Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.

Abstract

I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l'amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare.

ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico.

Introduzione

L'identità cellulare è determinata dall'espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell'istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule ^{1 , 2 , 3} . In particolare, il profilo genomico di acetilazione della istina H3 lisin 27 (H3K27ac) è comunemente usato per definire promotori attivi, enhancer e super-enhancer ^{4 , 5 , 6} .

Moloney virus della leucemia murina (MLV) è un retrovirus gamma che è ampiamente usato per il geneTrasferimento in cellule di mammiferi. Dopo l'infezione di una cellula bersaglio, il genoma RNA retrovirale viene retro-trascritto in una molecola del DNA a doppio filamento che lega le proteine ​​virali e cellulari per assemblare il complesso di pre-integrazione (PIC). Il PIC entra nel nucleo e lega la cromatina della cellula ospite. Qui, l'integasi virale, un componente chiave del PIC, media l'integrazione del DNA provirale nel genoma delle cellule ospite. MLV nel DNA genomico non è casuale, ma si verifica in elementi cis-regolatori attivi, quali promotori e promotori, in un modo specifico per le cellule ^{7 , 8 , 9 , 10} . Questo particolare profilo di integrazione è mediato da un'interazione diretta tra l'integrasi di mLV e le proteine ​​cellulodiche del bromodomano e del dominio extraterminale (BET) ^{11 , 12 , 13} . BET proteine ​​(BRD2, BRD3 eBRD4) agiscono come un ponte tra la cromatina dell'ospite e il mLV PIC: attraverso i loro bromodomi riconoscono regioni cis-regolatori altamente acetilizzate, mentre il dominio extraterminale interagisce con la mLV integrase ^{11 , 12 , 13} .

Qui descriviamo la scansione retrovirale, un nuovo strumento per mappare regioni attive di cis-regolazione in base alle proprietà di integrazione di mLV. In breve, le cellule sono trasdotte con il vettore retrovirale derivato da mLV che esprime il gene reporter del proteine ​​verde fluorescente (eGFP). Dopo l'estrazione genomica del DNA, le giunzioni tra il 3 'lungo ripetizione terminale (LTR) del vettore mLV e il DNA genomico vengono amplificate mediante PCR linker-mediata (LM-PCR) e sequenzialmente massicciamente. MLV sono mappati al genoma umano e le regioni genomiche altamente mirate da mlV sono definite come cluster di siti di integrazione mLV.

Scansione retroviraleNing è stato utilizzato per definire elementi regolatori attivi specifici per le cellule in diverse cellule primarie umane ^{14 , 15} . MlV co-mappati con promotori e valorificatori epigeneticamente definiti, la maggior parte dei quali conteneva segni attivi di istone, come H3K27ac, e erano specifiche per le cellule. La scansione retrovirale permette l'identificazione genetica degli elementi regolatori del DNA nelle popolazioni cellulari prospetticamente purificate ^{7 , 14} , nonché nelle popolazioni cellulari definite retrospettivamente, come le cellule staminali di cheratinociti, che non dispongono di marcatori efficaci per l'isolamento prospettico15.

Protocollo

1. MLV Trasduzione di cellule umane

1. Isolare le cellule bersaglio e trasportarle con un vettore retrovirale derivato da mlV che ospita il gene del reporter eGFP e pseudotipizzato con vescicolare Stomatite Virus G (VSV-G) o la glicoproteina dell'amfotropo ¹⁶ .
   1. Tenere le cellule mock transduced come un controllo negativo per le analisi seguenti. Poiché i vettori retrovirali basati su mLV possono trasducere cellule divide in modo efficiente, coltivare la popolazione delle cellule bersaglio in condizioni che stimolano la divisione cellulare. Le condizioni di trasduzione devono essere specificamente ottimizzate per ciascun tipo di cellule in studio. Le condizioni di crescita cellulare e di trasduzione per i progenitori ematopoietici umani, le cellule T e le cellule epidermiche sono descritte nei riferimenti 7, 14, 15 e 17.
2. 48 h dopo la trasduzione, risospendere 100.000 cellule in 300 μL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) contenente 2% di siero fetale fetale e misurare l'espressione eGFP per fBassa analisi citometrica (laser di eccitazione 488 nm). Utilizzare le cellule mock transduced come controllo negativo. Per ottimizzare il recupero di siti di integrazione, purificare le cellule GFP ⁺ mediante Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
3. Raccogliere da 0,5 a 5 milioni di cellule per la preparazione del DNA genomico. È preferibile un periodo di coltura più lungo (> 7 giorni) per diluire il provirio non integrato e necessario analizzando la progenie a lungo termine delle cellule staminali bona fide (cfr . Sezione Discussione e riferimento ¹⁵ ). Le pellicole cellulari possono essere congelate e conservate a -80 ° C fino all'uso.

