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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo di coltura tridimensionale per analizzare la morfologia del primario del seno le cellule tumorali, come pure per studiare le interazioni diretta/indiretta con i monociti ed i risultati come degradazione del collagene, reclutamento delle cellule immuni, cell invasione e promozione dell'infiammazione legata al cancro.

Abstract

Incorporato nella matrice extracellulare (ECM), cellule epiteliali normali e neoplastiche intimamente comunicano con le cellule ematopoietiche e non-emopoietici, influenzando notevolmente risultato di omeostasi e malattia del tessuto normale. Nel cancro al seno, macrofagi associati al tumore (TAM) svolgono un ruolo critico nella progressione della malattia, metastasi e ricorrenza; Pertanto, la comprensione dei meccanismi del monocito chemoattraction al microambiente tumorale e delle loro interazioni con le cellule del tumore è importante per controllare la malattia. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un sistema tridimensionale (3D) co-coltura di cellule tumorali (BrC) materno e monociti umani. BrC cellule prodotte i livelli elevati basali di regolamentato su attivazione, T-cellula normale espresso e secreto (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) e fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (G-CSF), mentre in co-coltura con i monociti, citochine proinfiammatorie interleuchina (IL) -1 beta (IL-1 β) e IL-8 sono stati arricchiti con metalloproteinasi della matrice (MMP) -1, MMP-2 e MMP-10. Questo microambiente stroma tumorale promosso resistenza all'anoikis in MCF-10A 3D dei acini-come le strutture, chemoattraction dei monociti e l'invasione delle cellule aggressive BrC. I protocolli presentati qui forniscono un'alternativa conveniente per studiare comunicazione intra-tumorale e sono un esempio le grandi potenzialità in vitro delle cellule 3D sistemi forniscono per interrogare la specificità della biologia dei sistemi tumorali correlate al tumore aggressione.

Introduzione

Biologia del tumore è molto più intricata di quanto si pensasse. Prove di montaggio Mostra che le cellule del tumore sono più di una semplice massa incontrollate delle cellule di proliferazione; piuttosto, le cellule neoplastici differenti sembrano svolgere diverse funzioni visualizzazione alta organizzazione e gerarchia all'interno del tumore1. Le cellule del tumore sono in comunicazione intima con cellule non trasformate: fibroblasti, adipociti, linfociti, macrofagi, cellule endoteliali, tra le altre cellule sono tutti immersi nell'impalcatura proteine e polisaccaridi che costituiscono la ECM. Numerose interazioni dirette e indirette sono stabilite tra cellule trasformate e non trasformate e con la ECM, che esercita una potente influenza sulla malattia risultato2,3. Nel caso specifico di BrC, è particolarmente importante sezionare la comunicazione delle cellule BrC con TAMs, considerando che TAMs sono stati trovati a giocare un ruolo fondamentale nell'evoluzione del tumore, aumentando il rischio di metastasi e di ricorrenza di malattia4 ,5.

Per analizzare le interazioni intra-tumorali e loro possibili esiti, nuovi approcci per il 3D in vitro sono stati sviluppati basata sull'uso di estratti di ECM che forniscono un microambiente molto più complesso, più vicino alla realtà di biologia del tumore, in confronto ai colture cellulari monostrato convenzionale in cui le cellule crescono attaccato alla plastica. Petersen e Bissell6 fornito il primo modello di benigna e maligna delle cellule epiteliali mammarie coltivate su una membrana basale laminina-ricco e furono i primi a descrivere le strutture 3D organotipiche che discriminano benigni umani cellule epiteliali del seno dalle loro controparti maligne. Un decennio più tardi, il modello sviluppato da Debnath, Marinella, e Brugge7,8,9 fornito uno strumento prezioso per delucidare i percorsi biologici compromessi durante la trasformazione maligna dei acini ghiandolari, tali come formazione di acini grandi dovuto proliferazione incontrollata, delocalizzazione delle proteine di giunzione stretta come prova di polarizzazione cellulare alterata e la perdita del lume dei acini a causa della resistenza delle cellule all'anoikis, un tipo di morte cellulare programmata che si verifica in cellule di ancoraggio-dipendente quando si staccano dalla ECM circostanti. I modelli di Sameni, Jedeszko e Sloane si sono concentrati sulla formazione immagine attività proteolitica dalle cellule, che è strettamente correlata alla invasività, un'altra caratteristica fondamentale di tumore malignità10,11,12. Questi modelli si basano su matrici di proteina mescolati con substrati differenti estiguuto fluorescenza della proteina (DQ-gelatina, DQ-collagene I e DQ-collagene IV), in cui segnali fluorescenti sono indicativi della degradazione proteolitica di collagene. Modelli 3D sono utilizzati anche per studiare le proprietà delle cellule staminali di entrambi non trasformate e le cellule del tumore, in quale cella aggregati, chiamati anche sferoidi, possono essere coltivate in sospensione o in proteine ECM-like interrogando per meccanismi di differenziazione cellulare, asimmetrica divisione delle cellule, l'adesione cellula-cellula e cellula motilità13,14. Saggi di invasione consentono di testare l'aggressività intrinseca del tumore e l'identificazione delle molecole che fungono da chemioattrattanti durante il processo invasivo15. Nel complesso, 3D modelli rappresentano una conveniente diversificazione della coltura in vitro delle cellule che riflettono più molto attentamente la morfogenesi del tessuto normale e oncogeno.

