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要約

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの研究者採用できます。

要約

高スループット シーケンス (seq ATAC) とトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、クロマチンのオープン (アクセス) 領域の識別に使われる方法です。これらの地域は、転写因子をバインド規制の DNA 要素 (例えばプロモーター、エンハンサー、軌跡のコントロール領域、絶縁体) を表します。アクセス可能なクロマチン風景をマッピングは、ゲノム全体で暴くアクティブ規制要素の強力なアプローチです。この情報は、関連する転写因子ネットワーク、遺伝子発現プログラムを制御するクロマチン構造のメカニズムを発見するための公平なアプローチとして機能します。ATAC seq は DNase の堅牢な代替私過敏性解析は次世代シーケンス (seq DNase) とクロマチンのゲノム解析のため規制要素 (放任 seq) のホルムアルデヒドによる分離と相まってアクセシビリティと micrococcal のヌクレアーゼ感受性サイト ヌクレオソームの配置を決定する (MNase seq) の塩基配列の決定。人間の主な免疫細胞すなわちcd4 リンパ球に最適化した詳細な ATAC seq プロトコルを提案 (T ヘルパー 1 (Th1) と Th2 細胞)。この包括的なプロトコル細胞収穫始まるクロマチン tagmentation、次世代シーケンシングの前処理の分子プロシージャを記述し、方法および計算の分析するために使用に関する考慮事項も含まれます結果を解釈します。さらに、時間とお金を節約するシーケンスの前に ATAC seq ライブラリを評価する品質への取り組みを紹介します。重要なは、このプロトコルで説明した原則は、他のひと免疫系と非免疫細胞と細胞への適応を許可します。これらのガイドラインは次世代シーケンシング方法と熟練ではない研究所の役に立ちます。

概要

ATAC seq1,2は、ヌクレオソームの配置規制3クロマチン領域の同定を可能にする堅牢な方法です。この情報は、場所、id、および転写因子の活性を推定のために適用されます。クロマチン構造の定量的変化の測定法の感度では、クロマチンの remodelers 修飾子と RNA ポリメラーゼ II1の転写活性を含むクロマチン因子の活性の検討をことができます。したがって ATAC seq は興味の任意のセル型の転写制御を支配するメカニズムを解読するため強力かつ公平なアプローチを提供します。ATAC seq の主なヒト th1 細胞や Th2 細胞への適応について述べる。

ATAC-seq に非常に活発の Tn5 トランスポザーゼはアダプター (すなわち、「tagmentation」プロセス)1DNA のタグ付けされた次世代シーケンサー (NGS) カップル DNA 断片化アダプターを搭載。得られた DNA ライブラリー PCR 増幅、次次世代シーケンス (図 1) の準備ができました。アクセス可能なクロマチンの優遇の tagmentation は、ATAC seq 配列読み取りのローカル富の分析によって検出されます。

短い実験手順とクロマチン アクセシビリティと DNase seq4、放任 seq5、および MNase seq6などヌクレオソームの位置を測定するための他の方法を基準にして以下の原料のための要件は、します。人間の一次電池1,7臨床サンプル8と同様と単細胞生物9植物10、ショウジョウバエ11 を含む複数の生物学的システムでは ATAC seq の使用を促進と様々 な哺乳類12。

アクセスの軌跡にバインドされている要素は、バインド シーケンス モチーフの濃縮を分析または高スループット DNA シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降 (チップ) と ATAC seq を組み合わせることで発見ことができます転写の idChIP-seq)。このアプローチは、マウス13での造血機構の重要な系統特異的転写因子の同定を有効にします。ATAC seq の公平かつグローバルな性質をチップ解析のための抗体などの試薬が利用できない有機体の遺伝子の規則を勉強することができます。Cis 諸国における進化バリエーションなど-初期マウス規制要素の発達的変動からヒトとチンパンジー14、頭部神経堤細胞の研究によって識別された規制地域胚15日は単細胞C. owzarzakiのライフ サイクル中に規制動向の変化9、およびプロモーターやエンハンサー1220 の哺乳類の種の間での進化。

ATAC seq はまた単一細胞におけるクロマチン アクセシビリティ通常ゲノム研究7,16を忌避する細胞集団内でこのように明らか変動を測定するため尽力されています。さらに、サンプルはまれな病態での遺伝子制御領域で発生した変更を勉強する ATAC seq を使用できます。急性骨髄性白血病 (AML)17またはRasの発症時規制の風景の変化を研究する ATAC seq を使用できますたとえば、-発癌11を駆動します。

プロトコル

Bar Ilan 大学の倫理委員会で承認されたすべての手順とプロトコル実験を承認する委員会によって提供されるガイドラインに従います

。

1。 浄化のナイーブ cd4 細胞とヘルパー t1 (Th1) と Th2 細胞に偏光

注: ここで冷凍のひと末梢血単核球 (PBMCs) から始まる手順について述べる。まず cd 4 + 細胞のマイクロ ビーズを使用して分離することで構成され、列は通常、cd4 陽性細胞の 95% 以上を与えます。ただし、この手順は、各演習で最寄りのプロトコルによって異なります。T 細胞の活性化および偏波用のプロトコルは、ジェンナー ら から変更されました。(2009 年) 18. 分離の cd 4 + 細胞 1000 万 PBMCs 与えるから 400 万の cd4 陽性細胞に上昇します。ちょうど一週間以内条件降伏 300 万 th1 細胞と Th2 細胞の Th2 偏光と 2 つのフラスコに分割、Th1 栽培します

。

注: 開始する前に 4 ° C に遠心分離機クールダウン

。
  1. 人間の PBMCs の解凍 1 mL (10 7 セル) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM L グルタミン 10% 熱不活化牛胎児血清と RPMI 培の 10 ml、50 mL のチューブで。500 x g で 5 分間削除上澄みで遠心し、補われた RPMI 培地 15 mL で 25 mL の滅菌ピペットで細胞を再懸濁します。コート t75 フラスコ培養用フラスコ細胞 (25 mL の滅菌ピペット) に転送します
    2. 。
  2. (37 ° C、5% CO 2) 加湿インキュベーターで一晩セルのままにします
    3. 。
  3. は、25 mL の滅菌ピペットで浮遊細胞を 50 mL チューブに転送します。トリパン ブルー色素排除により細胞数と生存率を決定します
    4. 。
  4. 1000 万から分離の cd 4 + 細胞ライブ非付着 PBMCs cd4 マイクロ ビーズと、メーカーによると列を使用して肯定的な選択によって ' 推奨値 (テーブルの材料/機器 を参照) 次のように変更: 10 7 PBMCs は 30 μ L の PBS で 0.5 %bsa の 120 μ L で CD4 マイクロ ビーズが付いています
    5. 。
  5. は、水溶性の抗 CD28 (2 μ G/ml)、プレート連結抗 CD3 (5 μ g/mL) 以上より 2 (10 ng/mL) で、72 h の cd4 陽性 T 細胞をアクティブにします。Th1 偏波以上より 12 (20 ng/mL) と反-IL-4 (10 μ G/ml) を追加します。Th2 の偏波、以上より 4 (40 ng/mL) と反 IFN-γ (10 μ G/ml) を追加します
    6. 。
  6. 以上より 2 (10 ng/mL) の存在下でさらに 7 日間と同じ偏光サイトカイン (Th1 の以上より 12 と Th2 の以上より 4) 培養します
    7. 。

2。核分離

注: ATAC seq はそのまま核で実行されます。換散バッファー 0.05% = ノニルフェニル ポリエチレング リコール配合主なヒト th1 細胞や Th2 細胞から核を分離する校正 (テーブルの材料/機器 を参照してください)。実験用試薬とセルのこのステップのキャリブレーションをお勧めします。不十分な洗剤からそのままなセルの過剰は、転位反応の効率を低下させます。セル換散の効率は、セルの合計数に対する核 (トリパン ブルー陽性細胞) の数によって決まります
。 注: 換散バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM の NaCl、3 mM MgCl 2) を準備します。4 スイング バケツの回転子の遠心分離機を冷やす ° c. の固定角度の遠心分離機ではなくスイング バケツ遠心分離機でセルをペレット化細胞/核損失を低減します。核やピペット上清を廃棄するときに慎重に、セル損失を回避する

。 (最終濃度 0.05%) に
  1. 追加新鮮なノニルフェニル ポリエチレング リコールと使用の直前に冷たい換散バッファー (1 x の最終濃度) にプロテアーゼ阻害剤 × 100。氷にバッファーを維持
  2. カウント T 細胞の量とトリパン ブルー法による生存率を決定します。高い非特異的消化 90% 計算結果よりも低い生存率
    3. 。
  3. 1.5 mL マイクロ チューブに転送 0.5 x 10 6 T 細胞 (Th1 または Th2)。4時 5 分 500 x g でスピンダウン ° C
  4. は、冷のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。4時 5 分 500 x g でスピンダウン ° C
  5. (= ノニルフェニル ポリエチレング リコールとプロテアーゼ阻害剤を含む) 冷たい換散バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。氷の上の管を保ちます。核を中断することを避けるためにゆっくりピペット
    6. 。
  6. 迅速に 10 μ L を取るし、分離細胞のマイクロ チューブは氷の上は自動化された細胞カウンターでセルをカウントします。この手順は、核の損傷を避けるために 5 分を超えない。少なくとも 80% の細胞を分離する必要があります
    7. 。
  7. 転位反応をすぐに続行します。氷の準備の核を保つ

3。転位反応

注: このステップで隔離された核は原核生物 Tn5 トランスポザーゼ (TDE1) NGS シーケンス用のアダプターが読み込まれると孵化させます。非常に活発な Tn5 は同時に DNA の断片し、ゲノム (tagmentation プロセス) のアクセス可能な領域にアダプターを郭します。核と Tn5 トランスポザーゼの比率は、アクセス可能なクロマチンで優遇胸の谷間にとって重要です。このプロトコルを 100 μ L 反応量 100,000 核校正します。ただし、反応を縮小することができます

。
  1. 37 熱シェーカーで温度を設定 ° C
  2. 1.5 mL のマイクロ チューブに転送 100,000 核
    3. 。
  3. 500 x g でゆっくりと 4 ° C で 10 分間遠心上清を削除します
    4. 。
  4. で指定された テーブル 1 として核に転位反応コンポーネントを追加します
    5. 。
  5. 穏やかなピペッティングによって再懸濁します
    6. 。
  6. は穏やかな揺れ (500 rpm) で 37 ° C で 30 分間熱シェーカーの転位反応をインキュベートします
    。 注: DNA クリーンアップは固相リバーシブル固定化ビーズ 19 によって実行されます (テーブルの材料/機器 を参照) または PCR の浄化のコラム。クリーンアップの端 10 mM トリス-HCl、pH 8 の 20 μ L の dna を溶出します。溶出バッファーで EDTA を避ける
    7. 。

4。ATAC seq ライブラリの PCR 濃縮

注: この手順が挿入されたアダプターと ATAC seq ライブラリ すなわち DNA のフラグメントを増幅する目的としました。同じ次世代シーケンシング レーンのいくつかの ATAC seq ライブラリの混合を許可する (" 多重 ") 使用インデックスすべてのサンプルに対してプライマー 1 (Ad1_noMx) 1 と別インデックス (バーコード) プライマー 2 (Ad 2.1 2.24)各サンプルの 1。プライマー シーケンスが補われた テーブルの材料/機器 提供されます

。
  1. 最初の PCR の拡大
    注: プライマー 1 (Ad1_noMx) およびプライマー 2 の作業濃度は 25 μ M。すべてのプライマーは、100 μ M の元の在庫から 25 μ M に希釈しました。PCR の反作用のすべて、プライマー 1 (Ad1_noMx) とインデックス付きのプライマー 2 の 1 つだけを使用します。
    1. で指定されている 表 2 として滅菌 PCR チューブ PCR の反作用のコンポーネントを追加します
      2. 。
    2. 場所 PCR サーマルサイクラーに管および 表 3 に詳細なサイクリング条件を使用して PCR 増幅を実行します
      3. 。
  2. 追加の増幅サイクル数の評価
    注: 追加の PCR のサイクル数は、ライブラリ フラグメント f の十分な量を得られるはずまたは実行すると、GC を避けるために、バイアス 20 のサイズを最小化しながら成功次世代シーケンス。最適なライブラリ フラグメントの増幅に必要な PCR のサイクル (N) の数の決定は、量的な PCR (qPCR) によって行われます。
    1. 希釈プライマー 1 (Ad1_noMx) と 2 (初期ライブラリ増幅用) 25 μ M から 6.25 μ m.
    2. 光の PCR チューブやプレート の表 4 で述べたようにコンポーネントを追加します
      3. 。
    3. QPCR 楽器とで指定された 表 5 サイクル
      4. 。
    4. 追加の増幅の必要使用回数 (N) を推定する x 軸と y 軸に相対的な蛍光 (RFU) にサイクル数をプロットします
      5. 。
    5. 追加の増幅の数サイクル (N) は 1/3 qPCR 反応着いた高原サイクルの数です。 図 2 は、RFU (太い緑色の線) 〜 2,350 相対蛍光ユニットで、高原に達している ATAC seq ライブラリの 3 つの例を示します。(783 RFU、y 軸上のマーク) の最大の量の 3 分の 1 は増幅される PCR のサイクル数ライブラリ (赤と青増幅曲線) の 2 つの 8 サイクルと第 3 のライブラリ (ピンク) の 9 の PCR のサイクルに対応しています
      6. 。
  3. 最終的な PCR 増幅
    1. 残りの 45 μ L の PCR 反応を増幅します。サーマルサイクラーの 4.1.2 の手順から増幅反応を含む PCR チューブを配置します。表 6 に示す PCR プログラムを実行します。以前に決定された (ステップ 4.2.5) (N) の拡大のサイクル数を使用します
      2. 。

