Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model

Özet

Burada, yenidoğan (0 gün) farelerde karaciğer sol lob kısmi rezeksiyon için yeni bir yöntem mevcut. Bu yeni iletişim kuralı akut karaciğer hasarı ve yaralanma yanıt yenidoğan ortamda çalışmak için uygundur.

Özet

Morfolojik organ rejenerasyon akut doku kaybı aşağıdaki alt Omurgalılar arasında yaygındır, ama memeli postnatal hayatta nadiren görülmektedir. Yetişkin karaciğer rejenerasyonu % 70 kısmi hepatectomy sonra kalan loblar restorasyon metabolik aktivite, ama kalıcı kaybı yaralı lob'ın Morfoloji ve mimarisi ile bazı çoğaltması ile hepatosit hipertrofisi sonuçları. Burada, fizyolojik bir çevre rejenerasyon için elverişli bırakır kardiyolojik yeni bir cerrahi yöntem ayrıntılı. Bu model sol lob tepe ve bir sonraki muhafazakar yönetimi rejimi amputasyon içerir ve ligasyonu önemli karaciğer damarlarını veya kimyasal yaralanma, nerede rejenerasyon oluşabilir fizyolojik bir ortam bırakmak için gerekliliğini yoksun. Biz bu protokol sırasında yaralı karaciğer tarafından hipertrofisi için telafi edici büyüme organ rejenerasyon geçişler Juvenil (P7-14) fareler üzerinde ampütasyonlar için uzatmak. Sunulmuştur, kısa 30 dk protokolü yeniden oluşturma işlemi, memeliler yılında yaş ilişkili düşüş ve sözde hepatik kök veya ataları karakterizasyonu mekanizmaları incelemek için bir çerçeve sağlar.

Giriş

Bir organ yeniden veya form ve fonksiyon, geri yüklemek için yetenek çoğunlukla evrimsel zamanla kaybolur düşünülmektedir. Yetişkin memeli karaciğer akut kimyasal veya fiziksel yaralanma sonra yeniden üretim potansiyelini hipertrofisi dalgaları ve hücre bölünmesi, işlevsel bir ama kaynaklanan kaç tur sonuçlanan tüm kalan tetkikine seferberlik dahil tespit edilmiştir mimari farklı organ^1,2,3,4,5. Son zamanlarda, yaralanma yaşam^6,7,8ayının ilk haftası içinde rejeneratif cevaben yenidoğan memeli organların karakterize etmek çalışmalar başladı. Bu çalışmalar yenidoğan geliştirme sırasında yaralı zaman bazı memeli organlar yerine telafi edici büyüme veya fibrozis^7,8morfolojik yenilenme ile yanıt göstermiştir.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda genel yapısı ve işlevi rejenerasyon erken neonatal dönem^6,7,8sırasında oluştuğunu göstermiştir. Kimyasal yaralanma veya yönetim etanol^9,10,11, asetaminofen^{12,13,14,15 kurulan karaciğer hasarı protokolleri içerir} , karbon tetraklorür^16,17,18,19, % 70 kısmi hepatectomy^4,20,21veya sol kaldırılması ve medyan loblar. Kimyasal yönetim hepatosit hücre ölüme yol açar, ama genellikle mikro ve makro yapıları olduğu gibi bırakır. Genel olarak hepatik mimarisi değil oblitere gibi morfolojik rejenerasyon kolayca bu bağlamda okudu olamaz. % 70 kısmi hepatectomy dikiş tüp ligasyonu kanamayı durdurmak gerekli olan büyük gemilerin içerir ancak fizyolojik olmayan bir çevre damarlara kalıcı bozulma ile bırakır. Ayrıca, bu yöntem yalnızca yetişkin kemirgenler kullanılan ve yenidoğan bebeklerin onun uygulamaya Teknik olarak son derece zordur. Sol lob apeks 20-30 oranında bir yeni doğan P0 fare kaldırıldı bir yöntem bu düşünceyle geliştirdiğimiz (Şekil 1A-1B). Bu yöntem cerrahi olarak muhafazakar, minimal invaziv, teknik olarak zor ve morfoloji damarlara, rejenerasyon gerçekleşmesi için oda bırakarak ligasyonu olmadan kaybı brüt yol açar. Aşağıda açıklanan adım adım iletişim kuralı elde edilen herhangi bir araştırmacı bir kısmi lobular hepatectomy Doğum sonrası yaşam erken dönemlerinde memeli yenidoğan yenilenme eğitim için yenidoğan fareler üzerinde gerçekleştirmek izin verir. Gibi yaşamın daha sonraki evrelerinde karaciğerde kullanılabilmesi için bu yöntem aynı zamanda rejeneratif tıp ve kök hücre biyolojisi, karşılaştırmalı çalışmalar için açık uygulamaları var.

