Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.

Abstract

Studio dei vari eventi regolatori del ciclo cellulare in un modo dipendente dalla fase fornisce una chiara comprensione sulla crescita delle cellule e la divisione. La sincronizzazione delle popolazioni delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare è stata trovata per essere molto utile in tali sforzi sperimentali. Sincronizzazione delle cellule dal trattamento con sostanze chimiche che sono relativamente meno tossico può essere vantaggioso rispetto all'uso di farmaci inibitori farmacologici per lo studio del ciclo cellulare conseguente eventi e ottenere arricchimento specifico delle fasi mitotiche selezionati. Qui, descriviamo il protocollo che sincronizzazione cellule umane nelle diverse fasi della cella ciclo, compresi sia in fase S e M con un blocco di doppia timidina e rilasciare procedura per studiare la funzionalità delle proteine mitotic in allineamento del cromosoma e la segregazione. Questo protocollo è stato estremamente utile per studiare i ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono funzioni di interfase stabilito. Nel nostro caso, il ruolo mitotic di Cdt1, una proteina fondamentale per la replica di origine licenza nella fase G1, possa essere studiato in modo efficace solo quando Cdt1 G2/M-specifici possono essere esaurite. Descriviamo il protocollo dettagliato per lo svuotamento di G2/M specifiche Cdt1 utilizza la sincronizzazione della timidina doppia. Abbiamo anche spiegare il protocollo di fissazione delle cellule e live imaging cellulare mediante microscopia confocale ad alta risoluzione dopo il rilascio della timidina. Il metodo è anche utile per analizzare la funzione delle proteine mitotic in condizioni sia fisiologiche che sconcerta come per Hec1, un componente della Ndc80 complesso, poiché consente di ottenere campioni di grandi dimensioni di cellule mitotiche per cella fissa e dal vivo analisi come indichiamo qui.

Introduzione

Nel ciclo cellulare, le cellule subiscono una serie di eventi altamente regolamentati e controllati temporaneamente per la duplicazione esatta del loro genoma e la proliferazione. Nei mammiferi, il ciclo cellulare è costituito da interfase e fase M. In interfase, che consiste di tre fasi - G1, S, e G2, la cellula Duplica il suo genoma e subisce una crescita che è necessaria per ciclo cellulare normale progressione^1,2. Nella fase M, che consiste di mitosi (profase, prometafase, metafase, anafase e telofase) e citochinesi, un cellulare parentale produce due cellule figlie geneticamente identiche. Nella mitosi, sorella cromatidi del genoma duplicato sono condensati (Profase) e vengono catturati a loro cinetocori dai microtubuli del fuso mitotico assemblato (prometafase), che spinge il loro allineamento alla piastra di metafase (metafase) seguita da loro uguale segregazione quando sorella cromatidi sono diviso verso e trasportati al mandrino opposto poli (anafase). Le due cellule della figlia sono fisicamente separate dall'attività di un anello contrattile di actina-basato (telofase e citochinesi). Il cinetocore è una struttura specializzata proteinaceo che assembla alla regione centromerica di cromatidi e fungono da siti di attacco per i microtubuli dell'alberino. La sua funzione principale è di guidare la cattura del cromosoma, allineamento e aiuto nella correzione allegato microtubule mandrino improprio, mentre mediando il checkpoint di montaggio del mandrino per mantenere la fedeltà del cromosoma segregazione^3,4.

La tecnica di sincronizzazione del cellulare serve come uno strumento ideale per comprendere gli eventi molecolari e strutturali coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Questo approccio è stato utilizzato per arricchire le popolazioni delle cellule alle fasi specifiche di vari tipi di analisi, tra cui analisi di espressione genica, analisi di processi biochimici cellulari e la rilevazione della localizzazione subcellulare delle proteine. Cellule di mammifero sincronizzate possono essere utilizzate non solo per lo studio dei prodotti genici individuali, ma anche per gli approcci di analisi di genomi interi tra cui analisi di microarray di gene espressione⁵, miRNA espressione modelli⁶, regolazione traduzionale⁷e l'analisi proteomica di proteina modifiche⁸. Sincronizzazione può anche essere utilizzato per studiare gli effetti di espressione genica o proteina knock-down o knock-out, o di sostanze chimiche sulla progressione del ciclo cellulare.

Le cellule possono essere sincronizzate nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Metodi fisici e chimici sono ampiamente utilizzati per la sincronizzazione delle cellule. I criteri più importanti per la sincronizzazione delle cellule sono che la sincronizzazione dovrebbe essere noncytotoxic e reversibile. A causa delle potenziali conseguenze negative cellulare di sincronizzazione di cellule da agenti farmacologici, metodi chimico-dipendente possono essere vantaggiosi per studiare gli eventi chiave del ciclo cellulare. Ad esempio, hydroxyurea, amphidicolin, mimosina e lovastatina, può essere utilizzati per la sincronizzazione delle cellule in fase G1/S ma, a causa del loro effetto sulle vie biochimiche che inibiscono, attivare meccanismi di checkpoint del ciclo cellulare e uccidere un importante frazione delle cellule^9,10. D'altra parte, feedback inibizione della replicazione del DNA con l'aggiunta di timidina ai media crescita, noti come "blocco" di timidina, può arrestare il ciclo cellulare a determinati punti^11,12,13. È inoltre possibile sincronizzare le cellule in fase G2/M trattando con nocodazole e RO-3306^9,14. Nocodazole, che impedisce di microtubuli, ha una relativamente alta citotossicità. Inoltre, le cellule nocodazole-arrestato possono tornare in interfase precocemente di slittamento mitotico. Doppia timidina blocco arresto cellule alla fase G1/S e dopo il rilascio dal blocco, le cellule si trovano a procedere in modo sincrono attraverso G2 e nella mitosi. La normale progressione del ciclo cellulare per cellule rilasciato dal blocco di timidina può essere osservata in microscopia confocale ad alta risoluzione da fissazione delle cellule o formazione immagine dal vivo. L'effetto di perturbazione delle proteine mitotic possa essere studiato specificamente quando le cellule entrare e procedere attraverso mitosi dopo il rilascio dal blocco doppio della timidina. Cdt1, una proteina multifunzionale, è coinvolto nel DNA replica origine licensing in fase G1 e inoltre è richiesto per gli allegati cinetocore dei microtubuli durante la mitosi¹⁵. Per studiare la funzione di Cdt1 durante la mitosi, uno ha bisogno di adottare un metodo che evita l'effetto del suo svuotamento su replica delle licenze durante la fase G1, mentre allo stesso tempo effettuando il suo svuotamento in particolare durante la fase G2/M solo. Qui, presentiamo dettagliati protocolli basati sul blocco di timidina doppia per studiare il ruolo mitotico delle proteine eseguire diverse funzioni nelle varie fasi del ciclo cellulare da formazione immagine fissa e cellule vive.

Protocollo

1. doppio blocco di timidina e rilascio: preparazioni di reagente

1. Fare 500 mL che Dulbecco per volta medium medium (DMEM) Eagle supplementato con 10% FBS, penicillina e streptomicina.
2. Fare magazzino di 100mm di timidina in acqua sterile e conservare in aliquote a-80 ° C.

2. il protocollo per l'Imaging cellulare fisso di progressione mitotica (Figura 1A)

1. Il giorno 1, seme ~ 2 x 10⁵ le cellule HeLa nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un vetrino coprioggetto (sterilizzato con etanolo al 70% e l'irradiazione UV) e 2 mL di terreno DMEM. Crescere le cellule in un incubatore per 24 h a 37 ° C e 5% CO₂.
2. 1 blocco di timidina^st : il giorno 2, miscelare accuratamente il volume richiesto di timidina nei media DMEM fresco (100 mM stock, 2mm concentrazione finale).
3. Aggiungere 2 mL di timidina contenente media per le cellule in ogni pozzetto del pozzo 6-piastra ed incubare per 18 h.
4. Il giorno 3, il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco; crescere le cellule in medium DMEM preriscaldati fresco per 9 h per rilasciare cellule dal blocco.
5. 2^nd timidina blocco: nuovamente aggiungere 2 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti.
6. Incubare per un altro 18 h.
7. Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco.
8. SiRNAs diluito (controllo e Cdt1) e reagente di transfezione in mezzo libera crescita siero separatamente per 10 min. mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.
9. Incubare le cellule a 37 ° C per 9-10 h rilasciare da bloccare e fissare le cellule su vetrini coprioggetto con 4% PFA per 20 minuti a TA.
   Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.
10. Immunostain cellule, dopo permeabilizing con detergente 0.5% (v/v) per 10 min a RT e lavare le cellule due volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
    1. Bloccare le cellule con BSA 1% (p/v) in 1X PBS per 1h a RT seguita da trattando le cellule con 50 µ l di anticorpi primari (anticorpo anti-α-tubulina, diluito 1:1, 000, anticorpo di coniglio anti-Zwint1 diluito a 1: 400 e mouse anti-fosfo-ɣ H2AX diluito a 1: 300) in 1% (p/v) BSA in PBS 1X per 1 h a 37 ^oC.
    2. Dopo aver lavato le cellule con 1x PBS tre volte, trattare le cellule con 50 µ l di anticorpi secondari per ogni vetro di copertura (Alexa 488 e rodamina rosso alle diluizioni 1: 250 a 1% (p/v) BSA in 1X PBS) per 1 h a TA.
    3. Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, trattare le cellule con DAPI (0.1 µ g / mL in PBS 1X) per 5 minuti a TA.
    4. Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, posizionare il vetrino coprioggetto rivolto verso le cellule per il supporto di montaggio appropriato su un vetrino trasparente al microscopio.
11. Immagine delle celle per le proteine immunostained con 60 X o 100 obiettivo a immersione in olio X 1.4 NA piano-apocromatico DIC montate su un microscopio confocale invertito ad alta risoluzione dotato di una fotocamera appropriato come necessario per la qualità delle immagini necessarie.
12. Acquisire immagini a temperatura ambiente come z-pile di spessore di 0,2 µm utilizzando il software appropriato per il microscopio.

3. protocollo per Live Cell Imaging della progressione mitotica (Figura 3A)

1. Il giorno 1, circa 0,5-1 x 10⁵ cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (leggermente variabile in base al tipo di cellula e le proteine che essi esprimono) in piatti di fondo di vetro 35mm con 1,5 mL di terreno DMEM di semi e farli crescere in un umidificata incubatrice per 24 h a 37 ^oC e 5% CO₂.
2. 1 blocco di timidina^st : il giorno 2, aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media per le cellule nel piatto (timidina 100mm, concentrazione finale di 2 mM,).
3. Incubare per 18 h.
4. Il giorno 3, aspirare il supporto contenente timidina e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco.
5. SiRNAs diluito (controllo e Hec1) e reagente di transfezione con il mezzo di crescita gratis siero separatamente per 10 minuti mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.
6. Crescere le cellule in 1,5 mL di terreno DMEM preriscaldato nuovo per 8 h rilasciare cellule dal blocco.
7. 2^nd timidina blocco: aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule nel piatto.
8. Incubare per un altro 18 h.
9. Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco. Poi crescere le cellule in Leibovitz preriscaldati fresco di media (L-15) completati con 10% FBS e 20 mM HEPES a pH 7.0 per 8 h rilasciare cellule dal blocco.
10. Mettere il piatto nella camera di controllo di temperatura impostata nel microscopio confocale ad alta risoluzione che ha già acceso per almeno 30 minuti prima di iniziare l'imaging per stabilizzare le temperature sul palco e sperimentale.
11. Fuoco nel campo luminoso con obiettivo 60x fino a quando le cellule sono visibili, quindi manualmente setacciare sul palco nella regione di scelta.
12. Impostare la luce e laser potenza/esposizione, parametri di acquisizione immagine e la durata dell'esperimento utilizzando il software di acquisizione di immagine microscopio di scelta. Utilizzare filtri per GFP (eccitazione 488; 385 nm emissione) e mCherry (561 nm eccitazione e 385 nm emissione) per acquisire immagini.
13. Eseguire l'esperimento di time-lapse acquistando separatamente pulsata luce trasmessa e fluorescenza immagini ogni 10 min per un periodo fino a 16 ore.
14. Acquisire immagini come dodici 1.0 µm-separati z-aerei a 9 h dopo il rilascio dal blocco della timidina doppia utilizzando il software appropriato al microscopio.
15. Analizzare le immagini monitoraggio delle singole celle per progressione mitotica e infine montare il film corrispondente con il software di fonte Fiji/ImageJ.

Risultati

Studio della progressione mitotica e la stabilità dei microtubuli in cellule risolti dopo rilascio da doppio blocco di timidina
Cdt1 è coinvolto nella concessione di licenze di origini di replicazione del DNA nella fase G1. È degradata durante la fase S, ma ri-si accumula in fase G2/M. Per studiare il suo ruolo nella mitosi, il Cdt1 endogeno ha bisogno di essere impoverito specificamente alla fase G/M usando la tecnica di sincronizzazione cellulare più adatta, la t...

Discussione

Il vantaggio più critico di sincronizzazione della timidina doppia è che fornisce una dimensione di campione maggiore di cellule mitotiche in una finestra di tempo breve con molte di queste cellule in mitosi sta entrando all'unisono, permettendo così anche analisi di allineamento del cromosoma, bipolare formazione e segregazione del cromosoma del mandrino con efficienza molto più alta.

Molti complessi proteina regolatrice e vie di segnalazione sono dedicate a garantire la normale progressi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments