Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y<em&gt; CMAH</em&gt; Ratones knock-out.

Resumen

Se describe un método basado en HPLC para la determinación de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en hígado y leche de ratón.

Resumen

El CMAH (citidina monofosfato-N-acetilneuramínico hidroxilasa) es responsable de la oxidación de citidina monofosfato-N-acetilneuramínico en mamíferos. Sin embargo, los seres humanos no pueden oxidar el ácido monofosfato de citidina-N-acetilneuramínico a ácido monofosfato de citidina-N-glicolilneuramínico debido a una deleción del exón primario del gen CMAH . Para entender los efectos y las implicaciones de la falta de actividad de CMAH con más detalle, un modelo de eliminación de Cmah en ratones es de gran interés en la investigación básica y aplicada. El método de análisis para determinar el fenotipo de este modelo de ratón se describe aquí en detalle y se basa en la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en el hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y Cmah . Los ácidos siálicos endógenos se liberan y se derivatizan con o-fenilendiamina para generar derivados fluorogénicos, que pueden analizarse posteriormente por HPLC. El protocolo presentado puede serTambién se aplicó para el análisis de leche y muestras de tejidos de otros orígenes, y puede ser útil para investigar los efectos nutricionales y para la salud del ácido N-glicolilneuramínico.

Introducción

El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) son los ácidos siálicos más comunes en la mayoría de los mamíferos ¹ . Aunque son capaces de sintetizar endógenamente Neu5Ac, los seres humanos no son capaces de producir Neu5Gc debido a una deleción primaria de exón en el gen CMAH que codifica para una hidroxilasa ^{2 , 3 de} CMP-Neu5Ac. Sin embargo, los productos alimenticios de origen animal pueden ser fuentes dietéticas de Neu5Gc ^{4 , 5 , 6} , lo que conduce a la producción de anticuerpos anti-Neu5Gc y por lo tanto, desencadenar una respuesta inmune hacia Neu5Gc ⁷ . Se sospecha que este efecto en la dieta de Neu5Gc contribuye a la inflamación crónica ya otras diversas enfermedades ^{8 , 9 , 10} . Con el fin de comprender ampliamente los efectos de Neu5Gc en hUn modelo animal para el estudio sistemático de los efectos de los ácidos siálicos transmitidos por los alimentos es altamente deseable. Aunque los protocolos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis de ratones knock-out están bien establecidos y una manera conveniente para la evaluación genotípica, el análisis funcional del fenotipo en el nivel metabólico requiere métodos de análisis más específicos. El fenotipo de un modelo de ratón knock-out Cmah se puede evaluar aislando y analizando la composición de ácidos siálicos en muestras de hígado o leche. Varios métodos para la detección de ácidos siálicos en tejidos animales han sido reportados previamente: la reacción de ácidos siálicos con resorcinol ¹¹ o ácido tiobarbitúrico ^{12 da como} resultado la formación de un producto cromóforo y puede analizarse simplemente usando una configuración basada en platereader, pero sólo la sialic total Se puede determinar el contenido de ácido. Alternativamente, el análisis de ácidos siálicos también se describió usando cromatografía de gases¹³ , espectrometría de masas MALDI-ToF ¹⁴ o métodos amperométricos ¹⁵ . Sin embargo, los métodos de análisis de ácido siálico más comúnmente aplicados se basan en la liberación hidrolítica, seguido por derivatización de fluorescencia y cromatografía líquida subsiguiente de alto rendimiento ^{16 , 17 , 18} .

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Ético del Centro Experimental de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing de acuerdo con las Directrices Nacionales para el Bienestar Animal Experimental (Ministerio de Ciencia y Tecnología, RP de China, 2006) con los animales alojados en un SPF (ID de permiso: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah Knock-out modelo de ratón

1. Utilizar ratones C57B1 / 6 de tipo salvaje del Centro de Medicina Comparada de la Universidad de Yangzhou (China).
   NOTA: Se generaron ratones knock-out Cmah basándose en la información proporcionada a partir de estudios de knock-out Cmah anteriores ^{17 , 19} y obtenidos comercialmente usando una estrategia CRISPR / Cas9 ²⁰ mediante la eliminación de 92 pares de bases del exón 6 del gen Cmah que también es Suprimido en el gen humano CMAH [ ^19] . Positivo F _{0 <}/ sub> -mice (2 individuos) se cruzaron con ratones de tipo salvaje para obtener heterocigotos F ₁ -mice. Después de cruzar heterocigotos F ₁ -mice (5 personas), homocigoto CMAH ronda F ₂ -mice se podría obtener con éxito (3 individuos).
2. Realizar el genotipado de ratones utilizando ADN genómico de acuerdo con el método mostrado por Zangala ²¹ utilizando un kit comercial de purificación de ADN.
   1. Amplificar un fragmento de ADN correspondiente del gen Cmah utilizando DNA polimerasa comercial y el par de cebadores 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'y 5'tttaaaatgtccggggtgagaagc3'. Realizar la amplificación génica utilizando 34 ciclos de PCR consistentes en desnaturalización a 94 ° C durante 40 s, hibridación a 63 ° C durante 40 s, y elongación a 72 ° C durante 1 min.
   2. Visualizar los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Se debe observar una banda única (0,5 kb) para el individuo de tipo salvaje, una banda doble (0,4 y 0,5 kb) para elHeterocigotos knock-out individual, y una sola banda (0,4 kb) para el homocigotos knock-out individual.