En yaygın akut karaciğer hasarı çalışmalar kimyasal kaynaklı hasar, Yetişkin karaciğer amputasyon veya % 70 kısmi hepatectomy vardır. Kimyasal hasar kez asetaminofen, karbon tetraklorür veya etanol intravenöz mayi veya sözlü yönetim içerir ve nispeten kolay ve non-invaziv yaralanma modelidir. Daha önce tartışılan, kimyasal zarar sonuçlarında hepatosit hücre ölümü, ama sık sık yaprakları stroma ve parankimi yapıları sağlam, morfolojik rejenerasyon hakkında iddiada zorlaştırır. Kimyasal zarar kez Hepatik damarları üzerinde mevcuttur ve hücre özgü yaralanma, eğitim için yararlı bir yöntem yapım merkezleri ancak aynı zamanda bütün organ düzeyinde, gemiler daha fazla--dan yer alan ve bu olabilir diğer nüfus sorgulamaya zorlaştırır yenilenmesine katkıda bulunur. Bu sınırlamaları rağmen kimyasal hasar hala bir fizyolojik açıdan son derece uygun ve faydalı yaralanma model kalır.

Yetişkin % 70 kısmi hepatectomy hepatik damarlara ligasyonu takip sol ve medyan loblar kaldırılmasını içerir. Hepatectomy cevaben de karakterize: uzvunu karaciğer 14 gün sonrası % 70 kısmi hepatectomy kalan sağ ve kaudat lob tetkikine özgün hasarsız lob bundan fena halde farklı bir mimari geliştirir hipertrofisi ve hücre bölünmesi^4,5birkaç tur tabi. Bu kayıp kitle ve fonksiyonu, yapar ama iki uzvunu loblar yeniden oluşturmak başarısız olur ve bu nedenle brüt morfoloji yerini almaz. Sonuç olarak, % 70 kısmi hepatectomy yaralanma yanıt telafi edici büyüme mekanizmaları sınırlı yenilenme ile çalışmak yararlıdır.

Burada, tam bir yenidoğan kısmi lobular hepatectomy için bir protokol açıklayın. Uygun hayvan seçimi ve hazırlık, cerrahi alan hazırlık, cerrahi ve kurtarma yordamı içerir. En iyi duruma getirme ve bu adımların her biri uyum Protokolü'nün farklı uygulamalar için gerekli olabilir.

Biz kapsamlı bir şekilde gerçekleştirilen ve bu protokol üzerinde vahşi türü C57BL/6J pups (JAX 000664) en iyi duruma getirilmiş, ancak, farklı hücre popülasyonlarının ve mekanizmaları rejenerasyon çalışmaya, ayrıca çeşitli Cre yataklık fareler de dahil olmak üzere çeşitli transjenik hayvanlar kullanılır ve CreERT2 transgenes ve/veya knock-ins (Axin2^CreERT2 JAX 018867, ve Sox9^CreERT2 JAX 018829) gibi gökkuşağı ve mTmG sistemleri (R26^VT2/GK3, floresan gazetecilere ile birlikte R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. sağkalım sonuçları ya da yeniden üretim potansiyeli yok farklılıkları tespit edildi gibi farklı fare suşları, bu yöntemi değiştirmek gerek yok bulduk.