5。サイズ選択の ATAC Seq ライブラリ

注: から高分子量ライブラリ フラグメントがなくなり、増幅 ATAC seq 図書館のサイズ選択が次世代シーケンシングの結果を向上我々 の経験で、最終の ATAC seq ライブラリ
。 注: 使用前に 30 分常温にする磁気ビーズを許可します
。 ヌクレアーゼ フリー水に新鮮な 70% エタノールを準備します

。
  1. 磁気ビーズを混合することによって再懸濁します
    2. 。
  2. (4.3.1 のステップで取得) ATAC seq ライブラリにヌクレアーゼ フリー水を追加し、最大 100 μ L をもたらすします
    3. 。
  3. 追加 50 μ L (0.5 x) 増幅されたライブラリの 100 μ L に再懸濁の DNA 結合磁性体ビーズ。10 回以上でピペッティングを上下で混ぜます。室温で 5 分間のサンプルをインキュベートします。マイクロ チューブ、必要に応じて迅速にスピンダウンします
    4. 。
  4. は、上清から磁気ビーズを分離する 2 分の適切なマグネット スタンドにチューブを置きます。2 分後に上清を新しいチューブに転送します
    5. 。
  5. は、ピペットで上澄みの量を測定し、磁気ビーズの 0.7 倍を追加します。10 回以上でピペッティングを上下でミックスします
    6. 。
  6. では、室温で 5 分間インキュベートします。2 分のマグネット スタンド上の場所
  7. 後、2 分インキュベーションは、上澄みを廃棄します。チューブは、マグネット スタンドに、ビーズを洗浄する 200 μ L たて 70% エタノールを追加します
    8. 。
  8. 保つ 30 のための磁石にマイクロ チューブ s とし、破棄、エタノール。ステップ 5.7.for 2 最終的なエタノール洗浄を繰り返します
    9. 。
  9. には、残りのエタノールとチューブは磁石の上 5 分のビーズが空気乾燥させる完全に削除します。必要に応じて、スピン、チューブが簡単に。P10 ピペット チップとエタノールのトレースを削除します
    10. 。
  10. は磁石から、チューブを外し 10 mM トリス-HCl、pH 8 の 22 μ L を追加します。EDTA を含むバッファーの ATAC seq ライブラリを溶出しません
    11. 。
  11. 室温で 2 分間チューブをインキュベートし、マグネット スタンドに配置します
    12. 。
  12. ソリューションが明確、新しい滅菌チューブに 20 μ L の溶出ライブラリを転送します
    13. 。
  13. ストア サイズ選択-20 ATAC seq 図書館 ° C

