM ביחס NL.
11. בזהירות לשמור על פרוסות ACFS. זה יכול להיעשות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) או ליד תנאים פיזיולוגיים (~ 41 מעלות צלזיוס) באמצעות אמבט מים חמים. הערה סדר חיתוך. הפרוסה הראשונה מתאימה לאזור הזנב ביותר של רקמות הפרוסה האחרונה מתאימה לאזור מקורי ביותר. זה מייצג בצורה גסה את הארגון הטונוטופי של גזע המוח השמיעתי, מאזורי קידוד נמוכים לתדר גבוה, בהתאמה.

תוצאות

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A

Discussion

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo ^{8 , 9} . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי ⁸ . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm