Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

Zusammenfassung

In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.

Zusammenfassung

Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.

Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.

Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.

Einleitung

Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.

In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit- und kostenintensive Methoden wie radioaktive Toxin zu beschriften,^1,2 sowie SiRNA-basierten Screening ³nähert. In einigen Fällen ist die Toxin Menschenhandel visualisierte in Vivo durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach chemische und/oder genetische Kopplung der einzelnen Toxin Untereinheiten mit Fluorophore, Quantenpunkte oder fluoreszierende Proteine^4,5gewesen. Leider, solche Änderungen führen oft zu inaktiv und/oder veränderten natürlichen Eigenschaften der Giftstoffe. Eine weitere elegante Möglichkeit, indirekt eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten ist die Verwendung von Reporter-Systeme auf Basis von Enzymen wie LacZ, Luciferase oder fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder Discosoma sp. rot fluoreszierenden Proteins () DsRed)).

In diesem Manuskript ist ein einfaches Protokoll beschrieben die zelluläre Komponenten für den intrazellulären Transport von extrazellulär angewandte RTA in S. Cerevisiaeidentifiziert. Dabei fungiert ein Fluoreszenz-Reporter-Plasmid enthält eine N-terminale ER-Import-Signal gefolgt von GFP als ein Protein-Biosynthese-Sensor, der indirekt RTA-vermittelten Protein Übersetzung Hemmung von GFP Fluoreszenzemission nach in-vivo misst Übersetzung⁶. RTA Endozytose oder intrazellulären Handel ist negativ (oder positiv) in eine bestimmte Hefe Löschung Mutante im Vergleich zu Wildtyp betroffen, so kann dies durch eine Erhöhung (oder Verringerung) GLP Fluoreszenz Emission⁶erkannt werden.

Bisher beschränkten sich alle Methoden analysieren RTA Transport in Hefezellen, den ER zum Zytosol Retro-Translokation Prozess der RTA. In solch ein künstliches System drückt sich RTA mit ein ER-Import-Signal von einem induzierbaren Promoter wiederum eine selbstmörderische Phänotyp^1,7. Obwohl die Zelle binden B-Untereinheit Ricin ebenfalls in der Versuchsaufbau beschrieben in dieser Handschrift fehlt ist und somit vollständig nicht die natürliche Situation von Ricin Holotoxin Rausch⁸, Toxin-Transport aus dem Plasma repräsentiert Membran durch den Golgi Apparat in die Notaufnahme kann eng mit dieser neuartigen Assay nachgeahmt werden. Interessanterweise zeigen die vorläufigen Ergebnisse der Pilotstudie, dass die Handel Wege von RTA verwendet auffallende Ähnlichkeiten mit den Rausch-Route von Ricin Holotoxin offenbaren.

Zusammenfassend lässt sich sagen kann das beschriebene Verfahren verwendet werden, zu bestimmen, die spezifische Rolle der ausgewählten zelluläre Proteine im RTA Endozytose und des Handels in der Hefe. Darüber hinaus könnte diese Versuchsanordnung leicht andere Ribosom Inaktivierung Toxine produziert und abgesondert von verschiedenen Hefen und Bakterien-Spezies wie Zymocin oder Shiga Toxin angepasst werden.

Protokoll

Hinweis: Eine Übersicht über die allgemeine experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

Achtung: RTA ist sehr giftig für den Menschen. Sicherheit Labor Erlaubnis S2 (Biosafety level 2 Äquivalent) ist erforderlich. Bitte tragen Sie Handschuhe während des gesamten Experiments.