6。ATAC Seq ライブラリの品質分析

  1. リアルタイム PCR を用いた ATAC seq ライブラリの品質の検証
    注: 次世代前に ATAC seq ライブラリのノイズ比率への信号を評価することが重要です。シーケンス。これは、量的な PCR (qPCR) を利用したアクセスとアクセスできない軌跡からの DNA のフラグメントの相対的な量を決定することによって行われます。アクセスの軌跡 (ネガティブ コントロール、chr1:48、137、860 48,137,934、chr1:193、093、748 193,093,827) プライマー 1 と 2 によって増幅されます。アクセスの軌跡 (肯定的な制御、chr19:30、336, 166-30,336,253 と chr19:11546154-11546237) 3 と 4 のプライマーによって増幅されます。正と負の遺伝子座は、人間 cd 4 + 細胞 (エンコード系統 ENCSR000EQE および ENCSR000EQG) のクロマチン アクセシビリティ (DHS seq) プロファイルから定義されています。否定的なプライマー 1 大型多色遺伝子間領域 (230 kb TRADB2 から、FOXD2 から 88 kb) にあります。CDC73 遺伝子のイントロンが最初に存在する陰性対照地域 2。プライマー 3 はクロマチンの領域内で、肯定的な肯定的なプライマー 4 中サイクリン E (CCNE1) 遺伝子の下流は内の中央蛋白質キナーゼ C 基板 80 K ・ h (PRKCSH) プロモーター。重要なは、これらの制御遺伝子はひと細胞のタイプの広いスペクトルから ATAC seq ライブラリを監視する適用できることを示唆しているエンコード プロジェクト 3 から他の細胞型でアクセシビリティの同様のパターンを表示します。プライマー効率すべてプライマーの特異性 (人間の Th 細胞) 由来の DNA の連続希釈と得られた増幅産物の融解曲線解析に関する qPCR で確認されました。
    1. 、市販を使用してゲノムの DNA を隔離キット (テーブルの材料/機器 を参照してください).
    2. 増幅 ATAC seq を希釈ライブラリ 1:10 (1 μ L ライブラリ + ヌクレアーゼ フリー水の 9 μ L) とゲノム DNA 〜 5 ng/μ L にします
      3. 。
    3. 反応が 3 通で実行されることを考慮、各の正と負のコントロール プライマー対の反応混合物 (表 7) を準備します
      4. 。
    4. QPCR マスター ミックス製造者が推奨するプロトコルによると qPCR サーマルサイクラーで加温します
      5. 。
    5. は、qPCR 測定器の結果を分析 ' s ソフトウェア (テーブルの材料/機器 を参照してください)。コントロールのサンプルとしてゲノム DNA を選択します。得られた値は、(肯定的な制御のプライマーによって増幅された) アクセス領域の強化を表しています。例を 表 8 に示します
      。 注: 平均ライブラリのサイズと濃度の推定: ATAC seq ライブラリからの DNA のフラグメントのサイズ分布は、メーカーによると高感度自動電気泳動装置によって決定されます ' の指示。DsDNA 高感度キットと少なくとも 2 μ L の各 DNA のサンプルを使用して蛍光光度計のサンプル濃度を測定することをお勧めします
      。 注: 次世代シーケンサー - ライブラリを多重化する前に、数式を使用して ATAC seq ライブラリごとのモル濃度を計算: (ng/μ L x 10 6)/(x 平均ライブラリ 660 フラグメントの長さ)。目指せ > クロマチンを評価する各 ATAC seq ライブラリの読み取りは 3000 万ひと試料の領域。ライブラリが NGS の配列のために十分によいことを確認する場合は、当初 1000 万読み取り (急速な実行モードで DNA シーケンシング装置のシーケンス車線の 5%) を目指してください。ヌクレオソームの配置を推測するペアエンド シーケンス必要な 1 であることを覚えておいて
      6. 。

7。次世代シーケンシングの得られた結果の解析

  1. FastQC ファイル、個別にすべてのライブラリを調べることによって配列読み取りの品質を推測します
    2. 。
  2. は、Unix/Linux 環境でボウタイ 21 ソフトウェアを使用して人間の参照ゲノム (hg19 アセンブリ) に読み取りを合わせます。コマンドは ' ボウタイ -m 1 - q-S ゲノム ディレクトリ reads.fastq output_aligned.sam '。ゲノム ディレクトリは、ボウタイのゲノムのインデックスが格納されているフォルダーの略です。パラメーター -m 1 が読み取りのゲノムの 1 つ以上の軌跡との配置を許可しないため、- q は fastq 形式でする必要があります入力ファイルのため、-S は、サムの形式での出力の
    3. 。
  3. は、Unix/Linux 環境で SAMtools 22 rmdup オプションを使用して重複する読み取りを削除します。コマンドは、' samtools -S output_aligned.sam b を表示 |samtools ソートの -o-output_aligned > output_aligned.bam '、
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '。最初のコマンドは、ビューは、その後にソートされている BAM 形式にサム形式を変更します。Rmdup のオプションは、ソートされた BAM ファイルに適用されます。必要に応じて 1 つは元の ATAC seq 紙 1 で説明するようトランスポゾン挿入サイトの読み取りを調整できます。これは、Unix/Linux 環境で 23 のコマンド BEDtools を使用しています。コマンドは、' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed '、' shiftBed、私 output_aligned _rmdup.bed p 4-m-5-g ゲノム > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '。BamTobed、最初のコマンドは、shiftBed コマンドの使用することができますベッド形式に BAM 形式を変更します。ゲノム ファイル各染色体ゲノムの長さを含むタブ区切りファイルです。ファイルが BEDtools ディレクトリに追加されます通常
    4. 。 次のパラメーターで移されたベッド ファイルの Unix/Linux 環境でチップ seq (MACS2) 24 ソフトウェアのモデルベースの解析を使用して
  4. 実行ピーク通話: - nomodel-extsize - 75 シフト-30。トランスポゾンの挿入部位は各シーケンスの読み込み途中で読み取りを調整するこれらのパラメーターを使用します
    5. 。

結果

このプロトコルの最終的な結果は、通常 3-20 ng/μ L の ATAC seq ライブラリです。DNA ・ インテグリティ解析のシステムで実行すると (材料/機器のテーブル参照)、はしごのような外観2 (図 3 a) を見せます。DNA のフラグメントの平均サイズは通常 〜 450 530 bp です。

次世代シ?...

ディスカッション

ここで記述されている ATAC seq プロトコルは一次電池でアクセス可能なクロマチンの分析のため正常に採用されている (ヒト th1 細胞、Th2 細胞、B 細胞) 培養細胞株 (MCF10A ひと乳癌細胞と U261 神経膠芽腫細胞) だけでなく。ATAC seq を他の細胞型に適用すると、散のステップを中心に、いくつかのプロトコルの最適化が必要です。非イオン性洗剤の濃度が高すぎる、ミトコンドリアの DNA 汚染の割?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品はイスラエル科学財団 (グラント 748/14) でサポートされている、マリー キュリーの統合 (CIG) を付与 - FP7 人 20013 CIG 618763 とコア計画と予算委員会とイスラエル科学財団のプログラム許可第 41/11。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL tubesLumitronLUM-CFT011500-PCan be from other vendors.
MicrotubesAxygen IncMCT-175-CCan be from other vendors.
25 mL serological pipettesCorning Costar4489Can be from other vendors.
Tissue culture flaskLumitronLUM-TCF-012-250-PCan be from other vendors.
Countes Automated Cell CounterInvitrogenC10227
NucleoSpin TissueMACHEREY-NAGEL740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)ATCC PCS­800­011Can be from other vendors.
RPMI 1640 MediumBiological Industries01-103-1ACan be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)Biological Industries03-020-1BCan be from other vendors.
Penicillin-StreptomycinBiological Industries03-031-1BCan be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European GradeBiological Industries04-127-1Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, humanMiltenyi Biotec130-045-101
MACS MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-Human CD4 FITCBiogems06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITCBiogems44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE PurifiedBiogems10311-25
Recombinant Human IL2Peprotech200-02
Recombinant Human IL4Peprotech200-04
Recombinant Human IL12 p70Peprotech200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γBioLegend506513
NaCl, analytical gradeCarlo Erba479687Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology gradeCalbiochem442611Can be from other vendors.
EDTAMP Biomedicals800682Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pureMP Biomedicals819620Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)Calbiochem492016Can be from other vendors.
Protease InhibitorsSigmaP2714this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beadsBeckman63881
PCR purification kitHyLabsEX-GP200Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)IlluminaFC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master MixNew England BioLabsM0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543
SYBR Green I InvitrogenS7585
 CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-rad185-5200Can be from other vendors.
CFX Manager SoftwareBio-rad1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad172-5124Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32854
Magnet for eppendorf tubesInvitrogen12321DCan be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubesThermo Scientific75004527Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shakerMRCCan be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
High Sensitivity D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5585
4200 TapeStation systemAgilent TechnologiesG2991AATape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kitAgilent Technologies5067-4626Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequenceCompany
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'		IDTAd1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC
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Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
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Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
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Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
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Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
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Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
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Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
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Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
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Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
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Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
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Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
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Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
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Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
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Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
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Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC
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 Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
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 Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
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 Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
 Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT

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