Abbiamo progettato un sistema di co-coltura cellulare 3D basato sui suddetti modelli7,10,11, utilizzando sia linee cellulari BrC commerciale umane del noto potenziale aggressivo (tipi di luminal e triplo-negativi) e primaria cellule espiantate da BrC pazienti. In primo luogo abbiamo sviluppato un modello dove erano co-coltivate con i monociti U937 in un Estratto di matrice extracellulare (ECME) o non aggressivi (MCF-7) o cellule aggressive (MDA-MB-231) BrC-basato sistema 3D che ha permesso di interazioni cellula-cellula diretto. Questi co-colture sono state usate per determinare come la comunicazione tra questi lignaggi di due cellule influenzato la trascrizione di una serie di geni correlati al comportamento aggressivo di cancro. Un significativo aumento della trascrizione di ciclo-ossigenasi-2 (COX-2) è stato osservato che ha coinciso con un aumento della produzione di uno dei suoi prodotti, della prostaglandina E2 (PGE2), trovando quello ha evidenziato il ruolo dell'infiammazione nella progressione tumorale. Trascrizione aumentata di MMP inoltre è stato osservato che ha correlato con una maggiore proteolisi del collagene quando cellule MDA-MB-231 aggressive sono state co-coltivate con i monociti U937 in colture contenenti DQ-collagene IV. Della nota, il nostro co-colture non supportava l'ipotesi che i meccanismi di interazione cellula-cellula sono necessari per la degradazione del collagene. E ' piuttosto suggerito che la comunicazione tra i lignaggi di due celle è stata mediata da molecole secrete. Inoltre, i surnatanti raccolti da queste analisi di co-coltura contenevano fattori solubili che disorganizzato acini ghiandolari formati da non trasformate di cellule MCF-10A13. Si è constatato che aggressivo e cellule primarie di BrC secernute elevati livelli di molecole chemiotattiche monocito MCP-1, GM-CSF e RANTES. Così, abbiamo delineato una cultura 3D in cui le cellule sono state separate in cella cultura inserti per evitare interazioni cellula-cellula. Queste culture sono state usate per affrontare la comunicazione indiretta tra cellule BrC e monociti. Per queste analisi, non aggressivi e aggressive commerciale BrC linee cellulari e cellule primarie di BrC e tre diversi tipi di monociti umani: commerciale cellule U937 e THP-1 e monociti primari (PMs) isolati dal sangue periferico di donatori sani (tutti i monociti sono stati utilizzati in uno stato non attivato) sono stati usati. Aumento delle concentrazioni di citochine infiammatorie IL-1 β e IL-8 sono stati osservati per essere arricchito in co-coltura. Allo stesso modo, è stato trovato che la MMP-1, MMP-2 e MMP-10 inoltre sono stati aumentati nel BrC cellule monocito co-culture e così rinforzo precedente Risultati14. In questo manoscritto, un flusso di lavoro punto per punto di isolamento primario di cellule BrC e test in 3D culture è presentata con risultati rappresentativi. Quest'opera costituisce un buon esempio del grande potenziale che forniscono sistemi in vitro cell 3D per interrogare specifici aspetti della biologia del tumore.

