Test de tolérance au Glucose intrapéritonéal, mesure de la fonction pulmonaire et la Fixation du poumon pour étudier l’Impact de l’obésité et des troubles du métabolisme sur résultats pulmonaires

Résumé

L’incidence de l’obésité augmente et augmente le risque de maladies pulmonaires chroniques. Modèles sont nécessaires pour établir les mécanismes sous-jacents et des stratégies préventives, animal bien défini. Ici, nous fournissons trois méthodes (épreuve d’hyperglycémie provoquée, pléthysmographie de corps et fixation du poumon) pour étudier l’effet de l’obésité sur résultats pulmonaires chez des souris.

Résumé

L’obésité et les troubles respiratoires sont les principaux problèmes de santé. L’obésité devient une épidémie émergente avec un nombre prévu de personnes obèses plus 1 milliard dans le monde en 2030, ce qui représente un fardeau socio-économique croissant. Simultanément, les comorbidités associées à l’obésité, y compris le diabète ainsi que maladies cardiaques et pulmonaires chroniques, sont continuellement à la hausse. Bien que l’obésité a été associée à un risque accru d’exacerbations de l’asthme, aggravation des symptômes respiratoires et mauvais contrôle, le rôle fonctionnel de l’obésité et le métabolisme perturbé dans la pathogenèse de la maladie pulmonaire chronique est souvent sous-estimée, et les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent insaisissables. Cet article vise à présenter les méthodes d’évaluation de l’effet de l’obésité sur le métabolisme, ainsi que la structure de poumon et fonction. Nous décrivons ici trois techniques d’études de la souris : (1) l’évaluation de la tolérance au glucose intrapéritonéale (HPI) pour analyser l’effet de l’obésité sur le métabolisme du glucose ; (2) mesure de la résistance des voies aériennes (Res) et de la conformité de l’appareil respiratoire (Cdyn) pour analyser l’effet de l’obésité sur la fonction pulmonaire ; et (3) préparation et fixation du poumon pour évaluation histologique quantitative ultérieur. Maladies pulmonaires liées à l’obésité sont probablement multifactorielles, découlant de la systémique inflammatoire et métabolique le dérèglement qui influencent potentiellement néfastes de la fonction pulmonaire et la réponse au traitement. Par conséquent, une méthode normalisée pour étudier les mécanismes moléculaires et l’effet de nouveaux traitements est essentielle.

Introduction

Selon le World Health Organisation (OMS) en 2008, plus de 1,4 milliards adultes, 20 ans et plus, faisaient de l’embonpoint avec un indice de masse corporelle (IMC) supérieur ou égal à 25 ; en outre, plus 200 millions d’hommes et les femmes presque 300 millions sont obèses (BMI≥30)¹. Obésité et syndrome métabolique sont les principaux facteurs de risque pour une multitude de maladies. Tandis que l’obésité et le tissu adipeux blanc une augmentation concomitant masse a été intimement liée au type 2 diabète^2,3, maladies cardiovasculaires, y compris la maladie coronarienne (CHD), insuffisance cardiaque (IC), fibrillation auriculaire⁴ et⁵de l’arthrose, leur rôle fonctionnel dans la pathogenèse des troubles respiratoires reste mal compris. Cependant, les études épidémiologiques ont démontré que l’obésité est fortement associée à des troubles respiratoires chroniques, y compris une dyspnée, syndrome d’apnée obstructive du sommeil (SAOS), syndrome obésité hypoventilation (OHS), chronique bronchopneumopathies obstructives (BPCO), embolie pulmonaire, pneumonie par aspiration et l’asthme bronchique^6,7,8,9. Mécanismes possibles liens entre l’obésité et métabolisme perturbé, p. ex., résistance à l’insuline et diabète de type II, à la pathogenèse de la maladie pulmonaire chronique comprennent non seulement des conséquences physiques et mécaniques du poids gain sur la ventilation, mais aussi induire un état inflammatoire subaiguë chronique^10,11. La montée de l’obésité et les maladies pulmonaires au cours de la dernière décennie, conjugués à l’absence de stratégies efficaces de prévention et d’approches thérapeutiques, met en évidence la nécessité d’étudier les mécanismes moléculaires pour définir de nouvelles voies pour gérer pulmonaire liée à l’obésité maladies.