(1) heterologen Expression von sein-tagged RTA in Escherichia coli

1. E. Coli Zellen mit Ausdruck Plasmid pET24-RTA_{(His) 6} oder leerer Vektor pET24a⁽⁺⁾ mit standard Elektroporation Protokolle^9,10zu verwandeln. Zellen mit dem leeren Plasmid dienen als Negativkontrolle.
2. Nach Auswahl des positiven Klone auf Kanamycin-haltigen (100 µg/mL) LB-Platten Zellen, in denen das RTA-Expressionsplasmid oder der leere Vektor in 5 mL LB_kan Medium (LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C und 220 u/min für 24 h.
3. Ergänzen Sie 1 L LB_kan Medium mit 5 mL Vorkultur zu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 220 u/min bis Zellen eines OD₆₀₀ von 0,8-1,0 (ca. 3-4 h) erreicht haben. Danach reduzieren Sie Kultur Temperatur 28 ° c und bereiten Sie eine 1 M Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) Stammlösung in H₂O.
4. RTA-Ausdruck von E. Coli durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zu induzieren.
5. Waschen Sie nach 3,5 h bei 28 ° C und 220 u/min, Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min das Pellet zweimal mit 5 mL Bindung Puffer (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 20 mM KH₂PO₄ pH = 7,4) bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min und Aufschwemmen Pellet in 5 mL Bindung Puffer.
   Hinweis: Protokoll kann in dieser Phase angehalten werden und Zellen können für mehrere Tage bei 80 ° C gelagert werden.

2. Reinigung des sein-tagged RTA über Affinitätschromatographie

1. Beschallen Sie Zellen auf Eis mit das folgende Protokoll: 15 s-Pulse (20 Mikron), 30 s Pause. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
2. Zentrifugieren Sie Zelle lysate auf 21.000 x g und 4 ° C für 15 min und Filtern Sie überstand eine sterile Spritze-Filter-System (0,2 µm Porengröße) verwenden.
   Hinweis: Zelle Pellets erfolgreich beschallten Proben zeigen transparente Ränder.
3. Verwenden Sie ein automatisches Reinigungssystem ausgestattet mit einer 5 mL Ni^{2 +}-basierte Affinität Spalte um die sein-tagged RTA-Fraktion aus der steril filtriert E. Coli überstand zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elution Geschwindigkeit von 1 mL/min und kühl das ganze Reinigungssystem zur Vermeidung von nicht-effiziente Toxin Bindung und Verlust der Toxin-Aktivität.
   Hinweis: Parameter für die effiziente Reinigung der RTA sind in Tabelle 1aufgeführt. Siehe auch Becker Et Al. für weitere Informationen⁹.
   1. Kurz, equilibrate der Affinität Spalte mit 20 mL Bindung Puffer, Speicher-Puffer zu entfernen. Wenden Sie steril filtriert Überstand auf die Affinität Säule mit einer Spritze.
   2. Waschen Sie die Spalte mit 25-35 mL Bindung Puffer, die ungebundenen Proteine aus der Spalte zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt bis UV-Absorption bei 280 nm liegt in der Nähe der UV-Anfangswert.
   3. Eluieren gebundene RTA Bruchteil in 20-35 mL Elution Buffer (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) und halten Sie die Probe auf Eis (Abb. 2A und 2 b).
      Hinweis: Elution der RTA-Fraktion zeichnet sich durch eine Zunahme der UV-Absorption. Hinweis: um diese Fraktion zur Vermeidung von Kontamination mit unspezifischen gebundene Proteine ausschließlich zu sammeln.
   4. Verwenden Sie 20 µL des eluierten Proben Coomassie blaue Färbung¹¹ oder Western-Blot Analyse^12,13 (Optional) durchführen. Verwenden Sie primär Anti-His Antikörper (1:1 000) und sekundären anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) zur Erkennung von RTA und überprüfen Probe Reinheit (Abbildung 3).
   5. Entsalzen eluierten RTA Bruchteil einer 5 mL Entsalzung Spalte und equilibrate Probe in 0,8 M Sorbit.
      1. Ersetzen der Affinität Spalte das Reinigungssystem der Entsalzung spaltenweise und equilibrate zuerst die Spalte mit 20 mL 0,8 M Sorbit.
      2. Wenden Sie den eluierten RTA-Bruch in die Spalte über eine Spritze an. Waschen Sie die Spalte mit 100 mL 0,8 M Sorbit und eluieren Sie entsalzten RTA-Bruch in der 15 mL Tube, sobald die UV-Absorption beginnt zu erhöhen (Abbildung 2).
      3. Speichern Sie den eluierten RTA-Bruch bei 4 ° C.
         Hinweis: Hören Sie RTA Bruchteil Probenahme direkt auf, wenn Leitfähigkeit steigt auf um Salz Kontamination zu vermeiden. Parameter für die Entsalzung Verfahren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Eluierten RTA Bruchteil bei 10.000 x g und 4 ° C für 30-180 min mit einer 10 kDa Cutoff Spin Spalte zu einem Endvolumen von ca. 1-2 mL zu konzentrieren und Probe bei 4 ° C für 3-4 Wochen aufbewahren.
   Achtung: Nicht Einfrieren der Probenmaterials seit Einfrieren führt zu einem vollständigen Verlust des RTA-Aktivität.
5. Proteinkonzentration mit einem konventionellen Protein Entschlossenheit-Kit zu bestimmen. Proteinkonzentration sollte im Bereich von 1-1,5 mg/mL sein.
   Hinweis: RTA tendenziell herbeiführen, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist (> 5 mg/mL).

3. Hefe-Transformation und Zellwand entfernen

1. Wildtyp oder ausgewählte Hefe Löschung Mutanten mit der GFP Reporter Plasmid pRS315-K28_SP- GLP⁶ mit standard-Lithium-Acetat Umwandlung Methoden¹⁴zu verwandeln. Inkubieren Sie Zellen auf Leucin Drop-out (d/o) Glukose-Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % Hefe Stickstoff Basis (YNB) und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin) bei 30 ° C für ca. 2-3 Tage für positive Klon-Auswahl.
2. Wählen Sie 3 verschiedene Hefe Klone von jeder Platte und impfen die Klone in 100 mL Leucin d/o Raffinose Medium (2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o ohne Leucin mix) bei 220 u/min und 30 ° C bis OD₆₀₀ = 1,0-2,0 (2-4 x 10⁷ Zellen/mL).
   Hinweis: Zellwachstum von den verschiedenen Hefestämme Löschung unterscheidet. Monitor OD₆₀₀ über einem Spektrophotometer.
3. Um₆₀₀ OD-Werte zu berechnen, verdünnen Sie Proben auf OD₆₀₀ = 0,1-0,3 (1:5 bis 01:10 Verdünnungen) und OD₆₀₀ in einem Spektrophotometer zu messen. Als Referenz verwenden Sie H₂O, ergänzt mit der entsprechenden Menge an Leucin d/o Raffionose Medium.

Zu guter Letzt Aufschwemmen OD₆₀₀ = 125 in 5 mL sterilem Wasser (5 x 10⁸ Zellen/mL).

Zellen bei 25 ° C für 5 min bei 10.000 x g Zentrifugieren und waschen Zellen zweimal mit 5 mL sterilem Wasser Aufschwemmen Zellen in 50 mL Spheroplasting Puffer (0,8 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl₂, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 200 µg/mL lytische Enzym).

Inkubieren Sie die 50 mL-Kultur bei 100 u/min und 30 ° C für 90 min. Optional: Spheroplast Bildung alle 15 min von Phasenkontrastmikroskopie zu überwachen. Unter dem Mikroskop sollte Zellen eine transluzente dunkelgraue Farbe haben. Bright (strahlenbrechende) Zellen sind nur unzureichend verdaut, während Geister (hellgrau Zellen mit wenig, wenn überhaupt, interne Struktur) over verdaut.

Spheroplast Vorbereitung Wirksamkeit für jede Probe zu überprüfen.

1. Nach Fertigstellung Schritt 3.5, 4 µL der spheroplasted 50 mL Kultur mit 496 µL Spheroplasting-Puffer (ca. 2 × 10⁶ Spheroplasts) mischen und für 10 min bei 400 X g zentrifugieren.
2. Aufschwemmen Pellet in 10 mL H₂O destilliert, Vortex Probe für 30 s und Platte aus 10 µL der Probe auf Leucin d/o Glukose Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin).
3. Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 30 ° c Zählen Sie die Gesamtzahl der Erwachsenen Zelle Kolonien auf der Platte. Zur Datenauswertung, verwenden nur Proben mit mehr als 98 % Wirkungsgrad (Gesamt Kolonie Handynummer < 40 Kolonien/Platte).