Protocollo

Campioni da pazienti di BrC sono stati ottenuti dalla Banca dei tessuti della Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Questo studio è stato approvato dal campo scientifico, etico e biosicurezza revisione schede dell'Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética en Investigación e Comité de Bioseguridad. Tutti i pazienti sono stati arruolati prospetticamente e sono stati informati circa la natura dello studio: coloro che sono disposti a partecipare hanno firmato un consenso informato prima del prelievo di campioni e sono stati trattati secondo le linee guida etiche e la migliore pratica clinica di l'istituzione. L'identità dei partecipanti era resi anonimi per tutta la durata dello studio. Pazienti inclusi sono stati diagnosticati con carcinoma ductal dilagante, grado istologico 2 e la fase clinica II, con nessuna precedente terapia neoadiuvante prima di resezione del tessuto. I pazienti erano tutti di sesso femminile invecchiato in media 56,8 anni (range 42-75)14.

1. colture cellulari 3D

  1. Seme 0.1 x 106 MCF-10A celle o cellule primarie di BrC in matracci di cultura 25 cm2 con terreno di coltura DMEM/F12 completati con 5% di cavalli del siero, 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, tossina del colera di 100 ng/mL, idrocortisone 0,5 µ g/mL, 10 µ g/mL l'insulina e 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF). Celle di seme 0.1 x 106 commerciali BrC, cellule MCF-7 e cellule MDA-MB-231 a 75cm2 cultura boccette con terreno di coltura DMEM/F12 completato con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Incubare a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
  2. Dopo 48 h, sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di 1x sterile tamponato fosfato salino (PBS). Tripsinizzano strato monomolecolare della cellula con 3 mL di soluzione di acido di acido etilendiamminotetraacetico tripsina e 0,48 mM 0,05% (EDTA) per 5-10 min a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di siero corrispondente per interrompere trypsinization e 7 mL di terreno senza supplementi. Risospendere le cellule pipettando e rimuovere un'aliquota di 10 µ l per contare le celle in una camera di Neubauer.
  3. In ciascun pozzetto di un sistema di diapositiva 8 pozzetti camera, sviluppa una base di 40 µ l di puro ECME, seguita da un'incubazione di 30 min a 37 ° C.
  4. In ciascun pozzetto, posto 800 cellule risospese in 400 µ l di DMEM/F12 (senza rosso fenolo) completati come al punto 1.1 ma con le seguenti modifiche: per cellule primarie di BrC e le cellule MCF-10A, aggiungere 4 ng/mL di EGF e 2% ECME; per MCF-7 e MDA-MB-231, aggiungere solo il 2% ECME.
  5. Incubare le colture a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente. Sostituire ogni 48 h di coltura.
  6. Annotazione morfologica cambia delle cellule ogni 24 h per 15 giorni con un microscopio ottico. Per analizzare la morfologia della BrC primario cellule MCF-10A e cellule MDA-MB-231 sono linee cellulari buon riferimento per esempi di formazione acinose ordinato e disordinate aggressive cancro-come le strutture, rispettivamente.
  7. Ottenere immagini delle cellule in microscopia del campo luminoso a 100 X e 200 X di ingrandimento e confrontare la morfologia delle cellule con riferimento MCF-10A e linee di cellule MDA-MB-231 (Figura 1).

2. ottenimento di cellule di cancro primario da tessuto tumorale

Nota: Per ottenere cellule epiteliali tumorali utilizzano tessuto da resecato tumori primari da BrC pazienti con nessuna terapia neoadiuvante precedente; evitare le zone necrotiche e lavorare con un minimo di 0,5 cm3 del tessuto del tumore.

  1. Sciacquare il tessuto tumorale con PBS 1X sterile e meccanicamente disaggregare esso con un bisturi in frammenti di 1-2 mm.
  2. Digerire il tessuto in un flaconcino di vetro sterile 20 mL con tappo per 2 h a temperatura ambiente (TA) con 2 mL di soluzione Segui: mescolare 1 mg/mL collagenasi tipo I e dell'ialuronidasi in DMEM/F12 Media contenente 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina 100-U/mL , con agitazione costante.
  3. Filtrare la sospensione risultante attraverso pezzi sterilizzati di tulle per eliminare grandi pezzi di tessuto non digerito. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un sterilizzati 100 µm-poro della membrana.
  4. Agglomerare le cellule a 430 x g per 5 min a RT e lavare due volte con PBS 1X sterile. Coltura di cellule primarie in DMEM/F12 supplementato con 5% di siero equino, 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, tossina del colera 100 ng/mL, idrocortisone di 0,5 µ g/mL, 10 µ g/mL insulina e 20 ng/mL di EGF. Sostituire il mezzo ogni 48 h. Maintain culture a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
  5. Garantire che le cellule isolate sono cellule epiteliali con un protocollo standard di immunocitochimica14. Tre marcatori epiteliali di prova: un pannello dei cytokeratins (Perelli), mucina-1 (Muc-1) e la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM).

