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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Zusammenfassung

Neurotrauma und neurodegenerativen Krankheiten führen oft bleibende neurologische Ausfälle aufgrund der begrenzten Kapazität des zentralen Nervensystems (ZNS) zu ersetzen verlorene Neuronen und axonalen Wege zu regenerieren. Jedoch treten während der Entwicklung des Nervensystems, neuronale Migration und axonalen Erweiterung oft entlang von wegen, die von anderen Zellen gebildet, als "lebende Gerüste" bezeichnet. Bestrebt, diese Mechanismen zu emulieren und eine Strategie zu entwerfen, die die hemmende Umwelt des ZNS umgeht, dieses Manuskript stellt ein Protokoll zu fertigen Gewebezüchtungen Astrozyten-basierte "lebenden Gerüste". Um diese Konstrukte zu erstellen, haben wir ein neuartiges Biomaterial Encasement Schema induzieren Astrozyten, in dichten dreidimensionalen Bündel von bipolaren längs ausgerichtet Somata und Prozessen selbst zusammensetzen beschäftigt. Erste, hohlen Hydrogel Mikro-Spalten wurden zusammengestellt, und im Inneren Lumen mit extrazellulären Kollagen-Matrix beschichtet wurde. Dissoziierte zerebrale kortikale Astrozyten lieferten dann in das Lumen der zylindrischen Mikro-Spalte und mit einem kritischen inneren Durchmesser von < 350 µm, spontan selbst ausgerichtet und beauftragt, lange Faser-wie Kabel bestehend aus dichten Bündel produzieren Astrozyten Prozesse und Kollagen-Fibrillen Messung < 150 µm im Durchmesser noch mehrere cm in der Länge erweitern. Diese entwickelt lebenden Gerüste ausgestellt > 97 % Zelle Lebensfähigkeit und wurden fast ausschließlich bestehend aus Astrozyten eine Kombination des intermediate Filament Proteine glial fibrillary sauren Proteins (GFAP), Vimentin, zum Ausdruck zu bringen und nestin. Diese ausgerichtet Astrozyten Netzwerke für neuronalen Anlage zu einem freizügigen Substrat gefunden wurden und Neurit Erweiterung ausgerichtet. Darüber hinaus erhalten diese Konstrukte Integrität und Ausrichtung, wenn die Hydrogel-Ummantelung, eignen sich für die CNS Implantation entnommen. Diese vorgeformten Konstrukte emulieren strukturell wichtigsten Cytoarchitectural Elemente des natürlich vorkommenden Glia-basierte "living Gerüste" in Vivo. Als solche können diese veränderter lebenden Gerüste dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen in Vitro zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration durch die Leitung der neuronalen Migration und/oder axonalen Wegfindung nach CNS Degeneration in-vivo .

Einleitung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) hat eine begrenzte Kapazität gegen Verlust und/oder Funktionsstörungen der Nervenzellen und axonalen Signalwege, die Bedingungen wie Schädel-Hirn-Verletzungen (SHT), begleiten Schlaganfall, Rückenmark Verletzungen (SCI) und Neurodegenerative Krankheit1 ,2,3,4,5. Neurogenese im ZNS beschränkt sich auf eine begrenzte Anzahl von Bereichen im Gehirn behindern die Wiederherstellung der verlorenen Neuronen6,7. Darüber hinaus ist Regeneration der verlorenen axonalen Wege im ZNS nicht ausreichend durch das Fehlen einer gezielten Führung, das Vorhandensein von Auswuchs Inhibitoren und reaktive Astrogliosis nach Schäden an Nervengewebe2,8, 9,10. Astrozyten haben in der Regel diverse Funktionen bei der Unterstützung der Neuronen mit Ionen-Homöostase, Neurotransmitter-Clearance, Synapse Bildung und neurovaskuläre Kopplung11. Dennoch können Astrozyten nach auch leichte Schäden an Nervengewebe, molekulare, strukturelle und funktionelle Veränderungen unterziehen, um eine hypertrophe staatliche11Übergang. Als Reaktion auf schwere Neurotrauma führen diese Veränderungen bei der Bildung einer Narbe mit einer Penumbra, Migration von reaktiven Astrozyten und eine Läsion Kern, der Leukozyten von der geplatzten Blut - Hirn-Schranke (BBB), Mikroglia durchgesickert enthält enthält, Oligodendrozyten und Fibroblasten11,12,13. Diese reaktive Astrocyten erreichen eine Morphologie des faserigen, ungeordnete Prozesse und zeigen erhöhte Expression von intermediate Filament Proteine und Chondroitinsulfat Proteoglycans (CSPGs), die neurale Regeneration12behindern. Obwohl die glial Narbe anfangs hilft BBB Integrität wiederherzustellen und Übertragung der Entzündungsreaktion umliegenden gesunden Gewebes zu vermeiden, dient es als biochemische und physikalische Barriere gegen Axon Regeneration12,14 ,15,16. Zum Beispiel Axone, die Begegnung die glial Narbe bauchige dystrophischen Wachstum Kegel anzeigen und verkümmert Wachstum12. Darüber hinaus behindert die Desorganisation der astrocytic Prozesse nach einer Verletzung die Verlängerung der regenerierende Axone17. Das Ergebnis dieser hemmenden Eigenschaften manifestiert sich in der oft dauerhafte körperlichen und neurologischen Beeinträchtigungen, die Patienten nach schweren Neurotrauma leiden, einschließlich TBI und Sci.

