Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Resumen

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Resumen

Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.

Introducción

Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años¹y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un "misterio abominable" por Charles Darwin². El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores^3,4,5,6 . La alta variación en forma floral y estructura, así como los modos de reproducción sexual y asexual, confiando en ellos, hacer la flor una estructura altamente compleja. Esto ha llevado a diversos esfuerzos por caracterizar las anatomía y características estructurales de los órganos florales, técnicas de luz y electrónica microscópica que podría combinarse con la investigación genética y molecular⁷. Además, como fuente de frutos y semillas, las flores son de suma importancia para la nutrición humana y animal. Por lo tanto, la caracterización del desarrollo de la flor y la fruta tiene muchas implicaciones para la investigación aplicada, incluyendo la seguridad alimentaria de una población humana creciente y las estrategias de conservación ecológica en un cambiante ambiente^{8 , 9 , 10}.

Desarrollo de la flor en Arabidopsis comienza con la inducción floral y la transformación de lo meristemo vegetativo a un meristemo de la inflorescencia (grupo de flores). Primordios de flores se inician lateralmente en el flanco de la inflorescencia meristem¹¹. Los primordios de órganos florales forman progresivamente en verticilos concéntricos desde el exterior al centro de la flor y eventualmente convierten en sépalos, pétalos, estambres y carpelos⁷. Estos órganos florales cumplen protección nutritiva, distinta y funcional (por ejemplo, atracción de polinizadores) papeles en diferentes especies de plantas, con los órganos sexuales, sostener el desarrollo de los gametofitos masculinos y femeninos, respectivamente^{12 , 13}. los gametofitos, a su vez, cada uno distinguen un par de hombre (espermatozoides) y los gametos femeninos (óvulo y célula central), que se unen con doble fertilización para formar la próxima generación, el zigoto y el endosperma primario, un soporte de tejido terminal la desarrollo del embrión^14,15. Apoyo al desarrollo de frutos y semillas el crecimiento, maduración y conservación del embrión y, eventualmente, su dispersión. Se ha realizado una amplia investigación para caracterizar el desarrollo flor y embriones de diversas especies, especialmente en la especie modelo Arabidopsis^7,16,17.

Primeros análisis microscópicos del desarrollo de la flor se basaron en la observación técnicas tal como parafina o incrustación de resina y seccionamiento, combinación con la luz o la microscopía electrónica y procesamiento de las muestras requiere mucho tiempo. Estas técnicas microscópicas tradicionales fueron utilizadas a menudo en combinación con las investigaciones genéticas moleculares, como el análisis microscópicos de mutantes, la localización del ARN mediante hibridación en situ o la inmuno detección de proteínas. Recientes avances en microscopía de fluorescencia confocal y de amplio campo, en análisis de imagen asistido por ordenador 3D de estado de la técnica y el refinamiento continuo de los métodos moleculares que pueden utilizarse en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a la necesidad de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo que son preferentemente susceptibles de análisis cuantitativos. En los últimos años ha realizado progresos significativos en el desarrollo de técnicas claro espécimen animal montaje en conjunto. Procesar la muestra transparente mediante reactivos de urea o azúcar-base acuosa (p. ej., escala, SeeDB, cúbico)^18,19,20, o eliminando selectivamente lípidos (usando el detergente SDS) después de inclusión de muestras en hidrogeles estables; la eliminación de lípidos puede lograr ya sea por difusión pasiva (p. ej., modificado claridad protocolo²¹, pacto-PARS-llantas²²) o activamente por electroforesis (original claridad protocolo²³ y²⁴de la ley-PRESTO). Alentado por este progreso rápido, algunas técnicas derivadas también están surgiendo para su uso en las plantas.

En este trabajo métodos centrado en el modelo de Arabidopsis, describimos el procedimiento para la adecuada disección de capullos, flores y jóvenes silicuas y claro de todo Monte muestras para coloración diversa y procedimientos de observación mediante clásico o un método reciente de compensación basada en la SDS. Se dan ejemplos para almidón, Callosa y la coloración de la cromatina. Aunque estos procedimientos pueden necesitar más mejoras y adaptaciones cuando se utiliza con otras especies, esperamos se fijaron la etapa para la investigación adicional sobre estos métodos simples pero fundamentales que son el punto de partida de muchos proyectos de investigación.

Protocolo

1. flor y fijación de silicua

1. Flores de la cosecha y silicuas de plantas sincronizan en la inauguración de la primera flor.
   Nota: Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí, plantas Inicio floración aproximadamente 21 días después del trasplante de las placas de Murashige y Skoog (MS) al suelo. Semillas estratificadas durante 3 – 4 días a 4 ° C y germinado/cultivadas en placas de MS de 22 ° C/16 h luz y 18 ° C/8 h oscurezca durante 8 a 10 días, antes de transplantar las plántulas en suelo rico en nutrientes en macetas bajo las mismas condiciones (figura 1). El número de repeticiones depende del objetivo específico de investigación, pero se recomienda un mínimo de 5 inflorescencias (a partir de 5 plantas individuales) para cada tratamiento. Si las flores son la unidad experimental, se recomienda un mínimo de 10 flores por repetición.
2. Cortar las inflorescencias o flores (Figura 1E-H) con unas tijeras pequeñas (por ejemplo, tijeras) y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (para fijación de flor inflorescencia única) o en un tubo cónico (para fijaciones colectivas) que contiene recién hecho de Carnoy metanol/ácido acético y fijadores FPA50 (dependiendo de la aplicación, vea abajo) en el hielo.
   Nota: Las muestras deben estar completamente sumergidas en el fijador.
3. Dejar el tejido en el fijador durante 4 horas hasta toda la noche a 4 ° C.
   Nota: Infiltración de vacío puede utilizarse para acelerar la penetración del fijador en el tejido, pero esto puede ser perjudicial a la preservación de la estructura del tejido. Los autores no implementan infiltración vacío.
4. Retirar el fijador, agregar suficiente etanol 70% para cubrir las muestras y volver a 4 ° C durante al menos 24 h; las muestras pueden permanecer indefinidamente en esta solución. Después de extraer el etanol, proceder de inmediato al siguiente paso; disección, o claro de SDS.

2. disección bajo el estereomicroscopio

1. Puesto recién hecho etanol al 70% en vidrio de relojero a una placa Petri pequeña de apoyo.
2. La inflorescencia, flor/silicua en este recién hechas fijador y disecar bajo el estereomicroscopio con fórceps y una jeringa con una aguja.
   1. Use vidrio o dispositivo similar que permite que las muestras de estar totalmente cubierto con etanol (recomendado) para la disección de las inflorescencias y desgarrando órganos florales de las flores maduras (sépalos, pétalos y estambres puede ser diseccionado en esta etapa un relojero ) para evitar el riesgo de secar muestras.
3. Diseccionar silicuas y pequeños capullos en una diapositiva como se describe a continuación.
   1. Dejar a un lado vidrio de relojero con muestras previamente procesadas y utilice una diapositiva normal para la disección final.
   2. La muestra de interés hacia la diapositiva y agregar 10 μl de etanol al 70% fresco. Trabajar con rapidez en la disección final y añadir 10 μl de etanol, si es necesario, para mantener la muestra húmeda sin el líquido excesivo.
   3. Para soltar los granos de polen de los estambres, consulte el paso 5.1. Para la disección de los carpelos y los óvulos, siga el procedimiento descrito en la figura 2. Este procedimiento se aplica a todas las etapas de desarrollo del carpelo, incluyendo la etapa de desarrollo de silicuas verdes.
      Nota: No agregue etanol si hay suficiente remanente de etanol de mover las muestras; disección de muestras muy pequeñas es mucho más fácil en una cantidad mínima de líquido. Mantenga sólo los órganos de interés (sépalos, pétalos, estambres, carpelos, óvulos, semillas o granos de polen) en la diapositiva. Este procedimiento asegurará un espesor uniforme entre el portaobjetos y cubreobjetos, correspondiente al espesor del órgano objeto de examen, resultando en una mayor homogeneidad y así eficacia para exámenes microscópicos (mayor número de ejemplares de blanco en el mismo plano focal).
4. Use un pequeño trozo de papel secante para absorber y eliminar tanto etanol como sea posible. Proceder rápidamente al siguiente paso (sección 3, 4 o 6) antes de la muestra se seca a cabo.

3. a base de hidrato de cloral claro y tinción combinada de claro

Nota: Se obtienen mejores resultados de limpieza base de hidrato de cloral con FPA50 fijada material.

1. Lugar 20 μl de solución de limpieza (hidrato de cloral/glicerol, modificado medio de Hoyer, 4½ de Herr o soluciones de IKI-4½ de Herr) en la diapositiva del rodamiento de la muestra. Con un par de jeringas con agujas hypodermal, coloque los especímenes reduciendo el espacio entre ellos, y los bancos donde el órgano de interés se enfrenta hacia abajo. Eliminar cualquier burbuja de aire restante usando la aguja.
2. Bajar lateralmente un cubreobjetos y colocarlo, presionando muy suavemente suavemente y espere hasta que la solución claro llena el espacio entre. Añadir solución de compensación mínima, si es necesario, para llenar todo el espacio bajo el cubreobjetos.
3. Coloque el portaobjetos sobre un soporte deslizante y dejarlo bajo la campana. Proceder a observaciones microscópicas después de al menos 4 h y durante los siguientes días 4 – 5.

4. combinado Alexander tinción y claro 4½ de Herr de anteras

Nota: El protocolo original de Alexander se basa en la liberación de los granos de polen en la diapositiva antes de la tinción. Un eficiente y más informativo, modificado Alexander coloración y procedimiento de despejo son la tinción de granos de polen maduros dentro de las anteras maduras pero no dehiscente.

1. Elegir capullos recién cosechados que se van a abrir con anteras no dehiscente.
   Nota: No tome más jóvenes capullos porque Alexander manchas está diseñado para los granos de polen maduros y no mancha eficientemente los granos de polen inmaduros. Se recomienda un mínimo de 5 flores por tratamiento de inflorescencias y diversas plantas.
2. Preparar una placa de 96 pocillos con solución de suficiente Alexander sumergir un brote de flor. Exponer las anteras quitando los sépalos y pétalos y sumergirlos en solución de Alexander. Mantener las muestras bajo la campana para 1-3 h.
3. Reemplazar la solución de Alejandro con la solución 4½ de Herr y coloque la placa multi-bien debajo de la campana para una incubación durante la noche.
4. Con unas pinzas, mueva suavemente los botones florales despejados hacia una nueva diapositiva. Puesto que puede ocurrir algún remanente de la solución de Alejandro, utilice un papel secante para quitar tanta solución claro como sea posible.
5. Diseccionar los estambres y quitar todos los otros tejidos. Siga los pasos en la sección 3 con solución 4½ de Herr.

5. eliminación de la exina de los granos de polen

Nota: Recomendamos usar fijador de Carnoy para tinción DAPI.

1. Siga los procedimientos de disección y fijación que se describe en las secciones 1 y 2. Por ahora, uno debe tener de uno a muchos estambres en la diapositiva dentro de una mínima cantidad de etanol al 70%.
2. Utilice un papel secante para quitar exceso etanol y añadir 5-10 μl de la solución DAPI. Utilizando un par de jeringas con agujas, liberar los granos de polen dentro de esa pequeña cantidad de solución (por ejemplo, uso una jeringa para inmovilizar el estambre y el otro para liberar los granos de polen). Si la solución se seca, agregue otro 5 μl de DAPI.
3. Quitar toda la suciedad del estambre es un paso crítico, que sólo los granos de polen quedan entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
4. Coloque un cubreobjetos sobre la diapositiva del rodamiento de la muestra bajando hacia los lados y añadir la mínima cantidad de solución DAPI que llenan el espacio. Coloque el dedo índice sobre el cubreobjetos, y sin aplastamiento muy mucho hacer un rápido y firme y corto movimiento de deslizamiento.
   Nota: Para medir la fuerza necesaria y la amplitud del movimiento deslizante, este paso debe realizarse varias veces, comprobar los resultados cada vez que bajo el microscopio.
5. Agregar solución DAPI si es necesario y mejorar el portaobjetos en una caja húmeda en la oscuridad a 4 ° C por 15 min a 1 h. proceder a observar las muestras con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h. tratar de combinar este procedimiento con el SDS claro para comprobar si otro lugar momentos pueden obtenerse.

6. sodio dodecil sulfato (SDS) de claro

Nota: Según el órgano floral a analizar y habilidades del investigador para disecar los especímenes muy suaves y pequeño, el tratamiento de SDS puede realizarse ya sea antes (para investigadores experimentados) o después de la disección paso (por menos los investigadores) en ácido acético en metanol fijada material.

1. Usar vidrio de relojero, un portaobjetos cóncavo o un tubo de microcentrífuga para incubar muestras disecadas o no disecado en 0.2 N NaOH solución durante la noche a temperatura ambiente y 1% SDS.
2. Manejar con cuidado porque la muestra es muy suave y tiene un aspecto transparente. Enjuague varias veces con agua.
   Nota: Remanente de la solución de SDS podrían conducir a la precipitación al añadir la solución de tinción, por ejemplo, azul de anilina.
3. Para muestras no disecados, siga el procedimiento de disección que se describe en la sección 2, utilizar agua en lugar de etanol al 70%. Después de disecar el tejido deseado, retire cualquier restos y residuos y cualquier exceso de agua con un papel secante, luego añadir 20-40 μl de solución de tinción y continúe con el paso 6.5.
4. Para las muestras disecadas, cuidadosamente mover la muestra de la solución de lavado y colóquela en un portaobjetos limpio y añadir 20-40 μl de solución de tinción.
5. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos bajando hacia los lados. Tenga cuidado de no para aplastar la preparación. Si el tejido es muy suave, lugar cualquiera delgada separador entre el portaobjetos y el cubreobjetos en sus esquinas(por ejemplo, cinta o un cubreobjetos roto), dejando un espacio de cámara como entre portaobjetos y cubreobjetos, tal que el cubreobjetos no triturar a la muestra.
6. Coloque todas las diapositivas dentro de una caja húmeda, cubrir con papel de aluminio y coloque en 4 ° C durante por lo menos 1 h. proceder a observar a la muestra con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h.

Resultados

Arabidopsis pertenece a la familia Brassicacea, teniendo las inflorescencias con flores bisexuales dispuestas en un corimbo (figura 1). Cada flor tiene 4 sépalos, cuatro pétalos, seis estambres (cuatro largos y dos cortos) y un Gineceo sincárpico de dos congénitamente carpelos (Figura 1F-H) dispuestos en cuatro verticilos concéntricos^25,26. ...

Discusión

La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.