Nous décrivons ici trois tests standards, qui sont des bases importantes pour enquêter sur l’obésité et son impact sur la structure du poumon et la fonction dans des modèles murins : glucose (1) intrapéritonéal tolérance (HPI) (2) mesure de la résistance des voies aériennes (Res) et respiratoire conformité au système (Cdyn) ; et (3) préparation et fixation du poumon pour évaluation histologique quantitative ultérieur. Le HPI est un test de dépistage fiable à l’absorption du glucose mesure et donc l’effet de l’obésité sur le métabolisme. La simplicité de la méthode permet de bonne normalisation et par conséquent la comparabilité des résultats entre les laboratoires. Des méthodes plus élaborées, tels que pinces hyperglycémiques ou d’études sur des îlots isolés, peuvent être utilisés pour une analyse détaillée du phénotype métabolique¹². Ici, nous évaluons la tolérance au glucose pour définir un État trouble systémique et métabolique associées à l’obésité comme base pour poursuivre ses études sur un résultat pulmonaire. Pour évaluer l’effet de l’obésité et les troubles métaboliques sur la fonction pulmonaire, nous avons mesuré la résistance des voies aériennes (Res) et la conformité de l’appareil respiratoire (Cdyn). Afin de caractériser une maladie pulmonaire, il existe des méthodes sobres mais aussi sans retenue pour l’évaluation de la fonction pulmonaire. Pléthysmographie sans retenue en se déplaçant librement les animaux imite un état naturel, reflétant les cycles respiratoires ; en revanche, les méthodes invasives, comme mesure d’impédance d’entrée de Res et cDyn chez les souris profondément anesthésiés pour évaluer la mécanique pulmonaire dynamique, sont plus précis¹³. Étant donné que les affections respiratoires chroniques sont traduisent par des altérations histologiques du tissu pulmonaire, fixation pulmonaire correcte pour une analyse plus approfondie est imminente. Le choix de la méthode de fixation du tissu et de préparation dépend du compartiment du poumon qui est étudié, par exemple, mener airways ou poumon parenchyme¹⁴. Nous décrivons ici une méthode qui permet une évaluation qualitative et quantitative des des voies pour étudier l’effet de l’obésité sur le développement de l’asthme.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été menées dans le respect de protocoles approuvés par les pouvoirs publics locaux (Land NRW, AZ : 2012.A424) et étaient conformes à la loi allemande de bien-être animal et de la réglementation sur le bien-être des animaux utilisés pour des expériences ou pour autres fins scientifiques. Puisque l’analyse de fonction de poumon peut-être affecter la structure du poumon et une analyse histologique donc ultérieurs, la mesure des Res Cdyn et la préparation et la fixation du poumon pour l’histomorphométrie doit être effectuée chez les différents animaux. Toutefois, la mesure de Res et Cdyn suite HPI est possible. Puisque le stress pendant la HPI pourrait interférer avec l’anesthésie nécessaire pour la fonction pulmonaire teste, une période de récupération d’environ 2 semaines après que HPI est recommandé de laisser la souris récupérer de la perte de poids de corps et changements de paramètres sanguins¹².

1. préparation pour l’épreuve d’hyperglycémie intrapéritonéale (HPI)

Remarque : Après 12 h de jeûne, la HPI complet prend environ 2 h.

1. Étant donné que le stress influe sur la glycémie significativement, s’assurer que les deux adaptation des souris, ainsi que la formation du savant, sont effectuées.
2. Transférer les animaux dans la zone expérimentale dans des conditions calmes et sans stress.
3. Envisager l’application d’une alimentation hypercaloric d’induire l’obésité chez les souris. Consultez la section « discussion » pour plus de conseils.
4. Animaux rapide pendant 12 h la nuit, sans limitation de l’accès à l’eau. Le lendemain, après 12 h de jeûne, préparer le lecteur de glycémie selon le fabricant du protocole (voir table des matières) en insérant une nouvelle bandelette de test dans le port de bandelette de test.
5. Inciser la pointe de la queue à l’aide de ciseaux stériles, tout en conservant doucement la souris à sa queue et immédiatement mesurer la glycémie à jeun en appliquant une goutte de sang coulant librement (échantillon minimal taille 0,5 µL) sur la bandelette de test de la glycémie.
   Remarque : Un compte à rebours démarre sur l’écran après une demande suffisante de l’échantillon de sang. Après 4 s, le résultat du test apparaît à l’écran.
6. Par la suite, peser et étiqueter les animaux individuellement à l’aide de couleurs de marquage.
7. Administrer 2 g glucose/kg corps poids par injection intrapéritonéale. Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g de poids corporel (1 cc seringue et une aiguille de 27 G).
8. Par la suite, mesurer la glycémie après 15, 30, 60 et 120 min en appliquant une goutte de sang coulant librement sur une nouvelle bandelette de test.
   Remarque : Le débit sanguin peut être augmenté en massant doucement la queue Astuce-quartiers. Si la plaie de la queue encrusts, nettoyez-le à l’aide d’un écouvillon stérile imbibé de solution de chlorure de sodium 0,9 %.
9. Que les animaux puissent reposer dans leur maison avec un accès illimité à de l’eau entre les mesures.