Zentrifugieren Sie Zellen aus Schritt 3.5 bei 400 x g und 4 ° C für 10 min und waschen Zellen zweimal mit 5 mL stabilisiert Leucin d/o Raffinose Medium (0,8 M Sorbit, 2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % Drop-out-Mix ohne Leucin). Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium (1 x 10⁸ Zellen/mL) und verwenden Sie Zellen für die GFP Reporter Assay Messungen (Abschnitt 4) direkt zu.

(4) GLP Reporter Assay Messung in 96-Well-Platten

1. Samen aus der Hefe Zelle Spheroplasts in Schritt 3,7 in 96-Well-Platten (200 µL/Well) erhalten.
2. Fügen Sie 70 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose-haltigem Medium Negativkontrolle (Eluat eines Ni^{2 +}-Affinität gereinigten Zelle lysate aus IPTG induziert E. Coli Zellen mit dem Ausdruck des leere Vektors) oder RTA in einer Endkonzentration von RTA von 5 µM (gereinigt entsprechend 160 g/L RTA) in jede Vertiefung.
3. Fügen Sie sofort 30 µL stabilisiert Galaktose Lösung (30 % Galaktose, 0,8 M Sorbit) induzieren GFP Ausdruck und anschließend starten Sie die Messung.
   Hinweis: Führen Sie mindestens 3 Technische Wiederholungen pro Experiment und 3 biologische repliziert pro Hefestamm.
4. Nach Abschluss der Probenvorbereitung (Schritte 4.1-4.3), die 96-Well-Platte in einem Fluoreszenz-Reader setzen und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 475/509 nm Filtersatz für GLP-Fluoreszenz-Detektion erforderlich. Messungen Sie bei 30 ° C, 120 u/min, und mit einem schütteln Durchmesser von 1 mm über ein Zeitfenster von 20 h (Messung von Abständen von 10 min).
   Hinweis: Die GLP-Filter-Set gibt es normalerweise in alle Lesesysteme. Temperatur, Zeitfenster, Messung von Abständen und RTA-Konzentration kann für die eigenen Bedürfnisse angepasst werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt.
5. Optional: Verwenden Sie zusätzliche interne Kontrollen bei der Messung für die Qualitätskontrolle. Bereiten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 30 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium anstatt 30 % Galaktose (keine GFP Induktion). Darüber hinaus fügen Sie 70 µL 0,8 M Sorbit stabilisiert G418 Lösung (300 µg/mL). Die Protein-Übersetzung-Inhibitor G418 dient als Positivkontrolle für Protein-Hemmung wie GFP Ausdruck in der Hefe verhindert.
6. Relative GFP-Fluoreszenz in Prozent für die 20 h-Zeitpunkt nach der folgenden Gleichung berechnen (siehe Abb. 4A): wo NC ist die negativ-Kontrolle
   1. Alternativ, bestimmen die relativen GFP Fluoreszenz für jeden Meßpunkt (in diesem Fall 10 min, siehe auch Schritt 4.4) unter Verwendung der obigen Gleichung. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, erstellen Sie ein Diagramm, indem die GFP-Fluoreszenz-Intensitäten (y-Achse) im Laufe der Zeit (x-Achse) beflecken.

Ergebnisse

Die allgemeine Workflow des Protokolls beschrieben in diesem Manuskript wird in Abbildung 1, etwa fasst die einzelnen Schritte zur erfolgreichen RTA-Reinigung und das anschließende GFP Reporter Assay Experiment veranschaulicht. Eine ausführlichere Beschreibung jedes einzelnen Schritts finden Sie im Protokoll. Abbildung 2 zeigt das erwartete Ergebnis des erfolgreichen RTA Reinigung durch Affinitätschromatographie (

Diskussion

Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.

Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen > 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente F...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution