Murino salivar avaliação funcional através de pilocarpina estimulação seguinte fracionada de radiação

Resumo

Apresentamos uma abordagem detalhada para realizar coleta de saliva, incluindo murino traqueostomia e o isolamento dos três glândulas salivares maiores.

Resumo

Hipossalivação é comumente observada na reação auto-imune da síndrome de Sjögren ou seguir lesão de radiação para as glândulas salivares maiores. Nestes casos, perguntas permanecem sobre a patogênese da doença e de intervenções eficazes. A técnica otimizada que permite a avaliação funcional das glândulas salivares é inestimável para investigação terapêutica, disfunção e biologia de glândula exócrina. Aqui, apresentamos uma abordagem passo a passo para executar pilocarpina estimulou a secreção de saliva, incluindo a traqueostomia e a dissecação das três principais murino glândulas salivares. Também detalhamos a anatomia cabeça e pescoço murino apropriada acessada durante estas técnicas. Esta abordagem é escalável, permitindo vários mouses para serem processados simultaneamente, melhorando assim a eficiência do fluxo de trabalho. Nosso objetivo é melhorar a reprodutibilidade destes métodos, cada qual tem mais aplicativos dentro do campo. Além da recolha de saliva, discutimos métricas para quantificar e normalizando a capacidade funcional desses tecidos. Dados representativos são incluídos a partir de glândulas submandibulares com função deprimida glândula salivar 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de 6.85 Gy).

Introdução

Distúrbios da glândula salivar incluem síndromes de desregulação ou secreção prejudicada, levando a subprodução (xerostomia e hipossalivação) de saliva¹ou superprodução (sialorrhea). Em ambos os casos, há interesse em melhorar a nossa compreensão da biologia da glândula salivar com o objectivo final de desenvolvimento terapêutico².

As glândulas salivares são órgãos altamente radiosensitive e muitas vezes são danificadas durante a radioterapia de câncer de cabeça e pescoço, levando a permanente boca seca (xerostomia)^3,4. Ao contrário de outros tecidos radiosensitive, no entanto, a taxa de rotatividade das glândulas salivares é relativamente baixa, e o mecanismo de perda secretora é mal compreendido^5,6. Neste cenário de lesão única, estratégias de regeneração e protecção contra as radiações de tecido requerem avaliação funcional salivar. Experimentalmente, coleta de saliva murino é uma ferramenta particularmente valiosa em avaliar a resposta de glândula a radiação e agentes terapêuticos.

Aqui, apresentamos um método para executar e quantificar a secreção de saliva estimulada usando pilocarpine, um potente agonista muscarínico⁷. Pilocarpina estimula o sistema nervoso autônomo para induzir a secreção de glândula^8,9. Para completar este teste apropriadamente, uma traqueostomia é necessária para garantir que o rato mantém uma via aérea patente durante todo o procedimento e para reduzir os riscos de asfixia e aspiração de secreções em pool na cavidade oral¹⁰.

Este é um procedimento terminal, culminando na remoção de uma das três principais glândulas salivares: as parótidas (PG), a submandibular (SMG) e a sublingual (SLG). Para estudos funcionais, glândula pesos são registados e são frequentemente usados para normalizar a saliva medição^11,12,13. Este dados são particularmente importantes em estudos de radiação, em que a atrofia da glândula é um resultado esperado^14,15

Há variabilidade na literatura em relação à secreção de saliva como estimulada é executada e relatou¹⁶. Por exemplo, doses de pilocarpina dentro da literatura extensão pelo menos três ordens de magnitude^{17,18,19,20,21,22,23}. Aqui, apresentamos um protocolo de pilocarpina otimizada de alta dose com a intenção de melhor reprodutibilidade na execução do método, bem como fornecendo uma plataforma modular de técnicas (traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula) que pode ser adaptado como precisava.

Além de demonstração de protocolo, incluímos dados funcionais representativos do fluxo de saliva em 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de Gy 6.85) para a região SMG.

