ויזואליזציה של מודולי קורטיקליים Cortices יונקים שעברו שיטוח

Summary

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט כדי להשיג מקטעים וצורניים שעברו שיטוח של יונקים cortices והמחש מודולים בקליפת המוח באמצעות פתולוגיה ושיטות immunohistochemical.

Abstract

קליפת בתרבית של מוח הוא parcellated לתוך substructures ברורים או מודולים. מודולים בקליפת המוח בדרך כלל לשקר מקבילה לגליון קורטיקלית, יכול להיות המותווית על ידי מסוימים פתולוגיה ושיטות immunohistochemical. במחקר זה, אנו מדגישים שיטה כדי לבודד את קליפת המוח של המוח יונקים ולשטח אותם לקבל במקביל סעיפים בגיליון קורטיקלית. אנחנו עוד גולת הכותרת שנבחרה פתולוגיה, immunohistochemical שיטות לעיבוד אלה משוטחים מקטעים וצורניים להמחיש מודולים קורטיקלית. בתוך קליפת המגע של יונקים שונים, אנו מבצעים להסטולוגיה אוקסידאז ציטוכרום כדי לחשוף את הגוף מפות או מודולים קורטיקלית המייצגים חלקים שונים של הגוף של החיה. בתוך קליפת entorhinal המדיאלי, אזור שבו נוצרים תאי הרשת, אנו מנצלים immunohistochemical שיטות לסימון מודולים של נוירונים נקבע גנטית אשר מסודרים בתבנית-רשת בגליון בקליפת המוח על פני מספר מינים. בסך הכל, אנו מספקים מסגרת כדי לבודד ולהכין layer-wise משוטחים חלקים קורטיקליים, ותנסו לדמיין את המודולים בקליפת המוח באמצעות פתולוגיה ושיטות immunohistochemical במגוון רחב של יונקים את המוח.

Introduction

חלק מהשינויים המשמעותיים במבנה המוח על פני האמיניות נראים גם קליפת המוח. למרות הבדלים משמעותיים, קליפת המוח של בעלי חיים עוקב אחר תבנית משותפת, ניתן לחלק בשתי דרכים נפרדות, על-ידי שכבות ואזורי¹. שכבות קורטיקלית לשקר מקביל פני השטח של המוח, משתנים מספר 3 שכבות cortices הזוחלים² על 6 שכבות cortices בתרבית של¹. אזורים קורטיקליים לעומת אזורים הנבדלים זה מזה של קליפת המקבילים במידה רבה פונקציות שונות, למשל, קליפת המגע מעורב התחושה של מגע או קליפת הראיה בעיבוד חזותי תשומות. אזורים קורטיקליים אלה לעיתים קרובות נחלקים תיקונים או מודולים³, אשר נמצאים באופן קבוע חוזרות מבנים אנטומיים, בעיקרו של דבר מצא מקבילות אל פני השטח pial של המוח. מודולים בקליפת המוח עשוי להיות מוגבל רובד⁴, או להרחיבו על-גבי שכבות מספר⁵.

אופטים בשיטות הרגילות של המוח לערב מקטעים רגילים על פני השטח של המוח, כמו הילתית או הווריד. בעוד שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להמחיש מודולים קורטיקלית, שפע של תכונות מעניינות יכול להתגלות כאשר המודולים בקליפת המוח הם דמיינו tangentially, במישור מקביל פני השטח של המוח. למשל, מודולים המגע במוח מכרסמים המייצג שפם, מופיעות כמו חביות כאשר visualized נורמלי השטח במוח, ולכן האזורים להפיק קליפת חבית שם. עם זאת, בלהמחיש את החביות בכיוון משיק, הם מגלים שפם-מפה, עם הקנים להיות אצלה כיוון טופוגרפית שיקוף את המבנה המדוייק של נכון על פני גוף חיצוני. במקרים מסוימים, אפילו ברח הסידור המודולרי זיהוי לתקופות ניכר, כאשר visualized באופן שאינו סוטה. קליפת entorhinal המדיאלי, ידועה הנוכחות של תאי הרשת, נוירונים אשר אש בתבנית משושה הרגילה כאשר חיים הוא וחוצה סביבה. למרות שזה אזור ובדוקים בכבדות, עד לאחרונה, הנוכחות של תיקונים או מודולים של תאים בקליפת entorhinal המדיאלי, אשר נפרסות פיזית בתוך תבנית משושה⁶, נמלט זיהוי. הנוכחות ואת הסידור של המודולים במוח עכברוש, היה בהנחייתם עושה קטעים וקולו של קליפת entorhinal המדיאלי, חוקרת את cytoarchitecture באופן layer-wise.

לאחר חלוקתה, ההיבט המסוים של ויזואליזציה של מודולים בקליפת המוח גם ניתן למימוש בדרכים רבות. בסגנון קלאסי, יש לימודי התחום מודולים מבוסס על התא צפיפות או סיבים פריסה¹. גישה פופולרית נוספת היא השימוש ציטוכרום אוקסידאז להסטולוגיה, אשר חושף את תחומי פעילות גבוהה יותר⁸. גישות חדשות יותר כוללים מסתכל על סוגי תאים נקבע גנטית, מכובד על בסיס שלהם חלבון ביטוי פרופילים^6,8.

במחקר זה, אנו מדגישים שיטות כדי לבודד את קליפת המוח של המוח יונקים, להשיג חלקים וצורניים שעברו שיטוח להמחיש מודולים קורטיקלית המבוסס על להסטולוגיה אוקסידאז ציטוכרום אימונוהיסטוכימיה של חלבונים מסוימים סוג התא.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני בוצעו על פי הנחיות גרמני על רווחת בעלי חיים תחת פיקוחו של ועדות האתיקה המקומית (LaGeSo). האדם ואת נתוני המוח בת נגזר נאומן. et al. ⁵ בהליך שלהלן מבוצע על עכבר Wistar זכר בוגר (זן: RJHan:WI).

1. זלוף והפקת המוח

הערה: על מנת לקבל מוח למשל קבוע ללא דם, transcardial זלוף של החיה הוא מעודדים, כמו שרידי דם מגביר את האות רקע לא ספציפי במהלך צביעת. בכל זאת, זה גם ניתן להשיג חלקים שעברו שיטוח של הדגימה perfused לא תכתים אותם. הקלות של טיפול הדגימה משתנה עם ריכוז מקבע בשימוש. קיבוע מעט מדי מגביר את הסיכון של טיפול נזק למוח במהלך השטחת ו גזירה, בעוד ריכוזים גבוהים מדי להוריד את הגמישות לשיטוח והאיכות של האות מוכתמים.

1. Transcardially perfuse החיה, באמצעות מחט 23 גרם. מדריך מפורט יותר, ראה Gage. et al. ⁹
   1. השתמש פוספט מאגר מלוחים¹⁰ (PBS; מ' 0.02 נקודות; pH 7.4) כדי. להוריד את הדם במוח ובגוף של החיה. המשך עד עירוי נוזלים מופיע ברור, לפחות 150 מ ל- PBS להיות חדורים דרך מערכת כלי הדם.
      הערה: התוצאות הטובות ביותר מושגות, בלחץ הדומה הטווח של לחץ הדם פיזיולוגיים של החיה להיות perfused (לדוגמה, עכברוש: 120-130 מ מ כספית). לחלופין, הוסף הפרין (10 U/mL) הפתרון כדי למנוע קרישת דם¹¹.
   2. כדי לתקן את המוח, transcardially להשרות מינימום של 100 מ ל paraformaldehyde¹² (PFA, 4%; ב 0.1 M פוספט מאגר (PB)¹³) עד הצוואר של החיה הוא נוקשה.
      התראה: PFA הוא קרצינוגן פוטנציאליים.
      הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור פעילות פתולוגיה מכתים, כגון ציטוכרום אוקסידאז, מושגות, בעת שימוש 2% מחברים. לשני מכתים, כגון אימונוהיסטוכימיה, 4% PFA היא עדיפה.
2. תמצית המוח מהגולגולת.
   הערה: ראה Gage. et al. ⁹ לפרטים.
   1. לבודד את הראש באמצעות מספריים גדולים או עצם שירס.
   2. באמצעות מספריים בסדר, לחתוך את העור לאורך האמצע של הצוואר האף. להפריד את העור כדי לחשוף את הגולגולת. הסר את הצוואר ואת השרירים הזמני באמצעות מספריים משובחים.
   3. להפוך את קו האמצע לחתוך דרך העצם interparietal החל מאגנום נקב עד לעצם.
   4. השתמש Rongeurs כדי לקלף את העצם interparietal. שקופית בסדר מספריים לאורך התפר המשונן וחותכים מהקצה האחורי של הקודקוד לקצה הקדמי של העצמות הקדמית.
   5. השתמש Rongeurs כדי לקלף את הקודקוד ואת עצמות המצח. לחלופין, הרם את העצמות משם באמצעות מלקחיים. השתמש בכף כדי לחתוך חוטי עצב הגחון, מסירים את המוח. להעביר את המוח PB (0.1 M; pH 7.4).
3. תקן האו ם perfused את המוח על-ידי טבילה 4% מחברים עבור h 1-3-4 מעלות צלזיוס (תלוי בגודל המוח בדיקה: חדף: ~ 1 h, האדם: ~ 3 h).
   הערה: עבור גדול gyrencephalic את המוח כמו בני אדם, לבודד, לגזור את תחום העניין כדי לצמצם את זמן קיבעון.
4. כדי להשיג אזורים קורטיקליים גדולים יותר במקטע, לשטח את המוח לפני קיבוע שאחרי נוספות; המשך לשלב 2. עם זאת, כדי להשיג חלקים יותר קשה להגיע לאזורים כמו קליפת entorhinal המדיאלי, פוסט-לתקן את המוח ב- 4% מחברים עבור 24 שעות לפני שתמשיך לשלב 2.