Farklı hayvan suşları kullanmaya ek olarak, biz de kısmi lobular hepatectomies 4-hidroksi-Tamoksifen ve 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) gibi küçük moleküller ile tedavi yenidoğan fareler üzerinde yapılır. O Mısır yağı morbidite önemli bir sebebi bulundu gibi dimetil sülfoksit (DMSO) ve etanol solvent kullanılmıştır. Aksi takdirde küçük moleküllerin mayi yönetim hayatta kalma veya rejeneratif sonuç etkilemedi bulduk. Bu iletişim kuralı yeniden oluşturma işlemi, çeşitli açılardan sorguya çekmek için diğer küçük moleküller ile kullanmak için adapte olacağını tahmin ediyorum.

Yenidoğan fare cerrahi teknik olarak zor olabilir ve hayvan işleme ve mikroskobik diseksiyon özel uzmanlık gerektirebilir. Hayvancılık uzmanlığı anne yamyamlık önlemek için gerekli cerrahi ve acil kurtarma süresi boyunca.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri sıkı uygun olarak ileri değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakımı International (AAALAC) ve Stanford Üniversitesi'nin yönetim paneli üzerinde laboratuvar hayvanı Derneği tarafından belirlenen kuralları ile yapılmıştır Bakım (APLAC), (protokol numarası #10266) ve Amerika Birleşik Devletleri'nde veya Avrupa hayvan refah Yasası, yönergesi 2010/63/EU. Protokol devlet Bavyera, Almanya, hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Hayır izni aldı: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. hayvan hazırlık

1. Bir Isıtma yastık üzerinde uygun yatak takımları ile boş bir kafes hazırlayın.
2. Eldiven hayvanlarla dokunmadan önce annenin yatak eldiven üzerine sür.
3. Tüm pups onların anne ve yer boş kafesin içine çıkarın. Annenin yatak bazılarını kaldırın ve yavrular ile boş kafes yerleştirebilirsiniz.
4. Cerrahi alan uzak ayrı, temiz, Kuru bir kafeste annesi yerleştirin.
5. Cerrahi alan hazırlık önce Don yeni, temiz steril eldiven.

2. cerrahi alan hazırlık

1. 10 mL pipet kullanarak fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL 10 cm Petri kabına için ekleyin.
2. 2 mL betadin veya eşdeğer bir anti-septik çözeltisi içinde 10 cm Petri kabına pipet.
3. Parçalanmış bir kapsam cerrahi alana. Kapsam lamba dissekan açmak ve ışık için cerrahın konfor düzeyini ayarlamak. Bir yavru diseksiyon kapsam lamba altında cerrahi alanındaki yerleştirilebilir. Yeterli ışık gölgeler yavru fok ventral yüzeyinde yokluğunda tarafından onaylanabilir.
4. İsoflurane anestezi odası hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) burun konisi ile. Odası idrar veya dışkı kanıtı temizlenmelidir. Burun konisi ve ilişkili boru cerrahi alanındaki diseksiyon kapsam altına yerleştirin. Oksijen ve burun konisi için yalnızca isoflurane akışını başka yöne çek.
5. Yaklaşık olarak 37 ° C'de ayarla bir ısıtma yastığı ile ameliyat sonrası kurtarma alan hazırlamak Ameliyat sonrası kurtarma gazlı bez ısıtma yastığını üzerine yerleştirilen 4 adet oluşmalıdır. Mümkünse, gazlı bez yastıkları annenin yatak, dışkı ve idrar anne kokusu korumak için RUB'dir.
   Not: Bu sıcaklık kontrol etmek zor yapar gibi a ısı lamba kullanmak anlayacaksın. Ateşi yükselen yenidoğan fareler ölüme neden.
6. Hazırlamak ve bir otoklav ile tüm cerrahi aletler sterilize. Araçlarda: mikro diseksiyon makası, mikro-anatomi forseps, gazlı bez, hemostat ve herhangi bir 6-0 monofilament absorbe olmayan dikiş. Cerrahi aletler resterilzed herhangi bir cam boncuk ısıtıcı ile olabilir.

