병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

요약

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

초록

포유류 두뇌의 대뇌 피 질은 별개 콘텐츠의 또는 모듈에 parcellated. 대뇌 피 질의 모듈 일반적으로 대뇌 피 질의 시트에 평행이 고 특정 immunohistochemical 조직화 학적인 방법에 의해 구분 된 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 대뇌 피 질의 시트 섹션 병렬을 얻기 위해 그들을 평평 하 게 포유류 두뇌에서 피 질을 분리 하는 방법을 강조 표시 합니다. 우리 더 강조 조직화 학적인 선택 하 고 이러한 처리 immunohistochemical 방법 평평 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해 접선 섹션. 다양 한 포유류의 somatosensory 피 질에 우리 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 몸 지도 나 동물의 신체의 다른 부분을 대표 하는 대뇌 피 질의 모듈을 수행 합니다. 중간 entorhinal 외피, 그리드 셀 생성 되는 지역에서에서 우리 immunohistochemical 메서드를 여러 종에 걸쳐 대뇌 피 질의 시트에 그리드 패턴에서 배열 되는 유전자 결정된 뉴런의 모듈을 강조 표시 사용 합니다. 전반적으로, 프레임 워크를 분리 하 고 layer-wise 준비 대뇌 피 질의 섹션, 평평 하 고 대뇌 피 질의 모듈 사용 하 여 조직화 학적인 방법과 immunohistochemical 포유류 두뇌의 다양 한 시각화 제공 합니다.

서문

일부 계통에서 뇌 구조에서 가장 중요 한 변화는 대뇌 피 질에서 관찰할 수 있습니다. 중요 한 차이도 불구 하 고 동물의 피 질 일반적인 패턴 및 분할 될 수 있다 광범위 하 게 두 가지 방법으로 레이어 및 지역¹. 대뇌 피 질의 레이어 두뇌의 표면에 평행이 고 파충류 외피가² 에 3 층에서 포유류 외피가¹6 레이어 숫자에서 다. 대뇌 피 질의 영역 다른 한편으로 주로 해당 고유 기능, 예를 들면하는 외피의 별개 영역, somatosensory 피 터치의 시각적 입력 처리에 시각 피 질 감각에 참여. 이러한 대뇌 피 질의 영역 수 종종 수 세분화 패치 또는 모듈³, 정기적으로 해 부 구조, 근본적으로 뇌의 pial 표면에 평행 하 게 반복 하는. 대뇌 피 질의 모듈 특정 레이어⁴에 갇혀 있을 수 있습니다 또는 여러 레이어⁵에서 확장.

두뇌의 표준 단면 방법 코로나 또는 화살 처럼 두뇌의 표면에 수직 섹션을 포함 한다. 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 대뇌 피 질의 모듈은 두뇌의 표면에 평행한 평면에 접선, 시각 때 다양 한 흥미로운 기능 계시 될 수 있습니다. 예를 들어, 수염, 대표 설치류 두뇌 somatosensory 모듈 배럴 때 뇌 표면에 정상적인 시각으로 나타나고 따라서 지역 파생 이름 신 피 질. 그러나, 접선 방향에서 배럴, 머릿속에 외부 몸 표면에 수염의 정확한 레이아웃을 미러링 지형 방향에 배치 되 고 배럴을 가진 수염-지도, 공개 그들은. 경우에 따라, 모듈 배열도 탈출 상당한 기간에 대 한 감지 비 접선 방식으로 시각화 하는 경우. 중간 entorhinal 외피, 표 셀, 동물 환경이 이동 될 때 일반 육각 패턴에 발생 하는 신경 세포의 존재에 대 한 알려져 있다. 비록 그것은 무 겁 게 조사 지역, 최근, 패치의 존재 또는 중간 entorhinal 외피에 있는 세포의 모듈까지,이 실제로 6 각형 패턴⁶, 레이아웃 탐지를 탈출 했다. 존재와 쥐 뇌에서 이러한 모듈의 중간 entorhinal 외피의 접선 섹션을 만들고 layer-wise 방식으로 cytoarchitecture를 조사에 의해 촉진 되었다.

단면, 후 대뇌 피 질의 모듈의 시각화의 특정 측면도 여러 가지 방법으로 실현 될 수 있습니다. 고전적인, 연구 모듈 세포 밀도 또는 섬유 레이아웃¹에 따라 구분 된 있다. 또 다른 인기 있는 방법은 높은 활동⁸의 영역을 계시 한다 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry의 사용 이다. 새로운 접근 유전자 결정된 세포 유형, 그들의 단백질 식 프로필^6,8기준으로 구별을 보고 포함 한다.