Unabhängig von der äußeren Herausforderungen funktionelle Regeneration im ZNS nachweislich die Axone besitzen eine intrinsische Fähigkeit zu regenerieren. Zum Beispiel zufolge die dynamische Natur der dystrophischen Wachstum Kegel in Kontakt mit der glial Narbe diese Endungen behalten ihre Fähigkeit,12zu erweitern. Infolgedessen wird es vermutet, dass als wichtigste Hindernis für axonalen Nachwachsen der hemmenden Umwelt der posttraumatischen CNS und Bereitstellung einer großzügigeren Umgebung über Reduktion glialen Narbenbildung und/oder sofern regenerative Brücken über die Narbe wäre vorteilhaft. In der Tat haben Studien gezeigt, dass ZNS-Neuronen waren in der Lage, die Ausweitung der Axone durch eine Läsion mit peripheren Nerv Transplantationen als Brücken, die ein günstigeres Umfeld für Axon Regeneration12,18zu präsentieren, 19. Mehrere andere Strategien haben verfolgt, um diese verkümmerte Regenerationsfähigkeit zu nutzen. Manipulation der Zelle Wachstum Signalwege in verschiedenen Verletzungen resultieren beispielsweise axonalen Regeneration und glial Narbe Reduktion10,20,21. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Behandlung mit Chrondroitinase ABC, die den Großteil der Zuckerketten in CSPGs zerspaltet, die hemmende Wirkung von CSPGs abgesondert durch reaktive Astrocyten22verringert. Trotz ermutigender Ergebnisse, diese Ansätze bieten keine Führung des Wachstums Zapfen, gerichtet, die potenziell aberrierende Regeneration12führen kann, und auch nicht für den Verlust von Neuronen zu berücksichtigen. Zell-basierte Ansätze wurden genutzt, bei versuchen, die Auswirkungen der glial Narbe zu überwinden und um verlorene Zellen, vor allem Neuronen wieder aufzufüllen. Einige Gruppen haben entdifferenzierten reaktive Astrocyten in Neuronen, während andere neurale Vorläuferzellen in CNS Läsionen zum repopulate Bereich Verletzungen und zur Förderung Axon Regeneration23,24, , verpflanzt haben 25. Stammzelltransplantation allein ist jedoch durch die niedrigen Überlebensraten, mangelhafte Integration und bescheidenen Retention in das geschädigte Gewebe5begrenzt. Darüber hinaus nicht diese Zell-basierte Strategien Fernverkehr axonalen Landstriche, vor allem in einer kontrollierten Weise wiederherzustellen. Daher als Lieferfahrzeuge für verschiedene neuronale Biomaterialien in Kombination mit anderen Ansätzen erforscht und Vorläuferzellen und Wachstum Faktoren26. Biomaterial-basierte Ansätze verfügen über ein hohes Maß an Design-Steuerung, Konstrukte zu produzieren, die die spezifischen körperlichen, Haptotaxic zu imitieren, und chemotaxic Hinweise in der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung der Ziel-Host Gewebe27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduktion von diesen Umweltsignale ist von größter Bedeutung für die transplantierten Zellen, Native-ähnliche Morphologie, Proliferation, Migration und Signaltechnik, unter anderen neurobiologischen Eigenschaften29zu präsentieren. Trotz dieser vorteilhaften Eigenschaften ist Fortschritt jenseits traditioneller Zelle ausgesät Biomaterial Gerüste erforderlich, um gleichzeitig Regie Fernverkehr axonalen Regeneration fördern und ersetzen verlorene Neuronen.

Eine vielversprechende alternative Ansatz basiert auf Nervengewebe entwickelt "lebenden Gerüste", unterscheidet sich von anderen Zell-basierte Ansätze aufgrund des Vorhandenseins von lebenden Nervenzellen mit einem vorgeformten Cytoarchitecture, die native Neuroanatomie emuliert und/oder Entwicklungsmechanismen gezielte Ersatz, Wiederaufbau und Regenerierung der neuralen Schaltkreis4,35zu erleichtern. Überlegungen für die Gestaltung von lebendigen Gerüste gehören die Phänotypen und Quellen von neuronalen Zellen sowie die mechanische/physikalische Eigenschaften und die biochemische Signale durch die Zusammensetzung der begleitenden Biomaterialien35diktiert. Nach Fertigung in Vitro, diese lebenden Gerüste können implantiert in Vivo vorhanden Zelle Adhäsionsmoleküle und chemotaktische und neurotrophe Signale zum neuronalen Zellwanderung und Axon Auswuchs je nach Zustand aktiv regulieren und Fortschreiten der regenerativen Prozesse35. Gliazellen dienen als Grundlage für die veränderter Cytoarchitecture lebenden Gerüste, da diese Zellen verschiedene Entwicklungsmechanismen in Vivozu vermitteln. Während der Entwicklung des Gehirns setzen neue Neuronen auf basalen Prozesse durch radiale Gliazellen aus der ventrikulären Zone in Richtung der Entwicklung kortikale Platte als lebende Gerüste für gerichtete Migration36,37erweitert. Darüber hinaus erweitern Wachstum sind Zapfen gezeigt, sich zu orientieren, durch Sensierung attraktiv und abweisend Signale ausgelöst durch Wegweiser Glia-Zellen, und sogenannte "Pionierarbeit" Axone werden vorgeschlagen, um die richtigen Ziele zu erreichen, durch die Ausdehnung entlang Pre-gemusterten Glia 35,38,39Gerüste. Gliazellen sind also notwendig, um die Führung des bahnbrechenden Axone, die später als Axon-basierte dienen "lebenden Gerüste" um die Projektion der "Mitläufer" Axone leiten. Darüber hinaus Glia-vermittelten Wachstum Mechanismen haben gezeigt, dass postnatal, fortbestehen folgendermaßen Neuroblasten rostral wandernden Stream (RMS), aus der subventricular Zone (SVZ), einer der wenigen verbliebenen Bereiche der Neurogenese im erwachsenen Gehirn zu navigieren die Riechkolben (OB)40. Diese Neuroblasten in der RMS migrieren innerhalb der Glia Röhre (Abbildung 1A-1), die besteht aus längs ausgerichteten astrocytic Prozesse, über direkten Zell-Zell-Verwachsungen und lokalisiert lösliche Faktoren37, 41. schließlich während CNS Schäden in Säugetieren Ursachen astrocytic Prozess Anordnung bilden eine glial Narbe, die körperlich axonale Regeneration17 gestört behindert, viele nicht-Säugetier-Systemen fehlt die Bildung einer nachteiligen glial Narbe. Vielmehr pflegen Gliazellen des nicht-Säugetier-Arten mehr organisiert, ausgerichtet von Mustern, die als Führer durch die verletzte Region17,42,43verwendet werden. Zum Beispiel nicht-Säugetier-SCI-Modelle, Axone entnehmen Sie bitte weiter in enger Zusammenarbeit mit Glia Brücken über der Läsion, schlägt eine wichtige Rolle für organisierte Glia Gerüste als Erleichterung der axonalen Regeneration und funktionelle Wiederherstellung (Substrate Abbildung 1A -2) 42 , 44 , 45. Reprise der neuroanatomischen Eigenschaften und die Entwicklungs-/regenerative Mechanismen, die oben beschriebenen kann dies zu eine neue Klasse von veränderter Glia-basierte lebenden Gerüste, die unreif neuronalen Migration gleichzeitig fahren können und axonalen Wegfindung durch ansonsten freizügigen Umgebungen, damit potenziell Minderung der Auswirkungen von neuronalen und Axon Trakt Degeneration mit CNS Verletzung und Krankheit verbunden.