3. kısmi Lobular Hepatectomy

1. Yavru fok onun geri ve yavaşça onun ayak ve ellerde yer çekimi üzerinde burun konisi yerleştirerek anestezi. Yavru köpek-meli var olmak almak %5 isoflurane oksijen.
   1. Bir ayak çimdik testi tarafından doğrulanabilir 5 dk ya kadar yeterli anestezi, oturup yavru izin.
   2. 5 mg/kg carprofen subkutan kesi önce enjekte.
      Not: 30 dk Poorer çıktıları üzerinde 30 dk için genel anestezi altında olan yenidoğanlarda gözlenen daha tüm ameliyat uzun sürmeyecektir. Cerrahi kapsamlı alan hazırlık ile uzunluğu ve ıslatma kapatma önce deri dikiş indüklenen deri gözyaşı en aza indirmek için en aza indirmek önlemler alın.
2. Yavaşça posterior abdominal duvardan betadin ile ıslak bir küçük gazlı bez yastık ile temizleyin. 1 dakika kurumaya betadin izin.
3. Göğüs kafesi altındaki sol orta klavikular 0.5 cm kesi mikro diseksiyon makası ve forseps ile olun. Yavaşça deri forseps kullanarak ayırın ve ikinci bir daha derin kesik periton boşluğuna (bkz: Şekil 1 c, sol ve merkez) yapmak
4. Yavaşça sol lob dışında peritoneal kavite apeks zorlamak için sırt, künt biter mikro diseksiyon makası ve forseps kullanarak karın her iki taraftan lateral basınç uygulayın. Sol lob sol apeks-meli var olmak kolayca görüntülenmeyecektir (Şekil 1 c, sağ).
5. Tepe, kesmek ve kaldırılacak doku miktarını tartın.
   1. Mikro-diseksiyon makası kullanarak, yavaşça sol lob apeks dokudan istenilen miktarda kesmek.
   2. PBS ile dolu bir 1.5 mL tüp takma doku yerleştirin. Bir analitik denge kullanarak uzvunu doku tartmak ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: bir parça gazlı bez ya da kağıt üzerinde denge yer ve o Dara. O zaman uzvunu doku gazlı bez veya kağıt üzerine yerleştirin ve kütlesi ölçün.
   3. % 2 paraformaldehyde 1 h için oda sıcaklığında uzvunu alanında ve yer üzerinde kuru buz dondurulmuş bölüm analizi için en uygun kesme sıcaklığında (OCT) bileşik düzeltmek. Herhangi bir standart cryostat kullanma kesme 7-10 µm bölümlerine göre dondurulmuş bölümler analiz.
6. Gazlı bez rulo bir parça kullanılarak, yavaşça sol lob periton boşluğuna değiştirin. Gazlı bez boşluğunda kanama durur kadar bırakın.
7. Gazlı bez çıkarın ve cerrahi sitesi ve çevresini PBS ile ıslatılmış gazlı bez ile ıslak.
8. 6-0 monofilament ile cerrahi sitesi, bir çalışan dikiş ile absorbe olmayan dikiş yakın. Karın zarını ve cilt ayrı olarak kapatılması gerekir.
   Not: Hafifçe PBS ile ıslatılmış gazlı bez ile deri ıslatma indüklenen dikiş gözyaşları en aza indirmek.
9. Yavaşça ama iyice yavru fok PBS ile ıslatılmış gazlı bez ile temizleyin ve hiçbir kan veya betadin kalır emin olun. Batırılmış gazlı bez pad rulo ve herhangi bir kan veya betadin temiz yara işareti üzerine hafifçe fırçalayın.
   Not: Bu özellikle yetersiz temizlenir Eğer anne belgili tanımlık pups parçaladık kadar önemli olduğunu.
10. Yavru fok burun konisi çıkarın ve annenin dışkı ve idrar maruz gazlı bez yastıkları içerir kurtarma alanında yerleştirin. Bir kez yavru fok kurtarır, boş kafeste yavru anne yatak ile değiştirin.
    Not: a ısı lamba kullanmayın. A ısı lamba kullanımını kardiyolojik aşırı ısınmasına neden olabilir.
11. Yavrular için istediğiniz sayıyı yordamı yineleyin. Tüm pups kullanılabilmesine rağmen genellikle birkaç pups ile birlikte çalışan pups değiştirilmesi için ameliyat değil bırakmak tavsiye edilir.
12. Tüm pups aynı anda annesinin yatak anne kafeste değiştirin.