2. המוח לנתיחה ושיטוח

1. הפרד את ההמיספרות במוח באמצעות גילוח (lissencephalic מוחות) או אזמל (gyrencephalic מוחות).
   הערה: אם המוח לא תוקנה פוסט, זה רגישים לנזק על ידי טיפול.
2. שלב אופציונלי לסיוע הערכה ורישום הצטמקות סעיף הבאים:
   1. לנקב קליפת המוח באזור הלא-מעניינים, עם מחט 35G נורמלי השטח קורטיקלית. חזור על השלב פעמיים במרחקים המוגדרים לאורך הגיליון קורטיקלית. כדי לקבוע את המרחק לאורך הגיליון בקליפת המוח, להשתמש חוט חתוכות מראש באורך קבוע (למשל, 5 מ מ) ושים אותה על פני קורטיקלית לקביעת נקודות דקירה.
3. Lissencephalic המוח: להסיר מבנים subcortical באמצעות מרית ויבתר. קריטית: לשמור את המוח לחות עם חמאת בוטנים (0.1 M; pH 7.4) לאורך כל התהליך.
   1. להחזיק את המוח על ידי המוח הקטן ולהוסיף בעדינות את המרית לפתוח מטוס דיסקציה כפיס המוח. קצה עגול מרית יצביע מן הקליפה.
   2. שקופית המרית נוסף ומשוך בעדינות עד המרית בין קליפת המוח התלמוס. מבנים subcortical נפרד עם גירוד תנועות.
   3. לבדוק את הכדור עבור אפילו עובי.
      הערה: בכל אזורי לא אחיד עלולה לגרום הדרגתי הטרנס-שכבה במהלך חלוקתה. על חלוקתה משיקי, להשתמש אזמל לעשות חתך נקי דרך המוח, מקביל פני השטח pial של האזור שממנו מקטעים וצורניים הם הרצויה.
   4. צעדים אופציונלי לשיפור באיכות השיטוח:
      1. לעשות חתך נקי דרך סטריאטום, גרעין האקומבנס, קליפת orbitofrontal, מאז הם מגבירים את העובי של קליפת המוח באזור לרוחב. בנוסף, להוסיף חתך להקלה על בסיס של האזור הפנימי של קליפת המוח הקדם חזיתית, אשר מאפשר התגלגלות של חלקים המדיאלי של קליפת המוח.
   5. למקם את הכדור (כלפי מטה קליפת המוח) על משטח זכוכית. המשך לשלב 2.6.
4. Gyrencephalic המוח: להסיר חומר לבן להתגלות gyri (עבור פרוטוקולים מפורט, ראה: Sincich. et al. ¹⁴; Tootell, סילברמן¹⁵). קריטית: שימוש PB (0.1 M; pH 7.4) לשמור על המוח לח. כל הזמן.
   1. לשים את תחום העניין על נייר הסינון לח בצלחת פטרי גדולה, עם הקליפה כלפי מעלה.
   2. להסיר את מעידה קרום pia באמצעות מלקחיים שני.
   3. השתמש מקלון צמר גפן לח ולהוסיף בעדינות כל sulcus לנתק הידבקויות בין gyri.
   4. תסתובב המוח באמצעות נייר סינון נוסף לח.
   5. השתמש שני שפכטלים מיקרו מעוקל להתגלות gyri יחיד. השתמש הצד הקמור של תרוודים להתגרות מתפרק החומר הלבן עד שהגיע קרוב לסוף קעורה הפיתול. השתמש מקלון צמר גפן לח ולהמשיך עם תנועות מתערבל להגיע לסוף קעורה של הפיתול.
   6. להקניט gyri יחידה בנפרד. אם יש צורך, להוסיף להקלת קטן חותך אם המתח גבוהה מדי.
   7. לשטח את המוח פרש הפטרי או מיכל דומה.
5. לחלופין, במקום מוח גדול יותר על ספוג מכוסה נייר סינון, כדי להבטיח כי אזורים לא יתייבש.
6. במקום שתי חתיכות חימר התגלגל על שני הצדדים. קריטית: כמו העובי של החימר מגדיר כמה הכדור יכול יתבצע שיטוח, להבטיח כי החימר הוא 10-20% דק יותר קליפת האו ם שעברו שיטוח.
7. לחץ בעדינות השני זכוכית שקופיות/קטן פטרי על קליפת המוח, עד הכדור הוא שטוח לגמרי. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור אזור הרצוי, במקום השקופית זכוכית קודם על האזור המתאים. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור המוח lissencephalic, למקם את השקופית זכוכית tangentially בחלק הלטראלי קודם והפעילו לחץ מרוכז על אזור זה.
8. לשים משקולת (למשל, קרמיקה זכוכית השעון) על שקופיות זכוכית/הפטרי ולשטח את הכדור עבור h 3-5-4 מעלות צלזיוס ב PB.
9. עבור קיבוע שאחרי, לשחרר את הלחץ ולהסיר את השקופיות זכוכית. הכניס הכדור שעברו שיטוח מחברים (צף חינם) למשך 24 שעות על מטרף-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור פעילות פתולוגיה stainings מושגות כאשר משתמש 1% מחברים. עבור stainings אחרים, כגון אימונוהיסטוכימיה, שכל perfused האו ם, 2% PFA יכול לשמש.

איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת עבודה עבור שיטוח של האונה קורטיקלית עכברוש ו ויזואליזציה של מודולי קליפה המגע. מיד לאחר transcardial זלוף, המוח של עכבר היה גזור (A). מבנים subcortical הוסרו, קליפת שוטח בין שתי שקופיות זכוכית במאגר פוספט (B). שעברו שיטוח האונה (C) היה פוסט קבוע, tangentially למחלקה, והוא ישאר לכל פעילות ציטוכרום אוקסידאז (D). גודל ברים = 1 ס מ. ר: Rostral, c: Caudal, l: לרוחב, מ ': המדיאלי. איור מקורי לאואר. et al. ²³ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. חיתוך קטעים וצורניים

הערה: בהתאם לדרישות של הפרוטוקולים מוכתמים, בתהליך חיתוך ועובי ניתן להתאים. Vibratome שימש לחתוך את ההמיספרות לעיבוד נוסף פתולוגיה (שלב 3.2) ב- 80-150 מיקרומטר. אולם, לצורך עיבוד immunohistochemical, סעיפים דקים הם הרצויה, מיקרוטום הקפאה שימש אופטים (שלב 3.3) ב 10-60 מיקרומטר. ראה וידאו 1.