이 연구에서 우리는 하 포유류 두뇌에서 외피 분리 평평된 접선 섹션, 대뇌 피 질의 모듈 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 세포 형 특정 단백질의 immunohistochemistry 기반 시각화 방법을 강조 표시 합니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 로컬 윤리 위원회 (LaGeSo)의 감독 하에 동물 복지에 독일 지침에 따라 수행 했다. 인간 박쥐 뇌 데이터 노이만 외 에서 파생 했다 ⁵ 다음 절차는 성인 남성 Wistar 쥐에 수행 (스트레인: RJHan:WI).

1. 관류 및 뇌 추출

참고: homogenously 고정 하 고 혈액-무료 두뇌를 얻기 위해 동물의 transcardial 관류는 매우 권장 하 고, 잔여 혈액 얼룩 동안 불특정 배경 신호를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 유엔 perfused 견본에서 평평된 섹션을 가져오고 얼룩 수 이기도 합니다. 시료 처리의 편리한 사용 정착 액의 농도 따라 다릅니다. 너무 작은 고정 병합 및 절단, 너무 높은 농도 병합에 대 한 유연성과 착 색 신호의 품질 낮은 하는 동안 하는 동안 두뇌에 손상을 처리의 위험을 증가 시킵니다.

1. Transcardially perfuse는 동물 23 G 바늘을 사용 하 여. 더 자세한 안내 참조 게이지 외. ⁹
   1. 인산 염 버퍼 식 염 수¹⁰ (PBS, 0.02 M, pH 7.4) 동물의 몸과 뇌에서 피를 사용 하 여. 주입 액체 명확, 적어도 150 mL PBS 혈관 시스템을 통해 주입 되 고 표시 될 때까지 계속 합니다.
      참고: 최상의 결과 얻으려면 끼얹는다 되 동물의 생리 적인 혈압의 범위와 유사한 압력에 달성 된다 (예를들면, 쥐: 120-130 mmHg). 필요에 따라 솔루션을 피하기 위해 혈액 응고¹¹헤 파 린 (10 U/mL)를 추가 합니다.
   2. 뇌를 해결 하려면 transcardially 최소 100 mL paraformaldehyde¹² 달 이다 (PFA, 4%; 0.1 M 인산 버퍼 (PB)¹³) 동물의 목은 뻣 뻣 한 때까지.
      주의: PFA는 잠재적인 발암 물질 이다.
      참고: 얼룩, 같은 시 토 크롬 산화 효소 조직화 학적인 활동에 대 한 가장 좋은 결과 달성, 2%를 사용 하는 경우 PFA. 다른 얼룩, immunohistochemistry, 등 4 %PFA 것이 좋습니다.
2. 두개골에서 뇌를 추출 합니다.
   참고: 게이지 외. 자세한 내용은 ⁹ .
   1. 머리 큰가 위 또는 뼈가 위를 사용 하 여 격리 합니다.
   2. 좋은 위를 사용 하 여 코 목에서 중간에 따라 피부를 잘라. 두개골을 노출 피부 떨어져 당겨. 목과 일시적인 근육 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다.
   3. 정수 리 뼈까지 구멍 매그넘에서 출발 interparietal 뼈 통해 잘라 중간을 확인 합니다.
   4. 벗기다 interparietal 뼈 Rongeurs를 사용 합니다. 화살 봉합을 따라 잘가 위를 정면 뼈의 앞쪽 끝에는 정수 리의 후부 끝에서 잘라.
   5. Rongeurs를 사용 하 여 정수 리와 정면 뼈 껍질. 또는, 멀리 집게를 사용 하 여 뼈를 들어 올립니다. 숟가락을 사용 하 여 복 부 신경 코드를 잘라내어 뇌를 제거. PB (0.1 m M, pH 7.4)에 뇌를 전송.
3. 4%에 침수에 의해 유엔 perfused 두뇌 수정 4 ° C에서 1-3 h PFA (두뇌 크기 및 프로브에 따라: 말괄량이: ~ 1 h, 인간: ~ 3 h).
   : 참고 대형 및 gyrencephalic 두뇌 인간 같이, 분리 하 고 고정 시간을 줄이기 위해 관심 영역 밖으로 잘라.
4. 섹션에 더 큰 피 질 영역을 얻기 위해 병합 더 후 고정; 이전 뇌 2 단계로 진행 합니다. 그러나, 부분의 중간 entorhinal 외피 같은 영역에 도달 더를, 후 4%에서 뇌 수정 PFA 2 단계를 진행 하기 전에 24 h에 대 한.