3. isolare PM cellule da sangue periferico

  1. Estratto circa 40 mL di sangue periferico da un sano volontariato, diluire il sangue in una proporzione di 1:3 con PBS 1X a privo di endotossina sterile e sottoporlo ad una separazione di gradienti di densità.
  2. In un tubo conico, posizionare 2 mL di mezzo di diatrizoate polysucrose e sodio con una densità di 1,077 g/mL. Lentamente e con cautela sovrapporre 8 mL di sangue diluito. Centrifugare per 30 min, 765 x g a RT. uso la più lenta velocità di accelerazione-decelerazione della centrifuga.
    Nota: Dopo la centrifugazione, quattro strati saranno formati dal basso verso l'alto: il pellet di globuli rossi, il livello medio gradiente di densità, lo strato di cellule mononucleari (appare come un anello bianco raffinato) e il livello del plasma.
  3. Con cura recuperare lo strato delle cellule mononucleari dal gradiente con una pipetta Pasteur sterile e lavare tre volte con PBS 1X, ogni volta, seguita da centrifugazione più lento (430, 275 e 191 x g) per 10 minuti a TA.
  4. Utilizzare protocolli di selezione negativa per evitare l'attivazione delle cellule. Un esempio di tale protocollo è il seguente:
    1. Lavare le cellule mononucleari una volta con una soluzione di lavaggio tamponata (0,5% albumina di siero bovino, 2 mM EDTA in PBS 1X). Contare le celle in una camera di Neubauer e adattarle a una densità di 1 x 107 cellule/30 µ l di una soluzione tamponata.
    2. Per ogni 1 x 107 cellule, aggiungere 10 µ l di una FcR blocco reagente e 10 µ l di un cocktail di biotina-anticorpo del monocito contenente anti-umani CD3 CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 e glicoforina A (incluso nel kit commerciali).
    3. Mescolare le cellule e incubare per 15 min a 4 ° C. Aggiungere un ulteriore 30 µ l di soluzione di lavaggio tamponata plus 20 µ l di microsfere di anti-biotina (incluso nel kit); mescolare le cellule e incubare per 20 min a 4 ° C.
    4. Lavare le cellule una volta con una soluzione tamponata, centrifugare a 430 x g per 5 min a RT e risospendere in 1,5 mL di soluzione tampone per la separazione magnetica.
    5. Caricare la sospensione cellulare su una colonna di separazione magnetica pre-risciacquata e aggiungere 7 mL di soluzione tampone. Raccogliere la frazione arricchita del monocito in una provetta conica 15 mL, contare le celle e se non coltivate immediatamente, congelare i monociti ad una densità di 2 x 106 cellule/1 mL di DMEM/F12 supplementato con 50% FBS e 10% DMSO a − 80 ° C.
      Nota: Evitare l'uso di monociti dopo più di 2 mesi di congelamento, come può essere compromessa la loro sopravvivenza.
  5. Mantenere le culture del PMs in DMEM/F12 supplementato con 6% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
  6. Eseguire ogni serie di esperimenti che utilizzano PMs da almeno due diversi donatori in modo indipendente, come monociti pooling da donatori diversi possono provocare l'attivazione del monocito.