Protocolo

Todos na vivo os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pela Comissão Universidade recursos animais na Universidade de Rochester, Rochester. NY.

1. preparação

1. Usando uma balança analítica, pese 20 mg de pilocarpina. Dissolvê-lo em 2 mL de solução salina estéril em um tubo de microcentrifugadora.
   Nota: Porque pilocarpina é sensível à luz e perde atividade ao longo do tempo, esta solução deve ser preparada no dia da injeção e protegida da luz até administrado.
2. Usando uma balança analítica, pesar e identificar todos os tubos de coleção e capilares de vidro. O número de tubos de coleção e capilares de vidro deve corresponder ao número de ratos.

2. traqueostomia

1. Pese de camundongos C57/BL6 usando uma balança analítica.
2. Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", anestesia os ratos com uma solução salina estéril intraperitonealmente injetado de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Prossiga para a etapa seguinte quando o mouse não responde mais aos estímulos (ou seja, ausência do reflexo de retirada de pedal), que geralmente ocorre dentro de 5 a 10 min após a injeção.
3. Depois da preparação de lubrificante em um aplicador com ponta de algodão, delicadamente aplicam-se aos olhos e posicione o mouse em uma posição supina no palco. O animal anestesiado deve ser mantido na superfície quente.
   Nota: Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente.
4. Proteger o nariz, os membros e cauda no palco usando fita cirúrgica.
5. Limpar e molhar a garganta com uma compressa com álcool.
   Nota: Isto vai ajudar a impedir a entrada de incisões subsequentes de peles.
6. Levantar a pele do pescoço na linha média ventral com fórceps, fazer um corte pequeno, superficial, usando tesouras de dissecação. Orientar a tesoura na abertura e abra lentamente as lâminas por via subcutânea para separar tecido aviões.
7. Mantendo a pele levantada, cuidadosamente, corte 1 cm abaixo da boca.
8. Faça duas incisões laterais em aspectos inferiores e superiores do primeiro corte. Usando fórceps, delicadamente afastado refletem a pele para permitir o acesso a estruturas de cabeça e pescoço.
9. Usando o microscópio de dissecação na ampliação de X 8, Visualizar as glândulas submandibulares (mediana: Figura 1).
10. Usando a pinça fina, levante suavemente as glândulas para expor os quatro músculos infra-hioideos (cinta) sobrejacente a traqueia. Evite rasgar ou interromper a vasculatura circundante ou ductos excretores.
11. Se a coleta de saliva de mais de um rato, repita passos 2.1-2.10 com cada rato antes de continuar.
    Nota: Este procedimento pode ser realizado com segurança em até 5 ratos simultaneamente.
12. Com tesouras pequenas de dissecação, remova a porção medial dos músculos enquanto permanecer tão próximo quanto possível na linha mediana. Só corte quanto for necessário para visualizar a traqueia e manter músculos fora do caminho durante o procedimento. Evite roubar qualquer navios nas proximidades, porque se houver depleção de volume secundário a hemorragia significativa, a pilocarpina não será eficaz na indução de secreção.
13. Refletem os músculos da cinta da traqueia.
14. Visualize a laringe, traqueia e glândula tireoide. Certifique-se de que a traqueia é clara de sobrejacente tecido.
15. Faça uma incisão horizontal na traqueia inferior/posterior a tireoide usando tesouras pequenas de dissecação. Certifique-se de que as vias aéreas é patente e clara de fluido.