2. 뇌의 해 부와 병합

1. 면도날 (lissencephalic 두뇌) 또는 메스 (gyrencephalic 두뇌)를 사용 하 여 두뇌 반구를 분리 합니다.
   참고: 경우에 뇌 후 고정 되지이 처리에 의해 손상 될입니다.
2. 후속 섹션 등록 및 수축 추정을 방 조에 대 한 선택적 단계:
   1. 비-관심의 영역에서 피 질 대뇌 피 질의 표면에 정상 35 G 바늘으로 찔린 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 정의 된 거리에서 두 번 단계를 반복 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 거리를 결정 하려면 미리 잘라 스레드를 사용 하 여 고정된 길이 (예를 들어, 5 m m)에 하 고 펑크의 포인트를 결정 하는 대뇌 피 질의 표면에 따라 하다.
3. Lissencephalic 두뇌: subcortical 구조 해 주걱을 사용 하 여 제거. 중요: 모든 절차에 걸쳐 PB (0.1 m M, pH 7.4)와 습 한 뇌를 유지.
   1. 소 뇌에 의해 뇌를 누른 부드럽게 신체 callosum에서 해 부 비행기 여 주걱을 삽입 합니다. 라운드 팁 주걱의 피 질에서 가리켜야 합니다.
   2. 추가 주걱을 주걱 시상과 피 질 사이 때까지 부드럽게 당겨. 별도 동작을 긁어와 subcortical 구조입니다.
   3. 반구도 두께 대 한 검사 합니다.
      참고: 모든 고르지 못한 영역이 단면 중 트랜스 레이어 그라데이션에 발생할 수 있습니다. 접선 단면 메스는 뇌를 통해 접선 섹션은 원하는 지역의 pial 표면에 평행 하 게 깨끗 한 컷을 만들기 위해 사용 합니다.
   4. 병합 품질 향상을 위한 선택적 단계를 수행:
      1. 그들은 측면에 피 층의 두께 증가 이후가, 핵 accumbens, orbitofrontal 외피를 통해 깨끗 한 컷을 확인 합니다. 또한, 외피의 중간 부분에의 전개를 수 있는 전 두 엽 피 질의 내부 지역에 구호 컷을 추가 합니다.
   5. 유리 슬라이드에 반구 (피 질 아래로)를 놓습니다. 2.6 단계로 진행 합니다.
4. Gyrencephalic 두뇌: gyri 펼쳐 백색 질 제거 (자세한 프로토콜에 대 한 참조: Sincich 외. ¹⁴; Tootell 및 실버¹⁵)입니다. 중요: 사용 PB (0.1 m M, pH 7.4) 촉촉한 유지 하는 두뇌에서 모든 시간
   1. 관심 영역을 향하도록 피와 큰 페 트리 접시에 젖은 필터 종이 입었다.
   2. 거미 집 모양의 막과 두 개의 집게를 사용 하 여 pia를 제거 합니다.
   3. 젖은 면봉을 사용 하 고 gyri 사이의 유착을 분리 하려면 각 고 랑에 부드럽게 삽입.
   4. 다른 젖은 필터 종이 사용 하 여 두뇌를 돌아서.
   5. 2 개의 곡선된 마이크로 주걱을 사용 하 여 단일 gyri 전개. 이랑의 오목 끝 가까이 도달까지 떨어져 백색 질을 애타게 하는 주걱의 볼록한 쪽을 사용 합니다. 젖은 면봉을 사용 하 고는 이랑의 오목 끝에 도달 소용돌이 움직임 진행.
   6. 떨어져 단일 gyri 애타게. 필요한 경우 작은 구호 상처 긴장 너무 높은 경우 추가 합니다.
   7. 페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에서 펼친된 두뇌 평평.
5. 필요에 따라 지역 밖으로 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 적용 하는 필터 종이 스폰지에 더 큰 두뇌를 배치 합니다.
6. 양쪽에 찰 흙의 2 개의 연된 조각을 놓으십시오. 중요: 흙의 두께 정의 얼마나 많은 북반구를 결합 수, 점토 10-20% 인지 확인 취소 병합 된 피 질 보다 얇은.
7. 북반구는 완전히 평평 때까지 부드럽게 피 질에 두 번째 유리 슬라이드/작은 페 트리 접시 누릅니다. 원하는 지역에 대 한 최상의 결과 얻으려면 해당 지역에 유리 슬라이드를 먼저 놓습니다. Lissencephalic 두뇌에 대 한 최상의 결과 얻으려면, 유리 슬라이드 tangentially 측면 부분에 먼저 놓고이 지역에 집중 된 압력을 적용 합니다.
8. 유리 슬라이드/페 트리 접시 (예, 세라믹 시계 유리) 무게를 넣어 샌드위치에 4 ° C에서 3-5 h에 대 한 반구를 평평 하 게.
9. 후 고정을 위한 압력을 해제 하 고 유리 슬라이드를 제거 합니다. 4 ° c.에 통에 24 h 평평된 반구 PFA (무료 부동)에 넣어
   참고: 조직화 학적인 활동 stainings에 대 한 최상의 결과 달성 1%를 사용 하는 경우 PFA. Immunohistochemistry, 유엔 perfused 두뇌, 2 %PFA 사용할 수 등 다른 stainings에 대 한.