4. kurtarma ve analiz

1. Fareler üzerinde her gün takip etmek.
   1. Yara kapalı kalır denetleyin ve herhangi bir ölü yavru varsa kaldırın.
   2. Yara yeniden açar, cerrahi sitesi ve kurtarma alanında daha önce açıklanan ve tekrar adımları 3,8-3.12 hazırlamanız.
   3. 5 mg/kg carpofen subkutan 24 ve 48 h aşağıdaki yordamı enjekte.
   4. Pups 56 gün veya daha uzun süre izleyin.
2. Hayvanlar ameliyat sonrası gün istenilen miktarda sonra karbondioksit (CO₂) maruz kalma ve servikal çıkığı tarafından ötenazi.
   1. İndüksiyon fareler koyun / ötenazi odası ve fareler kadar CO₂ açmak stop nefes.
   2. Ötenazi servikal çıkığı tarafından emin olun. Ön-parmak ve başparmak kullanarak fare dorsal boynunda basın ve diğer el kullanarak, kuyruk üzerinde açılan menüden.
3. Tüm karaciğer en bloc kaldırmak ve tartmak.
   1. Dikkatle her lob ayırmak ve ayrı ayrı tartmak.
      Not: karaciğer tarafından diyafram ve hepatik ve portal damarları dikkatli diseksiyon kaldırın. Loblar birbirinden dikkatle her lob proksimal onun eki, anatomi tarafından ayırın.
4. Rejenerasyon ölçüde uzvunu sol lobda kitle bütün karaciğer ayine karşılaştırarak belirle. Zarar görmemiş bir sol lob bütün karaciğer yaklaşık % 30'dur.

Sonuçlar

Şekil 1A yenidoğan kısmi lobular hepatectomy ( Şekil 1Badımında şematik) genel bir zaman çizelgesi ve rejenerasyon gözlenen beklemek beklenen süreyi ayrıntıları. Sol lob ince rejenerasyon gözlenen 7-14 gün sonrası cerrahi olabilir. Sonra 56 gün ameliyat sonrası tam rejenerasyon kez gözlendi. Fareler fizyolojik anormallik belirtisi yok ameliyattan sonra göstermelidir.

Tartışmalar

Akut karaciğer hasarı geleneksel kimyasal (asetaminofen, etanol, karbon tetraklorür) ya da cerrahi modelleri (% 70 kısmi hepatectomy) kullanarak çalışılmıştır. Rejeneratif yanıt % 70 kısmi hepatectomy sonra küresel hepatosit hipertrofisi ve hücre bölünmesi^4,5birden fazla mermi dahil etmek ile karakterizedir. Büyük damarları rejenerasyon için anormal bir ortam bırakarak bakmaksızın gerekir gibi kanama durdurmak için ancak, bu model sınır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730