2. Recolección de muestras

1. Recoger la leche del ratón utilizando el protocolo descrito por Willingham et al. ²² .
2. Recoger el tejido del hígado de ratón utilizando el protocolo descrito por Gonçalves et al. ²³ y almacenar las muestras a -80 ° C.

3. Aislamiento de los ácidos siálicos de la leche

1. Preparar 100 ml de una solución de ácido acético 2 M mediante la adición de 12 ml de ácido acético glacial en 88 ml de _H2O destilada
2. Transferir 50 μL de leche en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y agregar 1,2 ml de la solución acuosa de ácido acético preparada.
3. Incubar la suspensión durante 4 h a 80 ° C y centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 10 min.
4. Transferir los 1000 μL superiores del sobrenadante en un tubo de centrífuga de 1,5 ml nuevo y remDel disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad completa (dependiendo de la bomba de vacío conectada esto tomará 4 - 20 h). Volver a disolver la muestra en 500 μl de H ₂ O destilada.
5. Preparar una columna de intercambio micro-anión. Esta etapa enriquecerá específicamente compuestos aniónicos y eliminará los compuestos catiónicos y neutros de las muestras de leche y de hígado, y por lo tanto aumenta la selectividad del agente de marcaje de OPD fluorogénico para la derivatización del ácido siálico.
   1. Transferir para cada muestra 200 mg de la resina de intercambio aniónico (Dowex 1X8) en tubos de columna vacíos de 3 ml con una llave de paso adjunta.
   2. Añadir 2 ml de la solución acuosa de ácido acético preparada en la etapa 3.1 para reemplazar los iones cloruro en la resina con iones acetato. Cierre la llave de paso tan pronto como el solvente alcance la parte superior de la resina.
   3. Añadir con cuidado 2 ml de _H2O destilada, abrir la llave de paso y detener el flujo tan pronto como la mayoría de los alcances de disolventeLa parte superior de la resina. Asegúrese de que la resina esté siempre cubierta con disolvente.
   4. Lavar la columna de la resina dos veces más con 2 ml de H ₂ O destilada para retirar el exceso de etilo.
6. Transferir los 500 μl resultantes del disolvente de la muestra de la etapa 3.4. Sobre la columna de resina y descartar el flujo. Lavar suavemente la resina con 2 ml de _H2O destilada Eluir los aniones de muestra de la resina usando 1 ml de una solución de acetato de amonio 50 mM (386 mg de acetato de amonio disueltos en 100 ml de _H2O destilada) en un 1,5 ml tubo centrífugo. Eliminar el disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad.
   NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a 4-6 ° C durante un máximo de 12 meses.

4. Aislamiento de los ácidos siálicos del tejido del hígado

1. Descongelar suavemente 20 - 50 mg de hígado de ratón y transferirlo a un triturador de tejidos Dounce (1 mL o 2 mL de volumen). Añadir 1,2 ml de la solución acuosa de ácido acéticoPreparada en el paso 3.1 y homogeneizar el tejido por cizallamiento suave durante 10 s. Transferir la suspensión resultante a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
2. Siga los pasos 3.3. A 3.6.
   NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a 4-6 ° C durante un máximo de 12 meses.

5. Preparación de una norma de ácido siálico mixto

1. Pesar entre 5 - 8 mg de ácido N-acetilneuramínico sobre un equilibrio analítico en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Tenga en cuenta el peso exacto y añadir 164 l de _H2O destilada por cada mg (es decir, si el peso de Neu5Ac es de 7,2 mg a continuación, añadir 7,2 x 164 = 1, 181 l de _H2O destilada). Esto da como resultado una solución madre de Neu5Ac 20 mM que puede almacenarse a -20ºC durante hasta 12 meses.
2. Obtener ácido N-glicolilneuramínico en cantidades más pequeñas a un precio moderado tal como en alícuotas de 1 mg. Añadir 154! L de _H2O destilada directamente en el compuesto con el fin de obtener una Neu5Gc mM solución madre ~ 20. Transferir elEn un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Esta solución se puede almacenar a -20 ° C durante un máximo de 12 meses.
3. Combinar 5 μL de cada solución madre de la etapa 5.1 y 5.2 en un tubo de centrifugación fresco de 1,5 ml y eliminar el disolvente por evaporación centrífuga a temperatura ambiente hasta sequedad.
   NOTA: El estándar de ácido siálico mixto se puede almacenar a 4 - 6 ° C por hasta 12 meses.