그림 1: 쥐 대뇌 반구 및 시각화 somatosensory 피 질에 모듈의 병합에 대 한 워크플로의 도식 대표. 쥐의 뇌 해 부 transcardial 관류 후 (A). 바꾸어 구조 제거 하 고 피 질 인산 버퍼 (B)에서 두 개의 유리 슬라이드 사이 평평 했다. 병합 된 반구 (C) 후 고정, 접선 sectioned, 고 시 토 크롬 산화 효소 활동 (D)에 대 한 스테인드. 스케일 바 = 1 cm. r: Rostral, c: 꼬리, l: 측면, m: 중간. 라우 어 외. 에서 적응 하는 그림 ²³ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 절단 접선 섹션

참고: 얼룩 프로토콜의 요구에 따라 절단 절차 및 두께 적용할 수 있습니다. Vibratome는 80-150 µ m에서 더 조직화 학적인 처리 (3.2 단계) 반구를 잘라 사용 되었다. 그러나, immunohistochemical 처리, 얇은 단면도 원하는 및 냉동 톰 단계에 대 한 단면 (3.3) 10-60 µ m에 사용 되었다. 동영상 1을참조 하십시오.

1. 샌드위치에 평평된 반구를 세척 (0.1M, pH 7.4) 15 분.
2. vibratome에 있는 반구를 잘라.
   1. 접선 조각화 홀더는 반구를 놓습니다. 필요에 따라 다시 눌러 부드럽게 위치 (예를 들어, superglue 함께) 그것을 고정 하기 전에 유리 슬라이드와 함께.
      참고: 절단 아티팩트 평평된 반구의 작은 간격으로 발생할 수 있기 때문에 사용 하는 접착제의 양을 최소화 합니다.
   2. 필요한 두께에 얇은 끝 (앞쪽, 하 후부 여기) 두꺼운 하 고 더 안정적인 끝에서 반구를 잘라. 3.4 단계로 진행 합니다.
      참고: 고정은 낮은 농도 사용 하는 경우 그것을 잘라 느린 속도 높은 진폭에서.
3. 냉동 톰에 반구를 잘라.
   1. Cryoprotect 때까지 (PB)에 30% 자당 해결책에 그것을 immersing 하 여 두뇌 싱크.
      참고: 조직 되 고 cryoprotected의 크기에 따라 솔루션에 싱킹 범위는 몇 시간에서 몇 일입니다. 큰 머리에 대 한 대체 cryoprotection 방법 간주 될 수 있습니다 (참조 Rosene 외. ¹⁶)입니다.
   2. 기본 탑재 두뇌 동결 톰에 얼음을 형성 합니다. PB 동결 톰의 블록 얼굴에 결빙으로 기본 얼음을 생성 합니다. 중요: 얼음 기지의 표면 톰 블레이드 병렬 인지 확인 합니다. 이 위해 정확 하 게 절단 표면에 평행 하 게 얼음 베이스에 맞게 톰 블레이드를 사용 하 여 기본 빈 얼음 잘라.
   3. 중간에 두뇌를 포함 하 고 평행 블록 얼굴을 관심 영역으로는 톰의 블록 얼굴에 그것을 마운트. 얼굴은 톰의 블록 얼굴 쪽으로 두뇌의 pial 표면. 중요: 샘플 크기;에 따라 동결 온도 조정 높은 온도 단면, 하는 동안 더 나은 섹션 무결성을 보장 하지만 큰 섹션 필요 낮은 온도 균일 하 게 샘플을 동결.
   4. (느리고 균일 한 절삭 속도 섹션 최상의 결과) 필요한 두께에서 접선 뇌를 잘라.
4. 세척 통에 15 분 동안 샌드위치에 섹션.