2. Amplificazione dei siti di integrazione di mLV tramite PCR mediati da linker (LM-PCR)

1. Preparazione del DNA genomico (gDNA)
   1. Estrarre il gDNA utilizzando un kit di estrazione del DNA basato sulla colonna e seguire il protocollo per le cellule colte, secondo le istruzioni del produttore.
2. Enzima di restrizione digestisopra
   1. Impostare 4 digestioni di enzimi di restrizione per campione in tubi da 1,5 ml. Digest 0.1 - 1 μg gDNA in ogni tubo aggiungendo 1 μL di Tru9I (10U) e 1 μL di Tampone M in un volume finale di 10 μL. Incubare le reazioni a 65 ° C per 6 ore o durante la notte.
   2. Aggiungere ad ogni reazione 1 μl di PstI (10U), 1 μl di Tampone H e 8 μl di acqua. Incubare le reazioni a 37 ° C per 6 ore o durante la notte. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
3. Ligation del linker
   1. Preparare una soluzione di base di linker Tru9I da 100 μM in un tubo da 1,5 mL mescolando il linker più filo e linker minus strand oligonucleotidi a una concentrazione di 100 μM. Mettere il tubo in un set di acqua a 100 ° C e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. La soluzione di titanio Tru9I può essere conservata a -20 ° C fino all'uso.
   2. Impostare 8 reazioni di legatura del linker in tubi da 1,5 ml. Per ogni reazione, aggiungere il seguente componenteS fino a 10 μL di digestione enzimatica di restrizione: 1,4 μL di 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μl di 10 μM di linker Tru9I, 1 μL (2.000U) di T4 DNA ligasi e 0.6 μL di acqua. Incubare a 16 ° C per 3 a 6 h. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
4. Primo PCR
   1. Impostare 48 reazioni PCR (6 reazioni da ogni tubo di legatura) in 0,2 mL tubi. Per ogni PCR, aggiungete i seguenti reagenti a 2 μL di reazione di legame: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μl di 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl di primer di collegamento 10 μM, 1 ΜL di 10 μM mLV-3 'LTR primer, 0,3 μL (1,5U) di Taq DNA Polimerasi e 37,7 μl di acqua. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella 1.
   2. Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25 cicli di 95 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 °; C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
5. Secondo PCR
   1. Impostare 48 reazioni PCR (1 da ogni tubo "primo PCR") in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti componenti a 2 μL della prima reazione PCR: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μL di 10 mM dNTP Mix, 1 μl di primer nidificato 10 μM, 1 ΜL di primer nidificato 10 μM mLV-3 'LTR, 0,3 μl di Taq DNA Polymerase (1,5 U) e 37,7 μL di acqua. Utilizzare primer nidificati progettati per la specifica strategia di sequenza massiccia scelto: (i) primer nidificato con linker e primer nidificato con mLV-3 'LTR compatibile con la piattaforma Illumina; (Ii) primer nidificato con linker e primer nidificato mLV-3 'LTR compatibile con la piattaforma Roche. Le sequenze di primer sono elencate nella tabella 1 .
   2. Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25Cicli di 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
   3. Raccogliere le 48 reazioni PCR nidificate in un tubo da 15 mL (volume finale di ~ 2,4 mL). I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
6. Determinare la presenza e la dimensione dei prodotti LM-PCR mediante elettroforesi di agarosio.
   1. Aggiungere 4 μl di buffer di caricamento a 20 μL di prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel di agarosio al 1%, insieme ad una scala del DNA a 100 bp. Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e visualizzare i prodotti PCR con colorazione di bromuro di etidio.
   2. Eseguire una reazione LM-PCR dal campione trasfusibile come controllo negativo.
7. Precipitare gli ampliconi aggiungendo 0,1 volumi di soluzione di acetato di sodio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare e congelare a -80 ° C per 20 minuti.
   1. Spin al fuVelocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 20 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet con il 70% di etanolo. Girare a piena velocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 5 min.
   2. Scartare il supernatante e asciugare il pellet. Aggiungere 200 μL di acqua di PCR e riposizionare il DNA. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
8. Aggiungere 20 μl di buffer di caricamento a 100 μL dei prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel agarosico del 1%, insieme ad una scala del DNA da 100 bp.
   1. Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e tagliare la parte del gel contenente ampliamenti da 150 a 500 bp.
   2. Purificare i prodotti LM-PCR con un kit di estrazione del gel basato sulla colonna e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV.
9. Utilizzare 1 μL di libreria per valutare la lunghezza dei prodotti LM-PCR utilizzando uno strumento di bioanalizzatore, secondo le istruzioni del produttore.
10. La clonazione delle riprese di ampliconi
    1. Utilizzare 20 ng dei prodotti purificati LM-PCR e clonarli nel vettore pCR2.1-TOPO, secondo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire reazioni di sequenza utilizzando il primer universale M13, seguito da mappe genomiche delle sequenze risultanti, per rivelare la presenza delle giunzioni virali-genomiche (incluso il primer annidato mLTR-3 'LTR) in> 50% dei cloni per identificare campioni adatti Per la sequenza massiccia. Esempio di giunzione virale-genoma:
       
       MLR-3 'LTR primer 454 e primer nidificante linker 454 ( Tabella 1 ) sono indicati in grassetto e l'estremità 3' del LTR virale in corsivo. La sequenza genomica umana è evidenziata in rosso (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Sequencing massiccia dei siti di integrazione mLV

NOTA: LM-PCR prodPossono essere sequenziati utilizzando piattaforme commerciali (scegliendo la corretta coppia primer nidificata nella seconda reazione PCR, si veda il paragrafo 2.5.1). Per il sequenziamento della piattaforma pirocedente Roche GS-FLX, fare riferimento ai precedenti articoli ^{7 , 14 e 15} . In questa sezione viene descritto un protocollo di nuova ottimizzazione per la piattaforma di sequenziamento Illumina.