1. לשטוף את הכדור שעברו שיטוח ב PB (0.1M; pH 7.4) למשך 15 דקות.
2. חותכים את הכדור על vibratome.
   1. במקום הכדור tangentially על המחזיק עם פרוסות. לחלופין, הקש שוב בעדינות עם מגלשת זכוכית לפני מתקן אותו בעמדה (למשל, עם דבק מגע).
      הערה: למזער את כמות הדבק משמש, כי חפצים חיתוך עלולה לגרום בגלל העובי הקטן של ההמיספרות שעברו שיטוח.
   2. חותכים הכדור מהקצה עבה יותר, יציבה יותר לקראת הסוף רזה (האחורי כדי הקדמי, כאן) העובי הנדרש. המשך לשלב 3.4.
      הערה: אם ריכוזים נמוכים קיבוע שימשו, לחתוך אותו במהירות איטית ו משרעת גבוהה
3. חותכים את הכדור על מיקרוטום הקפאה.
   1. Cryoprotect המוח במועט זה בתמיסה 30% סוכרוז (PB) עד כיורים.
      הערה: בהתאם לגודל של הרקמה להיות cryoprotected, נקלט הפתרון יכול לנוע בין כמה שעות עד כמה ימים. מוח גדול יותר שיטות חלופיות cryoprotection עשוי להיחשב (ראה Rosene. et al. ¹⁶).
   2. טופס קרח בסיס מיקרוטום הקפאה כדי לטעון את המוח. לבנות בסיס הקרח על ידי הקפאת PB על פני לחסום מיקרוטום הקפאה. קריטית: ודא כי פני השטח של בסיס קרח במקביל הלהב מיקרוטום. כדי לעשות זאת, חותכים את הקרח ריק הבסיס באמצעות הלהב מיקרוטום ליישור בדיוק הבסיס קרח במקביל למשטח חיתוך.
   3. להטביע את המוח קפואים בינוני והר זה פנייך לחסום האזמל הקטן עם השטח של עניין מקביל פני בלוק. פני השטח pial של המוח לכיוון פני לחסום האזמל הקטן. קריטי: להתאים את טמפרטורת הקיפאון בהתאם לגודל המדגם; טמפרטורות גבוהות יותר להבטיח את תקינות סעיף טוב יותר בעת חלוקתה, אך חלקים גדולים דורשים טמפרטורות נמוכות יותר להקפיא מדגם אחיד.
   4. לחתוך את המוח tangentially על העובי הנדרש (מהירויות חיתוך איטית ואחידה התוצאה בסעיף האיכות הטובה ביותר).
4. רחץ בסעיפים PB למשך 15 דקות על מטרף.

1 וידאו: וידאו סכמטי של חלוקתה וצורניים עכברוש המדיאלי entorhinal קליפת, הפריסה של parasubicular ומודולי entorhinal. קליפת entorhinal המדיאלי של מוח מכרסמים ממוקם בקצה האחורי של קליפת המוח, מטים כלפי הצד המדיאלי של הגחון. סעיפים וצורניים מתקבלים על ידי המכוונת סכין לאורך זווית זו. כתוצאה מכך, סוג התא המתאים ספציפית מכתים מגלה מבנים מודולריים המדיאלי entorhinal קליפת ו parasubiculum הסמוך. וידאו מותאם ברכט וריי⁸. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

4. ויזואליזציה של מודולים בקליפת המוח באמצעות צביעת ציטוכרום אוקסידאז

הערה: בפרוטוקולי מכתימים שונים יש פותחה לצורך זיהוי פתולוגיה של פעילות ציטוכרום אוקסידאז, למשל, קודם על ידי וונג-ריילי¹⁷ , שונה מאוחר יותר על-ידי דיבאץ. ואח ¹⁸ לפרוטוקול זה מבוסס על האחד על ידי דיבאץ. et al. ¹⁸, מאז השימוש של ניקל-אמוניום סולפט (NiAS) גורמת להגברת הניגודיות ומודולים כדאי שהוגדר באזורים קורטיקליים מוכתם.

1. להכין את אוקסידאז ציטוכרום מכתים פתרון (ראה דיבאץ. et al. ¹⁸)-10 מ"ל של פתרון, הוסיפו: 10 מ"ל HEPES מאגר (0.1 M, pH 7.4), 400 מ ג סוכרוז, 12.5 מ ג NiAS, 2 מ ג ציטוכרום C, diaminobenzidine 6 מ ג (DAB).
   התראה: DAB ו- NiAS הם חומרים מסרטנים.
   הערה: להוסיף DAB ממש לפני דגירה של מקטעים.
2. לשטוף את המקטעים במאגר HEPES (0.1 M, pH 7.4) על מטרף למשך 15 דקות.
3. דגירה בסעיפים הפתרון מכתימים בטמפרטורת החדר על מטרף.
   הערה: לבחון את המהירות של צביעה. אם אין תגובה גלויה, לשנות הדגירה ב 37 º C. בהתאם לכמות של קיבעון, צביעת יכול להיות שנצפו לאחר 10 דקות או כמה שעות.
4. לעצור את התגובה על-ידי הוספת 4% PFA; פעולה זו מונעת מחדש למות לא רצויים, עלייה של רקע אות.
5. לשטוף את המקטעים שלושה זמני באמצעות מאגר HEPES למשך 10 דקות.
6. הר ויבש הסעיפים בשקופיות זכוכית.
7. מייבשים הסעיפים עם שורה הגוברת אלכוהול:
   1. לשטוף השקופיות 60% אתנול עבור 1 מינימלית שטיפת השקופיות 80% אתנול עבור מינימלית 1 לשטוף את השקופיות אתנול 96% עבור 2 דק. לשטוף את השקופיות 100% אתנול במשך 3 דקות לשטוף את השקופיות ב אלכוהול איזופרופיל עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות של קסילן במשך 5 דקות.
8. מיד להוסיף אמצעי התקשות-הרכבה מהירה, להוסיף את coverslip. קריטי: אל תשתמש מדיומים גובר על בסיס מים, כפי NiAS יהיה שטף ולבזות ההכתמה.
9. לשמור על הסעיפים 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.

5. ויזואליזציה של מודולים בקליפת המוח באמצעות נוגדן

הערה: פרוטוקולים מרובים זמינים עבור אימונוהיסטוכימיה, אופטימיזציה עבור הדגימה ואת הסוג של בדיקה. מספרות לקולנוע שניתן יהיה כנדרש, על ידי ריכוזים שונים של נוגדנים, סוכנים permeabilizing ושעות הדגירה. להלן כללי התנהגות מוביל לתוצאות טובות לגילוי מגוון גדול של נוגדנים והדמיה מאת הגששים פלורסנט.

1. לשטוף את המקטעים ב- PBS (0.1 M; pH 7.4) למשך 15 דקות.
2. אופציונלי: לבצע אחזור אנטיגן לחשוף epitope שימוש באמבט מים (על סמך ג'יאו. et al. ¹⁹; שיטות אלטרנטיביות, ראו Pileri. et al. ²⁰).
   1. מחממים באמבט מים עד 80 ° C. להכין tri-סודיום ציטרט מאגר¹⁹ (pH 8.0) ומחממים אותה באמבט מים עד 80 ° C.
   2. להעביר את המקטעים tri-סודיום ציטרט מאגר. דגירה הסעיפים למשך 30 דקות ב 80 ° C
   3. מגניב הסעיפים עד לטמפרטורת החדר
   4. רחץ בסעיפים PBS למשך 15 דקות.
3. לשטוף את הסעיפים פעמיים ב- PBS-X (0.5% טריטון-X, ב- PBS 0.1 M) למשך 15 דקות.
4. לחסום epitopes לא ספציפי על-ידי המקננת הסעיפים בפתרון של אלבומין שור (BSA; 2.5%), טריטון-X (0.75%) ב- PBS כבר שעתיים.
5. דגירה בסעיפים נוגדן ראשוני, למשל, Calbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA ב- PBS-X), 2-3 ימים מטרף-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: דילול אופטימלית עבור נוגדן ראשוני תלוי נוגדן ספציפי משמש. עיין המידע של היצרן כדי להשיג דילול לקריטריונים נוגדנים ספציפיים. נוגדנים מרובים יכולים לשמש יחד אבל צריך להעלות כנגד מינים שונים.
6. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים ב- PBS למשך 15 דקות כל אחד.
7. דגירה מקטעים לילה נוגדנים משניים (1:200, BSA 1% ב- PBS) ב 4 ° C-מטרף.
   הערה: מספר נוגדנים משניים ניתן להשתמש ב ספקטרום שונה אם מספר נוגדנים העיקרי שימשו.
8. לשטוף הנוגדן משני על ידי שטיפת הסעיפים 3 פעמים ב- PBS למשך 10 דקות.
9. הר ויבש הסעיפים על משטח זכוכית עבור מיקרוסקופ.
   הערה: הסעיפים עדיין צריך להיות לח לפני הרכבה של coverslip.
10. להחיל בינוני הרכבה מתאים צבעי זריחה על הסעיפים רקמות ולהחיל על coverslip.
11. יבש הסעיפים לשעה.
12. לאחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip באמצעות לק ולשמור באפלה ב 4 º C.

תוצאות

אנו להשיג חלקים קורטיקליים שעברו שיטוח של קליפת המגע במגוון של המוח, לעבד אותם להסטולוגיה אוקסידאז ציטוכרום להמחיש את המודולים somatotopic המייצגים את חלקי הגוף השונים. גישה השוואתית זו מאפשרת לימוד כוחות האבולוציוני הזה cortex צורה, למשל, מראה מאוד שנשמרת ייצוג mystacial vibrissae ...

Discussion

מודולריות ב קליפת התגלתה תוך שימוש במגוון טכניקות. המודולים המוקדם של קורטיקלית מחקרים בדרך כלל מזוהה גם דמיין תא אזורים צפופים או היעדרות של סיבים¹. שיטות עוקבות נעזרו הנוכחות של חבילות דנדריטים²⁴, afferents אזור מסוים²⁵, או העשרה של נוירוטרנסמיטורים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochrome oxidase staining
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637
D(+)-Saccharose	Carl Roth	4621.1
Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	A1827
HEPES	Carl Roth	9105.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen retrieval
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909
Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Sodium chloride	Carl Roth	9265.1
Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate	Carl Roth	4984.3
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
TRITON-X 100	Carl Roth	3051.3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemistry
Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal	Swant	RRID: AB_10000347
Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal	Swant	RRID: AB_10000340
Albumin Fraction V, biotin free	Carl Roth	0163.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting or freezing media
Fluoromount (immunofluorescence)	Sigma-Aldrich	F4680
Eukitt (histochemistry)	Sigma-Aldrich	03989
Tissue freezing medium	Leica Biosystems	NC0696746
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol dehydration
Ethanol 100%	Carl Roth	9065.3
Ethanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Xylene substitute	Fluka	78475
Name	Company	Catalog Number	Comments
Devices/tools
Microm HM 650V	Thermo Scientific
Jung RM2035	Leica Biosystems
Dumont #55 Forceps - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00
Bone Shears - 24 cm	Fine Science Tools	16150-24
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14
Blunt Scissors	Fine Science Tools	14000-18
Surgical Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14101-14
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14001-13
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14094-11