비디오 1: 쥐 중간 entorhinal 외피 및 parasubicular 및 entorhinal 모듈의 레이아웃에서 접선 단면 구조 동영상. 설치류 두뇌의 중간 entorhinal 외피 외피의 뒤 끝에 위치 하 고 중간과 복 부 측으로 기울어져 있다. 접선 섹션이이 각도 따라 칼 동쪽으로 향하게 하 여 얻을 수 있습니다. 따라서, 적절 한 세포 유형 특정 얼룩 중간 entorhinal 외피와 인접 한 parasubiculum에서 모듈형 구조를 계시 한다. 비디오 레이 브레히트⁸에서 적응. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

4. 시 토 크롬 산화 효소 얼룩을 사용 하 여 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

참고: 다른 얼룩 프로토콜 웡 라일리¹⁷ 에 의해 먼저 예를 들면, 시 토 크롬 산화 효소 활동의 조직화 학적인 탐지에 대 한 개발 되었고 나중 수정 Divac 외. ¹⁸ 이 프로토콜 기반 Divac 외. 여 하나 ¹⁸, 니켈 염화 황산 염 (니 아 스)를 사용 하 여 이후 높은 명암과 얼룩진된 피 질 영역에서 잘 정의 된 모듈에 발생합니다.

1. 시 토 크롬 산화 효소 솔루션 얼룩을 준비 (참조 Divac 외. ¹⁸). 솔루션의 10 ml, 추가: 10 mL HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4), 400 mg 자당, 12.5 mg 니 아 스, 2 mg 시 토 크롬 C, 6 mg diaminobenzidine (한 덩어리).
   주의: DAB 및 니 아 스는 발암 성입니다.
   참고: 섹션의 부 화 직전 한 덩어리를 추가 합니다.
2. 15 분 동안 통에 HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.
3. 통에 실 온에서 착 솔루션에서 섹션을 품 어.
   참고:는 얼룩의 속도 관찰 합니다. 보이는 반응이 있는 경우에, 37 ° c.에 외피로 변경 정착의 양에 따라 얼룩이 지 관찰할 수 있습니다 또는 10 분 후 몇 시간에.
4. 4%를 추가 하 여 반응을 중지 PFA; 이렇게 하면 원하지 않는 다시 죽어가 고 배경 신호 증가.
5. 섹션 3 시간 10 분 동안 HEPES 버퍼를 사용 하 여 씻는 다.
6. 탑재 하 고 유리 슬라이드에 섹션을 건조.
7. 탈수는 증가 알콜 행 섹션:
   1. 워시 1 분 세척에 대 한 60% 에탄올에 슬라이드 슬라이드 80% 에탄올에 1 분 2 분 3 분 5 분 5 분 크 실 렌에 슬라이드를 씻어 한 소 프로 파 놀에 슬라이드 세척 한 100% 에탄올에 슬라이드 세척 한 96% 에탄올에 슬라이드 세척에 대 한.
8. 즉시 빠른 경화 설치 매체를 추가 하 고는 coverslip 추가. 중요: 사용 하지 마십시오 물 기반 설치 매체, 니 아 스 밖으로 세척 될 것 이다 하 고 저하는 얼룩.
9. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 섹션을 유지.

5. 대뇌 피 질의 모듈 Immunohistochemical 얼룩을 사용 하 여 시각화

참고: 여러 개의 프로토콜 immunohistochemistry, 표본 및 조사 유형의 최적화에 대 한 사용할 수 있습니다. 적응을 만들 수 있습니다 필요에 따라, 항 체, permeabilizing 에이전트 및 보육 시간 다양 한 농도 의해. 다음 프로토콜 형광 프로브에 의해 항 체 및 시각화의 넓은 범위를 검색 하 여 좋은 결과 이끌어 낸다.

1. 15 분 동안 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.
2. 선택 사항: 정체 (Jiao 외 에 따라 물 목욕을 사용 하는 epitope를 항 원 복구 수행 ¹⁹; 대체 참조 하십시오 Pileri 외. ²⁰)입니다.
   1. 80 ° c 물 목욕을 예 열 트라이-나트륨 시트르산 버퍼¹⁹ (pH 8.0)를 준비 하 고 80 ° c 물 목욕에 예 열
   2. 트라이-나트륨 시트르산 버퍼 섹션을 전송 합니다. 80 ° C에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어
   3. 차가운 실내 온도 아래로 섹션
   4. 15 분에 대 한 PBS에 섹션을 씻어.
3. PBS-X에 두 번 섹션을 세척 (0.5 %0.1 M PBS에 트리톤-X) 15 분.
4. 잠복기 2 h에 대 한 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 2.5%)과 트리톤-X (0.75%) PBS에 솔루션에서 섹션으로 불특정 epitopes를 차단 합니다.
5. 1 차적인 항 체, 예를 들어, Calbindin-D28k에에서 섹션을 품 어 (1:5, 000, PBS-X에 1 %BSA), 4 ° c.에 셰이 커에 2-3 일
   참고: 기본 항 체에 대 한 최적의 희석 사용 하는 특정 항 체에 따라 달라 집니다. 특정 항 체에 대 한 희석 기준을 제조 업체의 정보를 참조 하십시오. 여러 항 체 함께 사용 될 수 있다 그러나 다른 종에 대 한 발생 합니다.
6. 15 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 씻어.
7. 통에 4 ° C에서 이차 항 체 (1: 200, PBS에서 1 %BSA)에서 하룻밤 섹션을 품 어.
   참고: 여러 2 차 항 체 여러 기본 항 체 사용 되 면 다른 스펙트럼에서 사용할 수 있습니다.
8. 10 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 세척 하 여 이차 항 체를 씻어.
9. 탑재를 건조 한 유리에 대 한 섹션입니다.
   참고: 섹션 여전히는 coverslip 장착 전에 촉촉한 이어야 한다.
10. 조직 섹션에 형광 염료에 대 한 적합 한 설치 매체를 적용 하 고는 coverslip 적용.
11. 1 시간에 대 한 섹션을 건조.
12. 장기 저장용 coverslip 매니큐어를 사용 하 여 밀봉 하 고 4 ° c.에 어둠 속에서 계속

결과

우리 somatosensory 피 다양 한 두뇌, 대뇌 피 질의 평평된 섹션을 획득 하 고 그들을 다른 신체 부위를 나타내는 somatotopic 모듈을 시각화 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 대 한 처리. 이 비교 방법을 공부 진화 세력 그 모양 피 질, 예를 들어, 설치류 그리고 토끼목 배럴²¹ (그림 2)로 mystacial 털의 높은 보존된 표현을 보여주는 수 ...

토론

대뇌 피 질에서 모듈화는 다양 한 기법을 사용 하 여 확인 되었습니다. 어느 시각화 하 여 초기 연구는 일반적으로 식별 대뇌 피 질의 모듈 세포 밀도 영역 또는 섬유¹의 부재. 후속 메서드 수지상 번들²⁴, 특정 지역²⁵, afferents의 존재 또는 신경 전달 물질²⁶의 농축 활용 했습니다. 여기 두 가지 방법, (i) 시 토 크롬 산화 효소 histo...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochrome oxidase staining
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637
D(+)-Saccharose	Carl Roth	4621.1
Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	A1827
HEPES	Carl Roth	9105.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen retrieval
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909
Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Sodium chloride	Carl Roth	9265.1
Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate	Carl Roth	4984.3
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
TRITON-X 100	Carl Roth	3051.3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemistry
Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal	Swant	RRID: AB_10000347
Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal	Swant	RRID: AB_10000340
Albumin Fraction V, biotin free	Carl Roth	0163.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting or freezing media
Fluoromount (immunofluorescence)	Sigma-Aldrich	F4680
Eukitt (histochemistry)	Sigma-Aldrich	03989
Tissue freezing medium	Leica Biosystems	NC0696746
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol dehydration
Ethanol 100%	Carl Roth	9065.3
Ethanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Xylene substitute	Fluka	78475
Name	Company	Catalog Number	Comments
Devices/tools
Microm HM 650V	Thermo Scientific
Jung RM2035	Leica Biosystems
Dumont #55 Forceps - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00
Bone Shears - 24 cm	Fine Science Tools	16150-24
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14
Blunt Scissors	Fine Science Tools	14000-18
Surgical Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14101-14
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14001-13
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14094-11