4. stabilire 3D co-culture

  1. 3D co-culture con interazione indiretta
    Nota:     eseguire queste analisi in piastre di coltura 24 pozzetti a fondo piatto utilizzando inserti di cultura delle cellule in policarbonato con membrane di formato del poro 0,4 µm. In questo saggio, surnatanti sia delle cellule possono essere recuperate alla fine dell'esperimento.
    1. Coltivare 2 x 106 monociti U937 e THP-1 in 10 mL di RPMI 1640 supplementato con 10% FBS, 1% antibiotico/antimicotico e coltivare PMs fresca nel mezzo DMEM/F12 completato (come indicato precedentemente in passo 3.5), a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
    2. Piatto 4 x 105 monociti in 1ml/bene del loro mezzo corrispondente (completato con 2% ECME e 2% FBS per monociti U937 e THP-1, o 2% ECME e 6% FBS per PMs).
    3. Collocare un inserto in ciascun pozzetto e aggiungere 0,9 mL di 4 x 105 sospensione cellulare BrC nel medio corrispondente (completato con 2% ECME e 2% FBS per linee cellulari commerciali o 5% cavallo del siero per cellule primarie di BrC). Sostituire la metà del totale media ogni 48 h.
    4. Incubare a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente per 5 giorni e recuperare i sovranatante. Recuperare le cellule trypsinization se viene eseguita l'analisi successiva.
    5. Includono i controlli delle colture cellulari individuali con i rispettivi mezzi di comunicazione.
  2. 3D co-culture con interazione diretta
    1. Etichetta BrC cellule e monociti con differenti tinture fluorescenti prima coltura cellulare per consentire l'ordinamento indipendente di ogni stirpe delle cellule dopo la coltura per l'analisi di espressione di mRNA e proteina. Utilizzare commercialmente disponibili derivati della cumarina e rodamina che passano liberamente attraverso la membrana cellulare delle cellule viventi. Un protocollo generale per l'etichettatura è il seguente:
      1. Preparare un monostrato di cellule BrC di interesse (2 × 106 cellule in un matraccio di cultura 25 cm2 ) e sostituire il mezzo standard con sufficiente soluzione di lavoro pre-riscaldato della tintura fluorescente (1:2, 000 del colorante fluorescente in medium di base standard senza alcun supplemento). Incubare 30 min a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente. Aspirare la soluzione colorante e risciacquare delicatamente con sufficiente 1X PBS. Aspirare il PBS e aggiungere il supporto standard.
      2. Tripsinizzano strato monomolecolare della cellula con 2 mL di una soluzione di EDTA di tripsina e 0,48 mM 0.05% per 5-10 min a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di FBS per interrompere trypsinization e 7 mL di terreno corrispondente senza supplementi. Risospendere le cellule pipettando. Prendere un'aliquota di 10 µ l per contare le celle in una camera di Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle cellule.
      3. Agglomerare le cellule a 430 x g per 5 min a RT (eseguire questo primo poiché monociti crescono in sospensione). Eliminare il surnatante e Risospendere delicatamente le cellule con 3 mL di una soluzione di lavoro pre-riscaldato della tintura fluorescente (1:2, 000 del colorante fluorescente in un medium di base standard senza supplementi). Incubare per 30 min a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
      4. Agglomerare le cellule ancora una volta, scartare la soluzione di lavoro di tintura e Risospendere delicatamente con 5-7 mL di PBS 1X. A pellet ancora una volta, scartare il PBS e risospendere le cellule in 5-7 mL di medium standard. Prendere un'aliquota di 10 µ l di sospensione cellulare per contare le celle in una camera di Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle cellule.
    2. Impostare la co-coltura come segue:: diffusione abbastanza ECME nella parte inferiore del pozzo per formare uno strato uniforme in ciascun pozzetto di un sistema di scorrimento dell'alloggiamento 4-pozzetti. Piastra di 20 µ l di una sospensione di singola cellula contenente 5 × 105 etichettato BrC cellule per pozzetto.
    3. Dopo 15-20 min di incubazione a 37 ° C, aggiungere una sospensione di 2,5 x 105 etichettato monociti nel medium di analisi 80 µ l (completata con 60% ECME).
    4. Consentire ECME a solidificare per 15-20 min a 37 ° C.
    5. Aggiungere 1 mL di una miscela 1:1 delle cellule BrC e terreni di coltura di monociti.
    6. Incubare le co-colture a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente per 24h, 48h o 5 giorni per tenere traccia delle modifiche in diversi momenti.
    7. Degradano le proteine ECM per recuperare le cellule dalle culture. Aspirare ed eliminare il terreno, aggiungere 0,5 mL di PBS 1x con tripsina 0,1% e 0,25% EDTA e incubare per 3 ore a 37 ° C. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 mL di PBS 1x con 10% FBS per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule pipettando energicamente per ottenere una sospensione unicellulare.
    8. A pellet di cellule a 765 x g per 5 min a RT, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di PBS 1x con 10% FBS. Ripetere questo passaggio una volta.
    9. Sottoporre la sospensione cellulare a fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) con l'apposito strumento. Garantire che le popolazioni finale sono almeno il 95% di puro).
    10. Dopo la cernita, lavare le cellule con PBS 1X sterile, pellet (430 x g per 5 min a RT) e risospendere in PBS 1X sterile. Le cellule possono essere trattate secondo protocolli specifici per isolamento del RNA o proteine.
    11. Ripetere ogni dosaggio tre volte, tra cui 3D culture di ogni stirpe delle cellule individuali come controlli.
  3. Interazione diretta di 3D co-colture di valutare la degradazione del collagene
    1. Stabilire cella 3D co-culture come descritto al punto 4.2, con il passaggio aggiuntivo di aggiunta di 32,5 µ g/mL di collagene di tipo IV etichettato con isotiocianato di fluorescina per il ECME. La concentrazione finale di collagene IV nella ECME è dello 0,5%. Crescere le colture in un vetrino coprioggetti 35 mm posizionato in una capsule di Petri.
    2. Stendere uno strato di 40 µ l di ECME sul fondo del piatto Petri. Consentire ECME solidificare a 37 ° C.
    3. Aggiungere 2,5 x 105 BrC celle in 10 µ l del mezzo e permettono alle cellule di stabilirsi.
    4. Aggiungere una sospensione di 1,25 x 105 U937 monociti nel medium di analisi 40 µ l (completata con 60% di DQ-collagene IV etichettato-ECME).
    5. Consentire ECME a solidificare per 15-20 min a 37 ° C.
    6. Aggiungere 2 mL di una miscela 1:1 delle cellule BrC e terreni di coltura di monociti.
    7. Incubare la co-colture per 5 giorni a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente. Sostituire ogni 48 h di coltura.
    8. Analizzare l'emissione di fluorescenza in un microscopio confocale a scansione e misurare la densità ottica integrata (IOD) a 50 µm2 della cultura. Confronta IOD contro singole culture e la cultura al tempo zero (Figura 2).