6. Derivatización de la fluorescencia de los ácidos siálicos

1. Preparar 10 ml de OPD-solución, que consiste en 100 mg de o-fenilendiamina y 208 mg de sulfito de hidrógeno de sodio en 10 ml de H ₂ O. destiló
2. Añadir 20 μl de solución de OPD a las muestras de ácido siálico derivadas de la leche de ratón (etapa 3), hígado de ratón (etapa 4) o el estándar de ácido siálico mixto (paso 5). Vortex vigorosamente durante 30 s e incubar las muestras durante 4 h a 80 ° C en la oscuridad ( es decir, envolver los microtubos en papel de aluminio).
3. Deje que las muestras se enfríen durante 5 min, agregue 80 μ; L de H ₂ O destilada y centrifugar los tubos a 14.000 xg durante 1 min.
4. Transferir 80 μL del sobrenadante a un frasco de HPLC de alta recuperación de 300 μl. Las muestras derivatizadas de ácido siálico se pueden almacenar a 4-6 ° C durante una semana.

7. Análisis por HPLC de derivados de ácido siálico

1. Analizar las muestras utilizando un sistema de HPLC estándar conectado a un detector de fluorescencia en línea.
2. Utilizar una columna de fase inversa C18 con las dimensiones estándar de 250 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro para el análisis.
3. Preparar el disolvente A diluyendo 200 ml de solución madre con 800 ml de agua de grado LCMS (LCMS - cromatografía líquida espectrometría de masas). La solución madre en sí puede prepararse como sigue:
   1. Añadir 46 g de ácido fórmico a 800 ml de H _ { _2} O de grado LCMS.
   2. Ajustar el pH a 4,5 por adición gota a gota de solución de hidróxido de amonio (puriss pa).
   3. Transferir el disolvente a unaY llenar hasta 1.000 ml con H ₂ O de grado LCMS. Esta solución madre se puede almacenar a 4-6 ° C durante un máximo de 3 meses.
4. Para el disolvente B, utilice acetonitrilo de grado LCMS.
5. Se separan los derivados de los ácidos siálicos a un caudal de 1 ml / min con la siguiente elución con gradiente:
   1. Comience añadiendo el 10% de disolvente B mezclado al disolvente A.
   2. De 0 min a 15 min, aumentar gradualmente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal hasta 60%.
   3. De 15 minutos a 16 minutos, aumentar rápidamente la proporción de disolvente B con un gradiente lineal de 60% a 90%. Esto inicia el lavado de la columna de HPLC.
   4. Para lavar adicionalmente la columna de HPLC, mantener el nivel de disolvente B al 90% entre 16 min y 18 min antes de reducir gradualmente el nivel de disolvente B de nuevo a 10% entre 18 min y 19 min.
   5. Reequilibrar la columna de HPLC a las condiciones de partida de 10% de B entre 19 y 24 min.
6. En50 μL de muestra en el sistema de HPLC.
7. Los eluyentes de monitorización que utilizan las longitudes de onda de excitación / emisión de detector de fluorescencia de 373/448 nm, y los ácidos siálicos derivatizados se pueden esperar a los tiempos de retención aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) y 10 min (para Neu5Ac-OPD).
8. Calcular la cantidad relativa de Neu5Gc (F _Neu5Gc ) de las áreas de pico de fluorescencia de Neu5Ac (A _Neu5Ac ) y Neu5Gc (A _Neu5Gc ) como sigue: F _Neu5Gc [%] = 100 × A _Neu5Gc / (A _Neu5Ac + A _Neu5Gc ). En el caso de la leche y las muestras de hígado de homocigotos Cmah knockout ratón F _Neu5Gc debe ser de 0%, mientras que los valores de F _Neu5Gc de heterocigotos y de tipo salvaje ratones pueden variar ampliamente dependiendo de la edad del ratón y el tipo de tejido (entre el 2% Y> 90%) con márgenes de error esperados de ± 12%.

Resultados

Una representación esquemática del método de análisis descrito se muestra en la Figura 1 e incluye el aislamiento de ácidos siálicos de leche y muestras de hígado de ratones mutantes knock-out de tipo salvaje y Cmah y la derivatización de fluorescencia y análisis HPLC de estos componentes. La Figura 2 y la Figura 3 muestran cromatogramas HPLC representativos de ácidos siálicos de...

Discusión

El protocolo presentado aquí permite la evaluación fenotípica de ratones knock-out homocigóticos Cmah analizando y cuantificando las cantidades relativas de Neu5Gc de leche y muestras de hígado. El análisis se realizó utilizando una configuración de HPLC estándar con detección de fluorescencia. El paso más crítico de este procedimiento es la preparación de las columnas de intercambio aniónico y la realización de la cromatografía de intercambio aniónico; Para sedimentar la resina adecua...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200-400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250x4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.