Unsere Forschungsgruppe hat bereits mehrere Arten von lebenden Gerüste für den Wiederaufbau entworfen und Regeneration der axonalen Traktate in das ZNS und das periphere Nervensystem (PNS) über Micro-Gewebe entwickelt, neuronale Netze (Mikro-TENNs) und Gewebe Nerv Transplantationen (TENGs) bzw.27,46,47,48entwickelt. Beide Strategien basieren grundsätzlich auf Biomimicry. Mikro-TENNs sind anatomisch inspirierte Strukturen strukturell und funktionell axonalen Traktate verbinden unterschiedliche neuronale Populationen des Gehirns ersetzen soll. TENGs ausnutzen den Entwicklungsbiologie Mechanismus der Axon erleichtert axonalen Regeneration, veranschaulicht durch "Mitläufer" Axon Wachstum entlang "Pionier" Axone, gezielte Host axonalen Regeneration35,46,48zu erreichen. Wir vor kurzem auf die Vielseitigkeit des Gerüstes lebenden aktiviert Technik mit einem ähnlichen Schema Ummantelung als Mikro-TENNs und inspirieren von den Glia-basierte Mechanismen zu präsentieren, während der gesamten Entwicklung. Hier haben wir Konstrukte bestehend aus ausgerichteten astrocytic Bündel überspannt das kollagene Lumen ein Hydrogel Mikro-Spalte49entwickelt. Diese astrocytic lebenden Gerüste werden von ersten füllen eine Kapillare Rohr-Akupunktur Nadel Montage mit flüssige Agarose Erstellen einer hohlen zylindrischen Hydrogel mit einem Außendurchmesser (OD) und Innendurchmesser (ID) entspricht der Durchmesser der entwickelt die Schlauch und Nadel, beziehungsweise. Nach Agarose Gelierung und Extraktion der Hydrogel Mikro-Spalte aus der Kapillare, die innen hohl ist beschichtet mit Typ ich Kollagen, ein Umfeld für Astrozyten Adhäsion permissive liefern und ausgerichtet Bundle Bildung (Abbildung 1 b -1). Danach ist das Lumen mit zerebrale kortikale Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (Abbildung 1 b-2) ausgesät. Im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Ausrichtung Techniken, die auf die Anwendung von elektrischen Feldern, Micropatterned Rillen und extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Strukturierung, Astrozyten Ausrichtung in die lebendige Gerüst stützt sich Technik auf Selbstmontage nach steuerbare Variablen wie Substrat Krümmung (Spalte ID), Zelldichte und Kollagen Konzentration50,51,52. Die Astrozyten Vertrag umzugestalten das Kollagen und erwerben eine bipolare, längs ausgerichtet Morphologie, die analog zu den natürlichen Gerüste in Vivo (Abbildung 1 b-3) beobachtet. In der Tat verfolgen wir aktiv den Einsatz dieser Kabel-ähnliche Strukturen als physische Substrate für gezielte Führung des Migration unreifer Nervenzellen sowie Erleichterung der axonalen Regeneration durch die ungünstigen Umfeld des beschädigten ZNS, insbesondere die Säugetier-glial Narbe (Abbildung 1). Dieser Artikel wird die detaillierte Herstellungsverfahren für die astrocytic Mikro-Spalten präsentieren, phase Kontrast und Immunfluoreszenz Bilder von der erwarteten Cytoarchitecture und eine umfassende Diskussion über die aktuellen Beschränkungen und zukünftige Richtungen von der Technik.

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Abbildung 1: Inspiration, Herstellung Protokoll und vorgeschlagenen Anwendungen für die ausgerichteten Astrocytic Netzwerke. (A) neurobiologische Inspiration: (1) Neuroblasten aus der neurogenen subventricular Zone (SVZ) nutzen das längs ausgerichtete Glia Rohr in den rostral wandernden Stream (RMS) für gerichtete Migration in den Riechkolben (OB); (2) nicht-Säugetiere wie Amphibien und Fischen verträgt Regeneration nach Nervengewebe Schäden teilweise durch die Bildung einer Glia Brücke, die verbindet die Enden einer Läsion (z.B. durchtrennten Rückenmark) und dient als Gerüst für die Führung des regenerierende Axone. (B) Herstellung Übersicht: (1) Bau einer Mikrometer Größe, hohlen Hydrogel Mikro-Spalte mit dem Lumen mit ECM, beschichtet (2) Aussaat von primären kortikalen Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (3) Selbstmontage der längs-orientierte Bündel in Kultur und (4) Extraktion des Bundles aus Biomaterial-Ummantelung für zukünftige Implantation Studien. (C) In Vivo Anwendungen: (1) diese lebenden Gerüste können dienen als veränderter Glia Rohre für gerichtete Neuron Migration von neurogenen Zentren Neuron-defizienten Regionen; neu aufzufüllen (2) Reprise des developmental Mechanismus von zukunftsweisenden Axon Guidance und der regenerativen Mechanismus der Glia Brücken in nicht-Säugetiere kann diese astrocytic Gerüste mit einer Kapazität von Axon Regeneration über die non-permissive direkte verleihen. Umgebung der Säugetier-glial Narbe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protokoll

Alle Verfahren wurden durch die institutionelle Animal Care and Verwendung Ausschüsse an der University of Pennsylvania und Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und den Vorgaben in der NIH Public Health Servicepolitik auf Humane eingehalten Pflege und Verwendung von Labortieren (2015).

1. Entwicklung der Agarose Hydrogel Micro-Spalten

  1. Machen Sie eine Agarose 3 % Gewicht/Volumen (w/V) Lösung durch Wiegen 3 g Agarose und Übertragung auf eine sterile Becher mit 100 mL Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Das Becherglas eine sterile magnetischen Bar hinzu, und legen Sie es auf der Oberfläche der Heizplatte/Rührer. Halten Sie den Becher abgedeckt, um die Verdunstung des Inhalts im nächsten Schritt zu verhindern.
  2. Die Agarose und DPBS bei einer Temperatur von 100 ° C erhitzen und bei 60-120 u/min rühren. Passen Sie diese Einstellungen nach Bedarf an, und überwachen Sie das Fortschreiten der Auflösungsprozess ständig zu, wie die Lösung zunächst von undurchsichtigen, ein klares Erscheinungsbild ändert, das bedeutet, dass die Agarose komplett aufgelöst worden ist.
    Vorsicht: Heiße Becher und die Lösung sind heiß!
  3. Da die Agarose-Lösung erhitzt und gerührt, vier leere 10 cm Petrischalen abrufen und zwei davon 20 mL des DPBS hinzufügen. Setzen von Akupunkturnadeln (Durchmesser: 300 µm, Länge: 40 mm), Glas-Kapillarröhrchen Mikroliter (Durchmesser: 701,04 µm, Länge: 65 mm, Kapazität: 25,0 µL), und eine Birne Spender innerhalb der Biosicherheit Kabinett. Wenn die flüssige Agarose-Lösung löscht, pflegen Sie konstant bei etwa 50 ° C erhitzen und rühren um Gelierung der Agarose zu vermeiden.
  4. Eine Akupunktur-Nadel in die untere Öffnung des Spenders eine Glühbirne einführen. Legen Sie ein Kapillarröhrchen über die Nadel nach außen ausgesetzt. Sichern Sie das Kapillarrohr Abschnitt Kautschuk von der Glühbirne Dispenser Zylinder Teil davon eingehen.
  5. Übertragen Sie 1 mL flüssige Agarose mit einer Mikropipette an der Oberfläche eine leere Petrischale zu, und platzieren Sie ein Ende des Kapillarröhrchens vertikal (mit der Nadel) Kontakt mit Agarose, während die Gummikappe des Dispensers Birne ist nach innen eingeklemmt wird. Lassen Sie langsam den Druck auf die Glühbirne Dispenser GAP Agarose in der Kapillare zu ziehen.
    Hinweis: Der Transfer von flüssige Agarose in den Kapillaren muss schnell erfolgen. Wenn der flüssige Agarose gelassen wird auf der Petrischale Oberfläche ausreichend Zeit abkühlen (ca. 60 s), es beginnt zu gelieren, geeignete Absaugen von der Agarose entlang der Kapillare zu verhindern.
  6. Statt jede Birne-Rohr-Nadel-Assembly in einer freien Petrischale und lassen Sie die Agarose-gel innerhalb der Kapillare zu festigen für 5 min. ziehen Sie vorsichtig das Kapillarrohr mit den Händen aus den Gummistopfen in die Birne Dispenser Zylinder, verlassen die Nadel und die Agarosegel im Ort im Inneren des Rohres.
  7. Manuell extrahieren der Akupunkturnadel durch das Kapillarrohr langsam herausziehen; die neu erstarrten Agarose-Zylinder gleitet auch aus der Tube in diesem Verfahren noch rund um die Nadel. Schubsen Sie sanft die Mikro-Spalte entlang der Akupunkturnadel mit der Spitze des sterilen Pinzette ans Ende. Platzieren Sie die Nadel über einen offenen, DPBS enthaltende Petrischale und die DPBS schieben Sie die Mikro-Spalte mit der Pinzette.
    Hinweis: Bleibt die Agarose Mikro-Spalte in das Glas Kapillarröhrchen nach Entfernung der Akupunktur-Nadel, drücken Sie langsam die Agarose Mikro-Spalte aus der Kapillare mit einem 25-mm-Gauge-Nadel und in die Schüssel mit DPBS.
  8. Microscalpels oder Zange mit einem heißen Perle Sterilisator zu sterilisieren. Machen Sie 4 % w/V Agarose, indem mit einem Gewicht von 4 g Agarose und auf 100 mL des DPBS übertragen. Hitze und rühren Sie wie in Schritt 1.2 eine klare 4 % flüssige Agarose-Lösung zu erhalten. Pflegen Sie heizen und rühren der Lösung in den folgenden Schritten.
  9. Übertragen Sie die Petrischalen mit Mikro-Spalten zu einer Dissektion Kapuze und verschieben Sie eine Mikro-Spalte mit feinen Zangen an eine leere Petrischale. Nutzen Sie das Stereoskop für visuelle Führung und eine Microscalpel, die Mikro-Spalten auf die gewünschte Länge geschnitten. Schneiden Sie beide Enden auf Form abgeschrägten enden in 45o Winkeln von der horizontalen zur leichteren Handhabung der Mikro-Spalten bei ECM und Zelle Zugabe zu.
  10. Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für drei weitere Mikro-Spalten in der gleichen Petrischale und richten Sie die vier Gebäudemodule parallel mit einer Trennung von < 3 mm zwischen den einzelnen Zylinder. Das Mikro-Spalte-Array zu verbinden und bündeln die Konstrukte in Vierergruppen eine Ader/Linie der Flüssigkeit übergießen und laden 50 µL 4 % Agarose-Lösung mit einer Mikropipette (im folgenden genannt "Mikro-Spalte Boote"). Vermeiden Sie Bewegungen von 4 % Agarose bis an die Enden der Mikro-Spalten, die den Innenraum verstopfen können, indem der Abstand zwischen den Konstrukten zu minimieren und die Agarose schnell in einer dünnen Linie.
    Hinweis: Vermittlung von Gruppen von vier Mikro-Spalten in "Boote" ist nicht verpflichtet den astrocytic Gerüste zu fabrizieren. Dennoch dienen die Boote um den Fertigungsprozess zu beschleunigen und einen sichereren Weg zu bewegen und zu handhaben Mikro-Spalten in späteren Schritten zu bieten.
  11. Lassen Sie den Mikro-Spalte Boot Abkühlen für 1-2 min Gelierung der zusätzlichen 4 % Agarose zu ermöglichen. Abholen der Mikro-Spalte-Boot mit feinen Zangen durch die Verbindungstür 4 % Agarose, und Mikro-Spalten in der anderen DPBS enthaltende Petrischale vorbereitet im Schritt 1.1.3 verschieben. Weitere Boote mit den übrigen Mikro-Spalten wie gewünscht zu fabrizieren.
  12. Bewegen Sie die Petrischalen mit Mikro-Spalten und/oder Boote, eine biologische Kabinett und mit der Exposition gegenüber ultravioletter (UV) Licht für 30 min. sterilisieren.
    Achtung: Tragen Sie geeignete UV-Exposition zu verhindern.
  13. Die Gerichte mit der Mikro-Spalte-Boote in DPBS bei 4 ° C zu speichern, wenn ECM Addition und Zelle Beschichtung nicht sofort erfolgt danach, bis zu 1 Woche. Die Mikro-Spalte Fertigungsschritte zu wiederholen, wenn die Konstrukte, die während dieses Zeitraums nicht verwendet werden.

2. primäre Zellkultur und Isolation

  1. Kortikale Astrozyten Isolation von Ratte Welpen
    1. Fügen Sie in Vorbereitung auf die folgenden Schritte 20 mL Hank Salzlösung (HBSS), vier 10 cm Petrischalen ausgeglichen, das als Reservoir für die seziert Gewebe dienen wird. Halten Sie alle Gerichte auf Eis. Saubere Chirurgische Scheren, Pinzetten, Mikro-Spachtel und Mikro-Skalpelle in einem heißen Perle Sterilisator zu sterilisieren.
    2. Prewarm 0,25 % Trypsin mit 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) und 0,15 mg/mL Deoxyribonuclease (DNase) ich in HBSS bei 37 ° C. Darüber hinaus prewarm die Astrozyten Nährmedium bei 37 ° C, die von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Hams f-12 Nährstoff Gemisch mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) besteht.
    3. Postnatale Tag 0 oder 1 Tag Sprague-Dawley Ratten Welpen durch Belichten sie unterkühlt Bedingungen zu betäuben, und einschläfern durch Enthauptung. PIN der Kopf in eine Bühne mit einem 19 mm gauge Nadel in die Schnauze vor den Augen.
    4. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell in der Mitte posterior, anterior, von der Basis des Halses bis hinter die Augen. Ein weiterer Einschnitt gehen seitlich von direkt hinter den Augen nach unten, eine T-Form durchführen. Verwenden Sie feine Pinzette, um der kranialen Haut/Schädel zur Seite abziehen.
    5. Halten Sie den Kopf durch die Schnauze (nach oben), indem man eine Zinke der Zange in den Mund des Tieres und die andere auf der äußeren Oberfläche. Entfernen Sie das Gehirn mit einem sterilen Mikro-Spachtel zu und legen Sie sie in einem der Petrischalen gefüllt mit gekühltem HBSS. Ort dieser Petrischale auf Eis Mal sofort danach und überhaupt außer wenn gebräuchlich.
    6. Einen Granitblock zuvor gespeichert bei-20 ° C unten ein Stereoskop innerhalb einer Dissektion Haube zu verorten. Legen Sie die Petrischale mit Hirngewebe auf der Oberfläche der Granitblock, seine niedrige Temperatur während des Verfahrens der Dissektion zu bewahren. Verwenden Sie das Stereoskop als visuelle Führung in den folgenden Schritten.
    7. Wenn die olfaktorischen Birnen intakt bleiben, extrahieren sie durch Schneiden mit Zange oder Microscalpels. Darüber hinaus verwenden Sie ein Microscalpel, das Kleinhirn zu entfernen und einen Mittellinie Schnitt trennt die beiden Gehirnhälften zu machen. Übertragen Sie die Halbkugeln mit der Pinzette auf einer Petrischale mit frischen, gekühlten HBSS.
    8. Zerlegen Sie die Mittelhirn Strukturen aus dem Inneren der Hemisphären mit einer Microscalpel, nur die getrennten Cortex zu erhalten. Verwenden Sie feine Pinzette, der Hirnhäute, ein Blatt-artige Struktur aus dem kortikalen Gewebe abziehen und die isolierte Cortex auf eine neue Petrischale mit kalten HBSS übertragen. Verwenden Sie die Microscalpel, das Gewebe um die Fläche für Trypsin-Aktion im nächsten Schritt erhöhen Blatt vor den Mund.
    9. Verwenden Sie eine Pasteurpipette die Cortex auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL vorgewärmte Trypsin-EDTA (8 Cortex in jedem Röhrchen) übertragen. Aussetzen der kortikalen Gewebes Trypsin-EDTA 5-7 Minuten bei 37 ° C.
    10. Mit einer Pasteurpipette vorsichtig entfernen die Trypsin-EDTA und 400 µl von 0,15 mg/mL DNAse ich Lösung für die Zentrifugenröhrchen. Schütteln des Rohres oder Wirbel, bis das Gewebe getrennt und es keine Reststücke Gewebe in der Flüssigkeit gibt. Ist es nicht möglich, das Gewebe vollständig auflösen, entfernen Sie die restlichen Fragmente mit der Spitze einer Pasteurpipette.
    11. Zentrifuge das Rohr mit der dissoziierten Zelle Lösung bei 200 X g für 3 min. entfernen den Überstand mit einer Pasteurpipette ohne die Zellen zu stören. Das Rohr mit einer Mikropipette 1 mL Kulturmedium Astrozyten (definiert im Schritt 2.1.2) hinzu und rühren zu Aufschwemmen und eine homogene Lösung zu schaffen.
    12. Übertragen Sie 10 mL Kulturmedium Astrozyten mit einer serologischen Pipette auf eine T-75 Flasche. Die Flasche, ein Welpe Gehirn Wert von Zellen pro Flasche Platte fügen Sie 250 µl 1 mL Zelle Lösung (in Schritt 2.1.11 vorbereitet) mit einer Mikropipette hinzu. Die entladenen Zelle Lösung gleichmäßig über dem Kulturmedium verteilen und sanft schütteln der Flasche um eine gleichmäßige Verteilung weiter zu fördern.
    13. Kultur der vergoldeten Fläschchen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach dem erreichen 24 und 72 h in Kultur, mechanisch schütteln Sie die Flasche zum Lösen von nicht-adhärenten Zelltypen, wie Nervenzellen und Oligodendrozyten.
    14. Führen Sie anschließend an jedem der diese Zeitpunkte, ein Medienwechsel. Halten Sie die Flasche senkrecht, so dass die Nährmedien auf der Unterseite des Kolbens, deckt nicht eingehalten Zellen liegt. Aspirieren Sie das Kulturmedium mit einer Pasteurpipette, drücken die Pipettenspitze gegen die untere Ecke des Kolbens zu vermeiden, die Zellen zu extrahieren. Legen Sie die Flasche in der ursprünglichen horizontalen Position und sanft 10 mL Astrozyten Medium über die Zellen mit einer serologischen Pipette.
    15. Die Kolben in den Inkubator nach jeder Medienwechsel zurück. Nach 90 % Konfluenz erreicht ist, mechanisch Schütteln der Flasche noch einmal um alle verbleibenden nicht-Einhaltung von Zellen zu entfernen.
    16. Durchgang der Astrozyten, indem aus dem Kulturmedium mit Vakuum und einer Pasteurpipette. 5 mL Trypsin-EDTA 0,25 % mit einer serologischen Pipette über die eingehalten Zellen hinzufügen. Sanft schütteln der Flasche um sicherzustellen, dass die Trypsin deckt alle Zellen und inkubieren Sie die Flasche für ca. 5-7 min bei 37 ° C und 5 % CO2.
    17. Trypsin zu stillen, indem Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette 1 mL der Astrozyten Medium hinzufügen. Die Zelle-Lösung aus der Flasche mit einer serologischen Pipette zu extrahieren und auf einem sterilen 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 X g für 3 min.
    18. Den Überstand mit einer serologischen Pipette zu entfernen und in 1 mL Kulturmedium Astrozyten aufzuwirbeln. Schütteln Sie das Rohr um sicherzustellen, dass die Zelle Lösung homogen ist. Die Anzahl der Zellen in der Lösung mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Kostenzähler.
      Hinweis: Eine Flasche, die 90 % Zusammenfluss ist in der Regel ergibt ca. 3 Millionen Astrozyten.
    19. Eine T-75-Flasche 10 mL Kulturmedium Astrozyten hinzufügen. Führen Sie eine Verdünnung von 1:4 durch die Übertragung von 250 µl der Zelle Lösung (Schritt 2.1.18.) mit einer Mikropipette in den T-75 Kolben bereits mit Nährmedium. Eine homogene Zelle Verteilung überall auf der Oberfläche der Küvette schütteln Sie vorsichtig.
    20. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.16-2.1.19 jedes Mal, wenn 90 % Konfluenz erreicht wird, um die Zellen die passage.
  2. Kortikale Neuronen Isolation von Ratte Feten
    1. Folgen Sie ähnliche Vorbereitungen als Schritte 2.1.1 und 2.1.2, mit der Ausnahme, die vorgewärmte Medien Co Nährmedien, bestehend aus Neurobasal Medium, 2 % B-27 Aufpreis (Neuronen), 1 % g-5 serumfreien Aufpreis (Astrozyten) + 0,25 % ist, L-Glutamin.
    2. Einschläfern Sie timed-schwanger embryonalen 18.Tag Sprague-Dawley Ratten mit Kohlendioxid Erstickung und bestätigen Sie Tod durch Enthauptung zu.
    3. Extrahieren Sie die Ratte Feten und sezieren Sie die Rinde vom Rest des zerebralen Gewebes in Petrischalen mit HBSS auf der Oberfläche der gekühlten Granitblock mit einem Stereoskop für visuelle Führung und sterilisierten Schere, Microscalpel und Zange53 . Nach den aufeinanderfolgenden Dissektion der Köpfe übertragen Gehirne, zerebralen Hemisphären und Cortex, jedes Gewebe auf eine neue HBSS gefüllten Petrischale.
    4. Zerkleinere die kortikale Gewebe in kleinere Fragmente, die Fläche für Trypsin zu erhöhen. Transfer ca. 4-6 Cortex mit einer Pasteur pipette in ein Röhrchen mit 5 mL vorgewärmte Trypsin-EDTA und pflegen bei 37 ° C, das Gewebe zu trennen. Bei 5-7 min schütteln Sie manuell das Rohr zu mischen und Verklumpung des Gewebes zu verhindern.
    5. Entfernen Sie das Rohr aus 37 ° C nach 10 min. Wie zuvor in Schritt 2.1 erläutert, die Trypsin-EDTA zu extrahieren und ersetzen mit 1,8 mL von 0,15 mg/mL DNAse-Lösung. Danach erscheint Wirbel das Gewebe bis die Lösung homogen, mit keine Gewebefragmente schweben in der Flüssigkeit.
    6. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Gewebe Lösung bei 200 X g für 3 min. Nach dem Entfernen des Überstands, in 2 mL Co Kulturmedium aufzuwirbeln. Die Anzahl der Zellen in dieser Lösung mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Kostenzähler.
      Hinweis: Die üblichen Rendite beträgt 3,0-5,0 x 106 Zellen/kortikalen Hemisphäre.
    7. Bereiten Sie eine neue Zelle-Lösung mit einer Dichte von 2,0-4,0 x 105 Zellen/mL in den oben definierten Kokulturen-Medien.

3. Entwicklung der Astrocytic Kabel im Inneren der Mikro-Spalten

  1. ECM-Kern-Fertigung
    Hinweis: Das ECM hat am selben Tag in das Innere der Hydrogel Mikro-Spalten hinzugefügt werden in der Zelle seeding ausgeführt werden.
    1. Im Inneren eines Biosafety Kabinett, bereiten eine 1 mg/mL Lösung der Rattenschwanz Typ I Kollagen im Co Nährmedium in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch. Pflegen Sie den Microcentrifuge Schlauch mit der ECM-Lösung auf dem Eis jederzeit außer wenn gebräuchlich.
    2. Übertragen Sie 1-2 µL der ECM-Lösung mit einer Mikropipette auf einen Streifen Lackmuspapier, den pH-Wert zu schätzen. Fügen Sie 1 µL 1 N Natriumhydroxid (NaOH) oder Salzsäure (HCl) mit einer Mikropipette erhöhen oder verringern den pH-Wert der ECM-Lösung bzw. und pipette rauf und runter um zu homogenisieren. Überprüfen Sie die neue pH mit einem Streifen Lackmuspapier und fügen Sie mehr Säure oder Base, nach Bedarf, bis der pH-Wert im Bereich von 7,2-7,4 stabil ist.
    3. Verschieben Sie die Petrischalen aus Schritt 1.2 in eine Dissektion Kapuze und übertragen Sie 4-5 Mikro-Spalten oder ein Boot mit sterilen feinen Pinzette auf eine leere, sterile 35 oder 60 mm Petrischale. Verwenden das Stereoskop um Führung, situieren Sie 10 µL-Tipp von einer Mikropipette an einem Ende jedes Mikro-Spalte und Absaugung, das Lumen des DPBS und Luftblasen zu leeren. Bestätigen Sie das Fehlen von Luftblasen mit Stereoskop um sicherzustellen, dass das ECM im nächsten Schritt hinzugefügt über das Lumen frei fließen kann.
    4. Laden Sie eine P10 Mikropipette mit ECM-Lösung, Platz 10 µL Tipp gegen ein Ende der Hydrogel Mikro-Spalten und liefern genug Lösung um das Lumen (ca. 3-5 µL), Beobachtung des ECM-Eintrags mit den Stereoskop zu füllen. Pipette einen kleinen Stausee (2-4 µL) ECM-Lösung an beiden Enden der Mikro-Spalte.
      Hinweis: Gelingt es immer 4-5 Mikro-Spalten oder ein Boot zu einem Zeitpunkt zu verhindern Trocknung der Konstrukte, verlängert, da dies in der zerknitterte Mikro-Spaltenstruktur führen kann. Vollständig getrocknete Mikro-Spalten legen fest an die Oberfläche der Petrischalen, die deren Nutzung für die Zelle Aussaat verhindert. Übermäßige Mengen an Co Nährmedien (als Hydratation Maßnahme) können an den Mikro-Spalten hinzugefügt werden, weil dadurch möglicherweise die ECM zu fließen, während der Inkubationszeit beschrieben.
    5. Pipette Kokultur Medien in einem Ring um die Petrischale zu einer Luftfeuchtigkeit sinken um zu verhindern, dass die Spalten Austrocknen während der Inkubation. Inkubieren Sie die Petrischale mit der ECM-haltigen Mikro-Spalten bei 37 ° C und 5 % CO2 für 1 h nach Polymerisation des Kollagens vor dem Hinzufügen der Neuronen und Astrozyten zu fördern.
      Hinweis: Die ECM sollte bilden eine Schicht, die Beschichtung der inneren Oberfläche des hohlen Lumens, anstatt einen festen ECM Kern umfasst das Interieur, die beobachtet werden über das Stereoskop. Wenn das ECM einen Kern bildet, weiter die Inkubationszeit, bis nur noch die Schicht übrig ist. Mit dieser Schicht gebildet kann die Astrozyten Zelle Lösung das Innere der Mikro-Spalte in der Beschichtung Schritten füllen.
    6. Während der Inkubationszeit bereiten Sie die Astrozyten Zelle Lösung (wie unten beschrieben).
  2. Astrozyten und Neuronen Aussaat in den Mikro-Spalten
    1. Die Passage der vergoldeten Astrozyten (zwischen dem vierten und zwölften Durchgang) beschriebenen Schritte 2.1.16-2.1.19. Bereiten Sie nach der Zählung der Anzahl der Zellen in der Küvette Zelle Lösung bei einer Dichte von 9.0-12.0 x 105 Zellen/mL Lösung in Zellkultur Medien ausgesetzt.
    2. Ein Stereoskop, setzen Sie die Spitze von einer Mikropipette P10 an einem Ende der Mikro-Spalten und transfer ausreichend Zelle Lösung (~ 5 µL) in das Lumen um ihn komplett zu füllen. Wie oben mit der ECM, fügen Sie kleine Stauseen der Zelle Lösung an beiden Enden jeder Mikro-Spalte.
    3. Inkubieren Sie die vergoldeten Mikro-Spalten in den Petrischalen bei 37 ° C und 5 % CO2 für 1 h nach der Befestigung der Astrozyten an das ECM zu fördern. Wenn Neuronen Mikro-Spalten nicht hinzugefügt werden, fahren Sie mit Schritt 3.2.5.
    4. Nach der anfänglichen Inkubationszeit 1-2 µL der kortikalen Neuronen-Lösung in Schritt 2.2.7 in beide Enden der Mikro-Spalten mit einer Mikropipette unter Beachtung unter den Stereoskop erhaltenen hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass genügenden Medien ist vorhanden in den Gerichten zu vermeiden, trocknen und brüten wieder für 40 min bei 37 ° C und 5 % CO2 , um das Anhaften von Neuronen zu ermöglichen.
      Hinweis: Kortikale Neuronen Lösung kann auch 1-2 Tage nach Bundle Bildung, Schritt 3.2.4 nach sorgfältig entfernen die Nährmedien aus der Petrischale mit einer Mikropipette hinzugefügt werden.
    5. Füllen Sie nach der Inkubation, sorgfältig die Petrischalen mit den vergoldeten Mikro-Spalten mit 3 oder 6 mL Co Kulturmedien für 35 oder 60 mm Petrischalen, beziehungsweise. Pflegen die vergoldeten Mikro-Spalten in Kultur bei 37 ° C und 5 % CO2 zur Förderung der Selbstmontage der ausgerichteten astrocytic Bundles, die eine gebündelte, Kabel-ähnlichen Struktur nach 6-10 h bilden sollte.
  3. Stabilisierung der Astrozyten Kabel Architektur
    Hinweis: Nach der Bildung von Bundles, ca. 6-12 h der Kultivierung der Konstrukte, führen Sie folgende Schritte um den Zusammenbruch der ausgerichteten Struktur der astrocytic Gerüste zu verhindern.
    1. In einem sterilen Microcentrifuge Schlauch, bereiten Sie eine 3 mg/mL Ratte Schweif Kollagen ich Lösung in Kokultur Medien. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7.2-7.4 nach dem Verfahren in Schritt 3.1.2 beschrieben. Erhalten Sie Kollagen Lager und Co Kultur Medien auf Eis bei Nichtgebrauch zu, und die vorbereiteten Kollagen-Lösung auf Eis zu jeder Zeit.
    2. Entfernen Sie das Medium aus der Petrischalen mit den astrocytic Gerüste mit einer Mikropipette, verlassen einige Medien an den Seiten des Tellers eine feuchte Senke zu erstellen, die die Hydratation der Mikro-Spalten sorgt dafür. Legen Sie die Schale unter ein Stereoskop um Visualisierung zu unterstützen.
    3. Nehmen Sie mit einer Mikropipette 2-3 µL Kollagen-Lösung und Entlastung an jedem Ende der Mikro-Spalten, mit den Stereoskop für visuelle Führung. Stellen Sie sicher, dass das Gericht ausreichende Medien um die Seiten als Luftfeuchtigkeit Senke an den Rändern der Schale zu handeln. Inkubieren Sie die Petrischalen mit den Mikro-Spalten für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator die Gelierung des neu hinzugefügten Kollagen zu fördern.
    4. 3 oder 6 mL Kokultur Medien langsam hinzugeben (für 35 oder 60 mm Petri Gerichte, beziehungsweise), die Petri-Gerichte mit einer Pipette und Kultur die Gerichte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 oC und 5 % CO2.