5. analisi dei surnatanti da 3D co-culture con interazione indiretta

  1. Dopo 5 giorni di co-coltura, recuperare i surnatanti da superiore e i vani inferiori delle co-culture 3D e dai controlli individuali cultura 3D. Miscelare bene ogni surnatante pipettando. Aliquota e conservare il supernatante a − 20 ° C fino all'utilizzo (fino a un mese).
    Nota: Mantenere i surnatanti a − 80 ° C se deposito sarà più di un mese.
  2. Analizzare i surnatanti con multiplexing piattaforme di analisi, analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) o basati su tallone immunoassays seguendo procedure raccomandate dal produttore.
    Nota: I surnatanti anche possono essere analizzati mediante Western blot o concentrati attraverso filtri specifici poro per ottenere frazioni proteiche dimensioni arricchita per eseguire analisi zymography16,17. In alternativa, utilizzare i surnatanti come media condizionati per altri esperimenti, come descritto di seguito. Media condizionati è solitamente ottenuta da una cultura di 5 giorni (Figura 3).

6. caratterizzazione di effetti dei surnatanti dalle cellule primarie BrC su formazione di Acini e Acini struttura

  1. In ciascun pozzetto di una diapositiva 8 pozzetti camera sistema sviluppa una base 40 µ l di ECME e lasciarlo solidificare per 30 min a 37 ° C.
  2. Seme 800 MCF-10A cellule/pozzetto in 400 µ l di terreno di coltura DMEM/F12 completato, come descritto al punto 1.2.
  3. Aggiungere 400 µ l di media condizionati o terreno di coltura DMEM/F12 completato con 20 ng/mL di umana ricombinante IL-1 β.
  4. Posto la diapositiva di alloggiamento in un piatto di petri di vetro contenente una piastra Petri 35 mm riempita con 2 mL di PBS per creare un ambiente di umidità.
  5. Sostituire il supporto/supernatante ogni 48 h.
  6. Record di formazione di acini ghiandolari ogni 24 h per 14 giorni con un microscopio ottico.
  7. Dopo 14 giorni di cultura, macchia acini con 100 µ l di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ad una concentrazione di 100 nM in PBS 1X per osservare i nuclei delle cellule. Incubare per 25 min a RT in agitazione costante. Lavare tre volte con 1x PBS per 5 min, ogni volta in costante agitazione a RT. Mount i preparativi con un mezzo di montaggio specifico per la colorazione fluorescente. Sigillare con smalto trasparente e mantenere al riparo dalla luce a 4 ° C.
  8. Analizzare gli acini con un microscopio confocale prendendo immagini degli stack trasversale alle diverse profondità dei acini (Figura 4A, B, C).
  9. Visualizzare diverse proteine cellulari in acini con protocolli di colorazione adeguati. Per esempio, E-caderina è stata macchiata per valutare l'adesione cellula-cellula, polarità cellulare e/o lume formazione18 (Figura 4D).