1. Preparazione alla libreria
   1. Impostare 1 reazione PCR di indice per campione in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti reagenti a 5 μL (150-170 ng) di prodotto purificato di LM-PCR: 5 μL di Primer 1, 5 μL di Primer 2, 25 μL di Master Mix 2X e 10 μL di PCR- Acqua di qualità. Utilizza una combinazione di indice diversa per ogni campione.
   2. Eseguire reazioni PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 3 min; 8 cicli di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C.
   3. Purificare i prodotti PCR usando un protocollo di isolamento a spruzzo in fase solida (SPRI): in nuovi tubi da 1,5 ml aggiungere 56 μL di perle a ciascun campione e procedere seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 25 μl di Tris-HCl 10 mM. Le biblioteche possono essere conservate a -20 ° C fino all'uso.
2. Controllo della libreria
   1. Utilizzare 1 μl di campione per valutare la dimensione della libreria utilizzando uno strumento di bioanalizzatore.
   2. Utilizzare 1 μl di campione per quantificare la molecolarità della biblioteca usando un test PCR real time basato su fluorescenza, secondo le istruzioni del produttore.
3. Diluizione e sequenza della biblioteca
   1. Dilute le librerie a 10 nM usando Tris-HCl 10 mM. Per la raccolta di librerie, trasferire 5 μL di ogni libreria diluita in un nuovo tubo da 1,5 ml e quindi diluire la piscina a 4 nM in Tris-HCl 10 mM.
   2. Mescolare 5 μL di piscina diluita con 5 μL di 0,2 N NaOH in un nuovo 1,5 mL, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie.
   3. Mettere i tubi sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di tampone di ibridazione pre-refrigerato (HT1). Aliquota 300 μL di piscina denaturata in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una piscina di biblioteca finale di 10 μM.
   4. Parallelamente, mescolare 2 μl di libreria di controllo PhiX (10 nM) con 3 μL di Tris-HCl 10 mM in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 5 μL di NaOH 0,2 N, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare il PhiX diluito. Mettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di HT1 pre-refrigerato.
   5. Aliquota 300 μL di PhiX denaturato in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una PhiX finale di 10 μM.
   6. In un nuovo tubo da 1,5 ml, mescolare 510 μL di pool di biblioteca denaturato con 90 μL di libreria PhiX denaturato, ottenendo così una piscina finale di 10 pM con il 15% di controllo PhiX.
   7. Pipettate questi 600 μL di campioneVolume nel serbatoio del campione di carica della cartuccia del reagente di sequenza scongelato e procedere immediatamente per eseguire una singola lettura a 150 cicli.
      NOTA: i reagenti critici e le sequenze primer necessarie per questo protocollo sono elencati nella tabella 1 .

Risultati

Flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale

Il flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale è schematizzato in Figura 1 . La popolazione delle cellule bersaglio viene purificata e trasfusa con un vettore retrovirale derivato da mLV che esprime un gene reporter del eGFP. Il transgene è affiancato dalle due identiche ripetizioni terminali lunghe (5 'e 3' LTR), garan...

Discussione

Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un'alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficien...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS, pH 7.4	ThermoScientific	10010031	or equivalent
Fetal Bovine Serum	ThermoScientific	16000044	or equivalent
0.2 ml tubes	general lab supplier
1.5 ml tubes	general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit	QIAGEN	51306	or equivalent
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer	New England BioLabs	M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I	Roche-Sigma-Aldrich	11464825001
SuRE/Cut Buffer M	Roche-Sigma-Aldrich	11417983001
PstI	Roche-Sigma-Aldrich	10798991001
SuRE/Cut Buffer H	Roche-Sigma-Aldrich	11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	or equivalent
PCR grade water	general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
linker primer	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer	general lab supplier		5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina	general lab supplier		5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina	general lab supplier		5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2	general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)	Invitrogen	K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	28704
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	or equivalent
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	or equivalent
100 bp DNA ladder	Invitrogen	15628019	or equivalent
6x Loading Buffer	ThermoScientific	R0611	or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000
Nextera XT Index kit	Illumina	FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix	KAPA Biosystems	KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes	Invitrogen	12321D	or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit	Beckman Coulter Genomics	A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5	general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2964AA	or equivalent
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582	or equivalent
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583	or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)	KAPA Biosystems	KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade	general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)	Illumina	Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)	Illumina	MS-102-3001
MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001