(4) Extraktion der Astrocytic Bündel von Hydrogel-innen

  1. Glasdeckgläser im Autoklav zu sterilisieren. Bereiten Sie eine 20 µg/mL Lösung von Poly-L-Lysin (PLL) in sterilen Kultur Grade Zellwasser.
  2. Im Inneren ein Kabinett Biosafety manuell übertragen Sie die sterilisierten Glasdeckgläser steril 10 cm Petrischale, geben Sie und ausreichend PLL-Lösung zur Deckung der Deckgläsern.
  3. Inkubieren Sie Deckgläsern, bedeckt mit der PLL-Lösung für 30 min bei 37 ° C an die Oberfläche zu beschichten. Entfernen Sie die PLL-Lösung mit einer Pasteurpipette nach 30 min. Spülen dreimal, indem das Deckglas Kultur Grade Zellwasser hinzufügen und entfernen es mit einer Pasteurpipette.
  4. Übertragen Sie nach der Bildung des ausgerichteten Glia Bundles Mikro-Spalte auf eine sterile Petrischale mit sterilen feinen Pinzette fein, und fügen Sie einen kleinen Pool von 10 µL Kokultur Medien mit einer Mikropipette verhindern Austrocknung und Bundle Gesundheit zu gewährleisten. Extrahieren Sie das astrocytic Bündel aus Hydrogel Mikro-Spalte durch leichtes Ziehen von einem Ende mit sterilen chirurgischen Zangen, mit einem Stereoskop für visuelle Führung.
  5. Hält das astrocytic Bündel mit der Pinzette, an einem PLL-beschichtete Deckgläschen montieren. Beheben und Flecken mit dem Protokoll unten.

5. Immunocytochemistry für In-vitro- Studien

Hinweis: Für diese Studie wurden die primären Antikörper Kaninchen Anti-Glia sauren fibrillary Protein (GFAP) (1: 500), Anti-β-Tubulin III (1: 500) Maus, Kaninchen Anti-Kollagen I (1: 500), Maus Anti-nestin (1: 200) und Kaninchen Anti-Vimentin (1: 100). Die sekundäre Antikörper waren Esel Anti-Maus-568, Anti-Kaninchen-568 Esel, Esel Anti-Kaninchen 488 und Esel Anti-Maus 568 (1: 500 für alle). Volumen Sie in allen Fällen genügend jeder Lösung vollständig decken die Mikro-Spalten.