7. migrazione saggi

Nota: Effettuare saggi di migrazione di U937, PMs THP-1 e fresco in piastre di coltura 24 pozzetti a fondo piatto utilizzando policarbonato cellulare cultura inserti con membrane di formato del poro 8 µm. È stato precedentemente dimostrato che le chemochine GM-CSF, MCP-1 e RANTES sono state trovate secreto alle alte concentrazioni in singole culture 3D delle linee cellulari BrC aggressive. E ' stato proposto che queste citochine sono state fondamentali per attrarre monociti al sito del tumore primario; Questo è stato testato in saggi di migrazione utilizzando le citochine come chemioattrattanti.

  1. Cultura U937, THP-1, o fresco PMs come descritto al punto 4.1.1.
  2. Sciacquare una volta ogni inserto con 200 µ l di RPMI 1640 senza sieri per idratare la membrana.
  3. Riempirlo con 50 µ l di freddo ECME, inserire gli inserti in una piastra di coltura 24 pozzetti a fondo piatto e consentire la ECME polimerizzare per 1 h a 37 ° C.
  4. Aggiungere 180 µ l di RPMI senza FBS nel vano superiore della piastra. Aggiungere nella camera inferiore senza bubbling 800 µ l di RPMI completate con entrambi 100 ng/mL di GM-CSF, MCP-1, o RANTES come chemoattractant. Utilizzo medio senza le citochine come controllo negativo. Incubare per 30 min a 37 ° C per stabilire una pendenza di chemokine.
  5. Posto a 1,5 x 105 di ciascun tipo di monociti in una provetta sterile, lavare due volte con 1 mL di PBS e centrifugare a 430 x g per 5 min a RT. Risospendere i monociti in 20 µ l di RPMI senza FBS: 1x, metterli negli inserti e molto attentamente omogeneizzare la sospensione cellulare (il volume finale della camera superiore è di 200 µ l).
  6. Consentire la migrazione delle cellule al progresso per 24 h a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
    Nota: Come i monociti sono non aderente, celle migratori sarà solitamente nei media del vano inferiore.
  7. Rimuovere gli inserti, recuperare i file multimediali e contare le celle a 2, 4, 6 e 24 h utilizzando una camera di Neubauer o un citometro a flusso; in alternativa, soprattutto se le celle non vengono trovate nei media, è possibile acquisire immagini della parte inferiore degli inserti con una fotocamera digitale. Il conteggio cellulare medio da 3 campi aleatori (a 100 ingrandimenti) è utilizzato per l'analisi (Figura 5).

8. invasione saggi

Nota: Effettuare saggi di invasione delle cellule del BrC in piastre di coltura 24 pozzetti a fondo piatto utilizzando inserti di cultura delle cellule in policarbonato con membrane di formato del poro 8 µm. Nei nostri studi originali, IL-8 è stata una delle citochine arricchite nei surnatanti delle co-culture 3D cella/monociti BrC. Se questa citochina stava partecipando all'invasione delle linee cellulari BrC è stato testato.