2. poumon fonction analyse mesure Res et cDyn

Remarque : Pour mesurer non perturbée Res et cDyn, souris doivent être aérés sous anesthésie profonde. Animal sans stress traitement et une surveillance appropriée de l’anesthésie sont essentiels. Pour des instructions générales à l’aide de techniques stériles, veuillez consulter l’article de Hoogstraten-Miller et al. ¹⁵

1. Calibrer la pléthysmographie avant chaque série d’expériences et de préparer les paramètres de l’étude au sein du logiciel (voir Table des matières).
2. Avant la chirurgie, profondément anesthésier animaux par injection intrapéritonéale de Xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) (1 cc seringue et une aiguille de 27 G). Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g / poids corporel.
   Remarque : Étant donné que la kétamine a un effet analgésique chez la souris, aucun traitement de la douleur supplémentaire n’est nécessaire. La procédure invasive sonde trachéale/pléthysmographie prend environ 5-7 minutes, puis d’acquisition de données puisse commencer.
3. Placez votre souris dans la position allongée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle.
4. Couvrir les yeux avec l’onguent pour prévenir le dessèchement sous anesthésie.
5. Surveiller constamment la profondeur de l’anesthésie à l’aide de la TEP pincée-réponse.
   NOTE : Supplémentaires d’administration de l’anesthésique peuvent être nécessaire pour maintenir un plan chirurgical de l’anesthésie.
6. Humidifiez la fourrure de la zone chirurgicale dans la région de la thyroïde avec l’éthanol à 70 %.
7. Inciser délicatement la peau dans la ligne médiane d’environ 1 cm entre l’encoche jugulaire du sternum et les symphyses de tubercule du mentum en soulevant avec une pince et le découpage de la peau sous l’inspection visuelle à l’aide de ciseaux émoussé (Figure 1 a).
8. Visualiser le sous-jacent du tissu adipeux sous-cutané et la glande thyroïde.
9. Exposer la trachée en soigneusement émoussé séparant les deux lobes de la thyroïde à l’isthme et la dissection des muscles sternothyroid (Figure 1 b) et sternothyroid. Veillez à ne pas de nuire à tous les navires et provoquer des saignements, car cela peut provoquer des effets indésirables sur le système cardio-vasculaire et, finalement, sur les mesures.
10. Par la suite, passer une suture chirurgicale tressé 4-0 entre la trachée et le œsophage à l’aide de forceps émoussé. Soigneusement inciser la trachée près le larynx entre l’anneau trachéal avec micro ciseaux.
11. Intuber le malade avec un tube trachéal (0,04 pouce/1,02 mm de diamètre) sous contrôle visuel (Figure 1). Fixer la tube par la ligature avec la suture chirurgicale pour éviter toute fuite dans le système.
12. Ensuite, déplacer l’animal au lit de la chambre de corps chauffé et connecter le tube trachéal à la têtière (Figure 1) et tourner sur la ventilation en appuyant sur le bouton de ventilation sur la face avant du contrôleur (Figure 1E).
13. Enquête sur la ventilation en observant le mouvement du thorax en même temps avec le taux de ventilation. Pour confirmer le positionnement correct du tube trachéal, veiller à ce que les deux côtés du thorax se déplacent en même temps.
14. Regarder la pression signal sur l’écran de l’ordinateur (Figure 1F). Veiller à ce que les courbes de ventilation sont uniformes. Si ce n’est pas le cas, détachez l’animal et vérifiez du côté de la chirurgie. Méfiez-vous de sang ou de mucus bloquant le tube trachéal.
    Remarque : Pour les animaux adultes avec un poids de 20-25 g, les réglages du ventilateur comme illustré à la Figure 2 sont proposées conformément aux recommandations du fabricant.
15. Pour contrôler les changements dans la pression trans-pulmonaire au cours de la ventilation, insérez un tube oesophagiens (0,04 pouce/1,02 mm de diamètre) dans le œsophage à la profondeur qui se rapproche au niveau des poumons. Regarder l’écran tout en plaçant le tube. Placer le tube où déflexion maximale de pression et artefacts de coeur minimes sont visibles sur l’écran.
16. Après la chirurgie, préparer l’animal pour la mesure. Réinjecter anesthésie par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) à l’aide d’une aiguille de 27 G et 1 seringue cc. Assurez-vous que le volume d’injection est de 0,1 mL/10 g / poids corporel.
    NOTE : Afin d’évaluer les hyperreagibility bronchique, nébuliser méthacholine, un agoniste des récepteurs muscariniques non sélective du système nerveux parasympathique, qui induit une bronchoconstriction. Acquisition de données se déroule en quatre phases distinctes (Figure 3).
17. Commencer d’acquisition de données selon le protocole manufacturer´s.
    Remarque : Le logiciel automatiquement guide les utilisateurs tout au long du processus d’acquisition.
18. Appliquer 10 µL de PBS (véhicule) sur le nébuliseur et commencer la nébulisation après 5 min d’acclimatation. Ensuite, suivre une phase d’intervention de 3 min, où Res (cmH₂O/mL/s) et cDyn (mL/cmH₂O) sont mesurés. À la fin, prévoir une phase de reprise de 3 min à l’animal avant la prochaine nébulisation.
19. Suivre le logiciel par application par étapes de 10 µL de concentrations croissantes de méthacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL et 12,5 µg/10 µL) du ventilateur.
20. Une fois que toutes les mesures ont été effectuées et enregistrées, sacrifier l’animal par dislocation cervicale.