  1. Bereiten Sie eine 4 % Volumen/Volumen (V/V) Formaldehyd-Lösung in 1 X DPBS innerhalb einer chemischen Abzugshaube.
    Achtung: Formaldehyd ist eine giftige Verbindung, die bekanntermaßen krebserregend sein und muss in einem separaten Behälter entsorgt werden. Immer diese Verbindung innerhalb einer chemischen Abzugshaube zu manipulieren und persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu nutzen.
  2. Verwerfen Sie bei der Mikro-Spalten die Nährmedien aus die Petrischalen mit den Konstrukten mit einer Pasteurpipette ohne Absaugung versehentlich die Hydrogel-Zylinder. Fügen Sie ausreichend Formaldehyd-Lösung zur Deckung der Mikro-Spalten oder die montierten Deckgläsern (beide bleiben in den Petrischalen) und 35 min bei 18-24 ° c inkubieren
  3. Extrahieren Sie die 4,0 % Formaldehyd-Lösung aus festen Mikro-Spalten oder Deckgläsern mit einer serologischen Pipette. Die festen Mikro-Säulen dreimal mit PBS durch schnell hinzufügen und Entfernen von PBS zweimal und dann lassen sie tränken für 10 min. ein drittes Mal zu spülen.
  4. Lösen Sie normales Pferd Serum (NHS auf) in PBS bei einer Konzentration von 4 % V / v. bereiten Sie eine Lösung mit nichtionischen Waschmittel in einer Konzentration von 0,3 % V/V mit der NHS-Lösung als Lösungsmittel.
  5. Entfernen Sie die PBS aus die Petrischalen mit Mikro-Spalten oder Deckgläsern mit einer Pipette. Fügen Sie ausreichend 0,3 % Waschmittel-Lösung zur Deckung der Mikro-Spalten/Deckgläsern für 60 min bei 18-24 ° C, um die Zellen permeabilize.
  6. Herausnehmen der Reinigungslösung und spülen schnell zweimal mit PBS und dreimal durch Einweichen für 5 min. berechnen das erforderliche Volumen von 4 % NHS und jeder der primären Antikörper, eine Lösung mit der gewünschten Antikörper-Konzentrationen vorzubereiten.
  7. Die PBS aus der Petrischalen entfernen und hinzufügen genügend Primärantikörper (in 4 % verdünnt NHS-DPBS) Lösung zur Deckung der Mikro-Spalten oder die extrahierten astrocytic Bündel. Inkubation über Nacht (12-16 h) bei 4 ° C.
  8. Nehmen Sie die primären Antikörper-Lösung und spülen Sie schnell zweimal mit PBS und drei Mal für 5 Minuten einweichen. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung, in der Dunkelheit, mit jeder Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 500 in 4,0 % NHS Lösung vorhanden.
  9. Inkubieren Sie Zellen mit der Sekundärantikörper Lösung für 2 h bei 18-24 ° c Während der gesamten Zeit der Inkubation decken Sie die Petrischalen mit Mikro-Spalten mit Alu-Folie, Lichteinwirkung zu vermeiden.
  10. Die Sekundärantikörper Lösung entfernen und Hinzufügen von Hoechst Lösung (01:10, 000) für 10 min bei 18-24 ° C, die Kerne zu beflecken.
    Achtung: Hoechst ist ein bekannter Mutagen, die als Karzinogen behandelt werden sollte. Daher muss es in einem separaten Behälter entsorgt werden und PSA sollte verwendet werden, zu allen Zeiten, wenn dieser Agent manipulieren.
  11. Spülen mit PBS fünf Mal, jeweils für 5-10 min. danach, speichern die gefärbten Mikro-Spalten bei 4 ° C in PBS und mit Alufolie bedecken. Im Fall von der montierten astrocytic Bündel Tropfen Sie einen der wässrigen Eindeckmittel auf das Bundle, legen Sie ein weiteres Glas Deckglas über die festen Bündel und versiegeln Sie beide Deckgläsern mit Nagellack für langfristige Speicherung und anschließenden Bildbearbeitung zu.

(6) Lebensfähigkeit Assay mit Live-Toten (Calcein-AM/Interkalation Homodimer) Färbung

  1. Bereiten Sie die Reagenzlösung durch Zugabe von 5 µl Calcein AM (wasserfreie Dimethyl Sulfoxid (DMSO) 4 mM) und 20 μl Interkalation Homodimer-1 (EthD-1) (2 mM in DMSO/H2O 1:4 V/V) auf 10 mL 1 X DPBS. Die Lösung mit Aluminiumfolie abdecken oder in der Dunkelheit vor Licht geschützt aufbewahren.
  2. Aspirieren Sie Medien aus der Petrischale mit den vergoldeten Mikro-Spalten mit einer Pasteurpipette, und fügen Sie genug Lösung (bereit oben), die Konstrukte zu decken. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2, halten die Petrischale abgedeckt, um die Lösung aus dem Licht zu schützen.
  3. Entfernen Sie die Lösung mit einer Mikropipette oder Pasteurpipette. Spülen Sie 2 - 3 Mal mit DPBS, wie im Schritt 5.3 beschrieben. Überfluten Sie die Petrischalen mit DPBS entsprechend der Größe der Schale. Bildzellen mithilfe sofort danach Epifluoreszenz oder konfokale Bildgebung.
    Hinweis: Umstellung der Membran durchlässig Calcein AM, Calcein von metabolisch aktiven Zellen ergibt sich die grünen Fluoreszenz von Calcein. Abgestorbenen Zellen sind als Membran beschädigt Zellen markiert, die was die Einreise von EthD-1 in die Zelle und die Bindung an Nukleinsäuren, verursacht rote Fluoreszenz.

Ergebnisse

Zunächst Phasenkontrast-Mikroskopie wurde verwendet, um das Fortschreiten der Astrozyten Adhäsion und Bundle-Bildung und die Gesamtstabilität der Cytoarchitecture als Funktion der Zeit zu überwachen. 1 h nach der Beschichtung fanden sich Astrozyten in das Lumen der Mikro-Spalten mit einer sphärischen Morphologie (Abbildung 2A). Um 5 Uhr Astrozyten begann Prozesse erweitern und zusammenziehen, während von 8 h Zellen stellte eine komplette Prozess-Lager-M...

Diskussion

Im Vergleich zu mehr unterstützendes Umfeld der PNS beschränkt die CNS besonders im Umgang mit den nachteiligen Folgen der Neurotrauma und Neurodegeneration. Nach eine schwere Beleidigung der Säugetier-CNS wird eine glial Narbe gebildet, bestehend aus einem Kern von fibrotischen und entzündlichen Zellen umgeben von einem dichten Geflecht unorganisiert reaktive Astrocyten, die Axon Auswuchs hemmende Proteoglycans14absondern. Diese Narbe wirkt wie ein physischer und biochemischer Hindernis gegen...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Finanziell wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [therapeutische Pipeline Programm #9998 (Cullen)], Penn Medizin Neuroscience Center Pilot Award (Cullen) National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D Verdienst Bewertung #B1097-ich (Cullen)], und die US Army Medical Research und Materiel Command [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acupuncture needle (300 µm diameter)Lhasa MedicalHS.30x40The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dishFisher08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyrene disposable serological pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)Fisher21-170JThe diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenserFisher21-170JBulb comes with the microcap tubes.
Hot plateFisherSP88857200
Magnetic barFisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25 mm gauge needleFisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
ScissorsFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Hot bead sterilizerSigmaZ378550-1EA
StereoscopeNikonSMZ800N
Micro-spatulaFisherS50821
Rat tail type I collagenCorning354236Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tubeFisher02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)FisherSS2661
Hydrochloric acid (HCl)FisherSA48-1
Litmus paperFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) ISigma10104159001Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient MixtureGibco11330-032Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pupsCharles RiverStrain 001
Neurobasal embryonic neuron basal mediumInvitrogen21103049Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplementInvitrogen12587010Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamineInvitrogen35050061Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplementInvitrogen17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 ratsCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetteFisher22-042816
15 mL centrifuge tubeEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugeFisher05-413-115
HemocytometerFisher02-671-6
IncubatorFisher13 998 076
Formaldehyde 40%FisherF77P-4Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slipFisher12-548-5M
Nail polishElectron Microscopy Sciences (EMS)72180
Fluoromont mounting mediumSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lysineSigmaP4707
Phosphate buffered salineFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Normal horse serumGibco16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibodyMilliporeAB5804Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibodySigmaT8578Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibodyAbcamab34710Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentinMilliporeAB3400Store at -20ºC.
Mouse anti-nestinMilliporeAB5326Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibodyInvitrogenA10037Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibodyInvitrogenA10042Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibodyInvitrogenA21206Store at 4ºC.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AMSigmaC13594 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1Life TechnologiesE11692 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon--------------Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S MicroscopeNikon--------------Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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