  1. Espandere le celle BrC in boccette di 75 cm2 . MCF-7, T47D, HS578T e MDA-MB-231 come descritto nel passaggio 1.2 (ma senza ECME) e cellule primarie di BrC come descritto al punto 2.4.
  2. Lavare una volta ogni coltura di policarbonato 8 µm-poro della membrana cellulare inserire con 200 µ l di terreno senza sieri (mezzo utilizzato dipende la linea cellulare testata) per idratare la membrana.
  3. Riempire l'inserto con 50 µ l di freddo ECME (1:4 diluizione ECME:cold medio senza FBS), inserire gli inserti in una piastra di coltura 24 pozzetti a fondo piatto e consentire la ECME polimerizzare per 1 h a 37 ° C.
  4. Una volta che il ECME ha polimerizzato, aggiungere 180 µ l dei media rispettiva cella senza FBS. Aggiungere 800 µ l media senza FBS attraverso le fessure dell'inserto. Incubare per 30 min a 37 ° C per stabilire un gradiente di IL-8.
    Nota: Evitare di creare bolle nei media. Supporto utilizzato è senza FBS ma integrata con 100 ng/mL di IL-8 come un chemoattractant, o pura media senza FBS, come controlli negativi.
  5. Ottenere un totale di 6 x 105 cellule di ogni linea cellulare come segue:
    1. Scartare i surnatanti, sciacquare una volta con 10 mL di PBS 1X e aggiungere 2 mL di 0.05% tripsina/0,48 mM EDTA per 2 min a 37 ° C per staccare le cellule. Aggiungere 4 mL di terreno completato per arrestare la reazione di tripsina e risospendere vigorosamente pipettando.
  6. Prendere un 10 µ l aliquota della sospensione delle cellule per contare le celle in una camera di Neubauer. Prelevare un volume della sospensione di cellule contenenti 6 x 105 cellule. Centrifugare a 430 x g per 5 min a RT, scartare il surnatante e lavare le cellule in 1 mL di PBS 1X. Ripetere il risciacquo una volta di più.
  7. Risospendere le cellule in 20 µ l dei rispettivi media senza FBS e posto negli inserti contenente 180 µ l dei rispettivi media senza FBS. Omogeneizzare accuratamente la sospensione cellulare di pipettaggio.
  8. Permettere l'invasione delle cellule al progresso per 48 h a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 ambiente.
  9. Dopo 48 h, rimuovere l'inserto, scartare il surnatante e sciacquare l'inserto una volta molto attentamente con 200 µ l di PBS 1X. Con un applicatore con punta di cotone togliere l'eccesso di PBS.
    Nota: Le cellule invasive di solito sono attaccati al lato opposto dell'inserto come in questo caso dove le cellule sono aderente.
  10. Fissare le cellule mettendo l'inserto in un pozzetto di una piastra di coltura 24 pozzetti a fondo piatto contenente 1 mL/bene di paraformaldeide al 4% per 15 min a RT. Afterwards, sciacquare gli inserti una volta con PBS 1X.
  11. Macchia le celle inserendo l'inserto in un pozzetto di una piastra di coltura 24 pozzetti a fondo piatto contenente 1 mL/bene di PBS 1x con cristalvioletto 0,2% per 45 min a RT. attentamente, con una rimozione di applicatore con punta di cotone tutti i ECME dall'alto della membrana , che contiene le cellule che non sono stati migrati e risciacquare molto accuratamente con acqua distillata per evitare di eliminare fissa cellule invasive.
  12. Contare le cellule invadono osservando il lato inferiore dell'inserto al microscopio invertito. Viene utilizzato il numero di cellulare medio da 3 campi aleatori (a 100 ingrandimenti). Nei casi in cui le cellule hanno invaso come cluster e sono difficili da contare singolarmente, è possibile acquisire immagini da 3 campi aleatori (a 100 ingrandimenti) con una fotocamera digitale. Analizzare le immagini con il software per analisi di immagine e utilizzare il IOD per quantificare l'invasione delle cellule (Figura 6).

Risultati

Analisi morfologica delle cellule BrC nelle culture 3D:

La morfologia delle cellule primarie del BrC crescendo in 3D culture a bassa e alta densità è stata studiata per 5 giorni. Durante le prime 48 h, le cellule aderiscono alla ECME e mantengono una bassa densità. A questo punto del tempo, può chiaramente essere apprezzato che le cellule presentano una forma allungata simile a mandrino, alcuni con due o pi?...

Discussione

Cellule epiteliali crescono in una conformazione spaziale 3D e loro interazione con le proteine ECM è fondamentale per l'omeostasi del tessuto. Molti studi sul cancro sono stati basati sulle cellule coltivate in strati monomolecolari (2D) e anche se sono stati fondamentali per la comprensione di molti aspetti della formazione del tumore e la progressione, monostrati non ricapitolare le caratteristiche che l'ECM impone sulle cellule, per istanza: limitando la proliferazione, la sopravvivenza delle cellule adesione-dipend...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non hanno alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE progetto n. 233061 a Ezequiel M. Fuentes-Pananá e da Fondo de Apoyo alla Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numero di progetto HIM-2014-053). NA di Espinoza-Sánchez è uno studente di dottorato da Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e ricevuta fellowship 231663 da CONACYT. NA E-S, riconosce anche il sostegno finanziario fornito dall'Istituto messicano di previdenza sociale (IMSS).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317Non-transformed breast cell line
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22Breast Cancer Cell line
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133Breast Cancer Cell line
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 mediumGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L glucose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotic/AntimycoticGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine SerumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Horse serum GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered SalineGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisoneSIGMA-ALDRICHH088-5G
Cholera toxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Crystal-violetHycel México541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable supports (inserts)Corning Inc34226.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts)Thermofisher Scientific1406206.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)Nalge Nunc International177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishesMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Riferimenti

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