3. saliva coleção

1. Remova a fita perto palco de dissecação boca e ângulo para baixo (45°, cranialmente) para ajudar com o fluxo de saliva.
2. Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", execute a injeção intraperitoneal de 10 pilocarpina de peso de corpo µ l/g para uma dose total de 100 mg/kg.
3. Inicie um timer. Se vários mouses de dosagem, reduza o tempo de chumbo movendo-se rapidamente e por ter um assistente injetar simultaneamente os ratos restantes.
4. Usando pinças padrão, abra a boca para acesso de tubo capilar.
5. Depois de observa-se uma gota de saliva na boca, coloca a extremidade proximal do tubo capilar no fluido, com a extremidade distal, colocada em um tubo de coletando posicionado abaixo do palco dissecação (ambos os tubos pre-pesados).
   Nota: Em ratos fêmeas C57/BL6 6-10 semanas de idade, salivação bruta ocorre dentro de 2 min de injeção de pilocarpina.
6. Se saliva está construindo na boca, mas não flui através do tubo, tente novamente o passo anterior. Certifique-se de que o tubo não é colocado diretamente contra uma superfície da mucosa, que pode obstruir a entrada.
7. Colete a saliva para um total de 12 min após estimulação de pilocarpina. Garantir que o estoma permanece claro.
   Nota: Aumento do volume tidal e secreções (salivares, urinárias, fecais) são normais durante este tempo.
8. Se os ratos têm deprimido função de saliva (ex., devido a lesão ou a intervenção), transfira o líquido restante da boca para o tubo de coleta usando uma micropipeta P200. Se a recolha de vários mouses, certifique-se de que as dicas são alteradas.
9. Registro do peso da saliva coletada mais tubos de 12 min após a injeção de pilocarpina.

4. a glândula dissecação

1. Eutanásia em ratos pela eutanásia de CO₂ (conforme descrito nas orientações AVMA para eutanásia de animais: edição de 2013) seguido por toracotomia, tendo o cuidado de preservar as estruturas da cabeça e do pescoço. Por esta razão, evite deslocamento cervical como um método de eutanásia.
2. Coloque o mouse em uma posição supina no palco. Reposicione as glândulas no site original sobre a traqueia (Figura 1).
3. Usando um microscópio dissecação sob magnificação de X 8, Visualizar as glândulas maiores: o PG, SMG e SLG. Para distinguir as glândulas durante a dissecção, identifica que o PG é difuso, lateral para a SMG e SLG a mentir.
   Nota: Se a dissecar o PG, isto deve ser feito primeiro porque é o menos definidas e mais susceptível de ser rasgado.
4. Agarrar a cauda do PG com fórceps, puxando-o longe de estruturas subjacentes e aplicar suavemente a tensão antes de cortar a cabeça do PG com tesoura de dissecação.
5. Ruptura da cápsula que rodeia os SMGs usando fórceps. Separe delicadamente SMG a torto e a direito.
6. Livre o dorso da SMG de tecido nonglandular aderido, usando fórceps.
7. Remova o SMG do pescoço pelo ducto de Wharton tenso de desenho com fórceps e cortar o duto com tesoura de dissecação.
8. Suavemente separa o SLG a SMG usando fórceps.
   Nota: A SIG é o aspecto súpero a SMG.
9. Usando uma balança analítica, pesos registros de SMG.

Resultados

Quando realizar pilocarpina dose alta estimulada coleta de saliva, é importante manter as vias aéreas para evitar aspiração ou asfixia de secreções na cavidade oral. Um esquema da traqueostomia é fornecido (Figura 1). Após incisão traqueal, o estoma deve ficar claro de tecidos e fluidos.

Para aprimorar a ação capilar durante a coleta de saliva, ratos devem ser posicionados de cabeça para...

Discussão

Apresentamos um método várias etapas para avaliar a função de glândula salivar, que pode ser aplicada para estudar terapêutica e lesão da glândula. Nosso procedimento envolve a traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula, cada qual com aplicações experimentais que podem suportar um estudo integrado da biologia de glândula salivar. Por exemplo, traqueostomia murino tem sido usada para gestão geral das vias respiratórias durante os procedimentos de obstruir a cavidade oral.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pilocarpine hydrochloride	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-9	Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline Solution	Medline	RDI30296H	Saline
Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Curved Forceps
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Straight Forceps
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12	Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes	Fisher Scientific	22362566	Capillary tubes
Lubricant Eye Ointment	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	Statistical Software
Cotton tipped applicator	Medline	MDS202000	Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"	BD	7629	Syringe for intraperitoneal injection