3. poumon isolement pour analyse histomorphométrique Quantitative de souris adultes

1. Profondément anesthésier l’animaux par injection intrapéritonéale de Xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) (1 cc seringue et une aiguille de 27 G). Le volume d’injection doit être 0,1 mL/10 g / poids corporel.
   Remarque : Après avoir atteint l’état de tolérance chirurgicale, la préparation prend environ 5 min, suivie d’une perfusion orgue et 30 min pour la fixation.
2. Une fois que l’animal a atteint l’état de tolérance chirurgicale (orteil négatives pincée-réponse), désinfecter l’animal avec l’éthanol à 70 % et fixer l’animal sur un socle avec ruban chirurgical.
3. Sacrifier l’animal par ponction cardiaque et hémorragie. En bref, ouvrir l’abdomen avec une incision médiale à travers la peau et le péritoine, à l’aide de ciseaux émoussé.
4. Recherchez les quartiers tête diaphragme du foie et soigneusement séparer le foie et le diaphragme.
5. Faire une petite incision dans la membrane à l’aide de ciseaux émoussé et le ventricule gauche du coeur avec une aiguille de 20 G ponctuée attaché à une seringue de 2 mL. Lentement exsanguinate l’animal.
   NOTE : Exsanguination lente et minutieuse est importante pour éviter les ventricules s’effondrer en raison de la pression négative, empêchant une circulation sanguine non perturbée.
6. Disséquer le poumon en ouvrant le thorax doucement à travers une incision parasternale sur toute la longueur de la cage thoracique à l’aide de ciseaux courbes, émoussé.
7. Ensuite, soulevez la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale (Figure 3). Retirez le thymus pour voir le coeur et les poumons.
   Remarque : Facultative injection du ventricule droit, suivie d’une perfusion du système vasculaire pulmonaire avec PBS glacée et ensuite avec une solution de fixation [par exemple, 4 % (masse/volume) paraformaldéhyde (PFA)] est possible. Sachez qu’il y a une augmentation du risque d’entraîner une rupture des cloisons alvéolaires et altèrent la structure du poumon à l’aide de cette méthode.
8. Disséquer le poumon d’abord soigneusement retirer le cœur.
9. Par la suite, passer une suture chirurgicale tressé 4-0 entre la trachée et le œsophage à l’aide de forceps émoussé.
10. Ensuite, soigneusement inciser la trachée près le larynx entre l’anneau trachéal intubation avec une canule intraveineuse (26 G) et gonfler les poumons par la fixation de la pression à une pression constante de 20 cm H₂O à l’aide d’agent fixateur [par exemple, 4 % (masse /volume) de l’IFP].
11. Pour la fixation de la PFA, laisser le fixateur pendant 30 min à température ambiante. Par la suite, ligaturer la trachée et retirer la canule. Puis, d’accise du poumon soigneusement sans léser les tissus et stockez-le dans un agent fixateur à 4 ° C durant la nuit.
    Remarque : Par ailleurs, selon l’ATS/ETS GA de 2,5 % pour le papier un consensus tamponnée OsO4, solution uracile est utilisée pour la stabilisation du tissu approprié. Pour la préparation du tissu plus loin, voir le document de consensus par Hsia et al. ¹⁴

Résultats

Les résultats représentatifs du test de tolérance au glucose intrapéritonéal (HPI) (Figure 4), poumon fonction test (Figure 5) et représentant des images illustrant l’hématoxyline et éosine teint de poumons (Figure 6).

Le HPI a été réalisée chez des souris obèses (bleus) après 7 semaines de haute-graisse-alimentation (HFD). ...

Discussion

Ce rapport fournit trois protocoles pour trois différentes méthodes analyser l’impact de l’obésité sur le métabolisme du glucose et résultats pulmonaires. Tout d’abord, l’épreuve d’hyperglycémie provoquée offre la possibilité d’analyser l’absorption du glucose intracellulaire et peut être un indice de résistance à l’insuline. Deuxièmement, la pléthysmographie de corps entier est une technique de mesure de la fonction pulmonaire et est donc utile de tester l’efficacité de nouveaux traitem...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine