Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.

Abstract

La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l'host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un'infezione, anche quando l'agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell'agente patogeno. I campioni raccolti dopo l'infezione possa essere elaborato per l'estrazione di RNA.

Introduzione

Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l'habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato¹. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello².

Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di persone immunocompromised, cioè, pazienti HIV-positivi e pazienti che sono passati attraverso la chemioterapia o farmaci immunosoppressori dopo trapianto³. In uno studio di sorveglianza effettuato negli Stati Uniti, Wisplinghoff et al hanno mostrato che il 9,5% delle infezioni nosocomiali flusso sanguigno erano causati da Candida specie⁴. Dovuto il caso aumentato di infezioni fungine e soprattutto per l'elevata percentuale di specie di Candida trovate durante infezioni del torrente sanguigno, capire come questo agente patogeno sfugge al controllo del sistema immunitario è estremamente importante.

C. albicans è un fungo dimorphic che cresce in diverse forme morfologiche come lievito, blastospores, pseudoife ed ife a seconda le condizioni ambientali⁵. Nella sua forma ifale, albicans del c. dimostra la sua capacità di invasività più alto e ha la capacità di penetrare l' epitelio⁶.

Infezioni da c. albicans sono stati studiati utilizzando diversi approcci sperimentali. Il modello più comune di infezione è l'iniezione endovenosa di c. albicans lievito⁷. Tuttavia, questo modello non prendere in considerazione tutti i processi che accadono prima il fungo riesce a diffondersi nel flusso sanguigno. Un altro modello sfrutta la capacità dei albicans del c. di invadere l'epitelio. Questo metodo, noto anche come la carta vetrata modello⁸, è stato sviluppato da Gaspari, et al. , 1998,⁹e consiste nell'usare la carta vetrata per abradere la pelle, eliminando così lo strato corneo prima di applicare i albicans del c.. Questa procedura permette al fungo di penetrare l'epitelio, consentendo così l'analisi delle capacità invasiva di questo agente patogeno. Infine, altri modelli di infezioni per la gastrointestinale¹⁰ e respiratorie¹¹ sono stati utilizzati in diversi studi.

La formazione di una ferita (come nel modello di carta vetrata) provoca l'attivazione di parecchie vie, compreso il reclutamento delle cellule immuni e attivazione, al fine di promuovere la guarigione di processo¹². Questo può alterare o mascherare la risposta immunitaria in particolare contro l'agente patogeno, così conducendo alla confusione risultati.

Qui descriviamo un metodo di infezione della pelle che evita la formazione di ferita iniziale e l'induzione di un ambiente infiammatorio basale. Per mantenere la struttura epiteliale intatta, iniettiamo direttamente albicans del c. nella sua forma ifale nel derma profondo. Anche se una singola iniezione può suscitare lieve infiammazione, la quantità di infiammazione è limitata e limitata rispetto alla formazione di una ferita aperta come nel modello di carta vetrata. L'approccio che descriviamo qui permette lo studio della risposta immunitaria all'infezione fungina e diffusione, evitando l'ambiente infiammatoria eccessiva e preesistente causata da danni meccanici.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate sotto l'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e operate sotto la supervisione del dipartimento di risorse animali ai bambini dell'ospedale (arco) al Children Hospital di Boston o sono stati approvati dall'italiano Ministero della salute e realizzata sotto il Comitato istituzionale di Animal Care presso l'Università di Milano-Bicocca.

1. preparazione di albicans del c.

1. Cultura C. albicans, ceppo CAF3-1¹³, in provette contenenti medium ricco (lievito estratto peptone destrosio (YEPD), Estratto di lievito 1% (p/v), 2% (p/v) di Bacto Peptone, 2% (p/v) di glucosio) completate con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. In queste condizioni, albicans del c. si sviluppa come un lievito.
   Nota: Altri ceppi di c. albicans possono essere utilizzati, come la clinica isolare c. albicans SC5314 ceppo¹³. Dal momento che recentemente abbiamo dimostrato che il processo ulceroso è indotta dall'attivazione del sistema immunitario innato¹⁴, teoricamente ogni ceppo di c. albicans che mantiene le sue componenti della parete cellulare e la struttura, così come il capacità di produrre proiezioni ifale, potrebbe essere utilizzato.
2. Monitorare la cultura contando la concentrazione cellulare utilizzando un analizzatore di contatore delle cellule.
3. Raccogliere la cultura quando raggiunge una concentrazione di circa 8 x 10⁶ cellule/mL. In alternativa, è possibile utilizzare uno spettrofotometro per misurare il OD₆₀₀.
   Nota: Di solito, un valore di OD₆₀₀ = 1 corrisponde ad una concentrazione di lievito di 3 x 10⁷ cellule/mL, ma si raccomanda una titolazione.
4. Risospendere la cultura nel mezzo YEPD-uridina, utilizzando HEPES (50 mM, pH 7.5) come agente tampone e incubare la coltura a 37 ° C per indurre la formazione di ife. Verifica ifale formazione sotto un microscopio a 100 ingrandimenti. Formazione ifale è visibile 5 h dopo la coltura a 37 ° C; Tuttavia, utilizzare le celle 16 h dopo incubazione a 37 ° C quando la percentuale ifale raggiunge quasi il 95% della coltura totale.
5. Per arricchire ulteriormente la preparazione in concentrazione ifale, centrifuga aliquote della cultura a 3.300 x g per 5 min. eliminare il supernatante e risospendere il pellet in PBS sterile ad una concentrazione di 1 x 10⁸ IFE/mL.

2. cutanea profonda iniezione

1. 24 h prima della procedura di infezione, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e poi radere il fianco dei topi utilizzare un tagliacapelli elettrico.
   Nota: Dopo qualsiasi procedura che coinvolge l'anestesia, posizionare i topi sotto una lampada di riscaldamento fino a quando non hanno recuperato in modo efficiente.
2. Riposare i topi per 24 h evitare qualsiasi infiammazione dovuto il processo di rasatura.
3. 24 h dopo la procedura di rasatura, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
4. Controllare il riflesso di zampa per garantire che i topi sono anestetizzati. Valutare il riflesso di zampa pinzando saldamente la zampa. Se l'anestesia è raggiunto, l'animale non sente dolore e non si muove.
5. Iniettare albicans del c. IFE nel derma profondo utilizzando una siringa da insulina 0,3 mL con un ago di 30 x 8 mm in un volume finale di 50 µ l/iniezione, corrispondente a 5 x 10⁶ IFE/iniezione.
   1. Tendere la pelle del fianco rasato utilizzando due dita al fine di iniettare il volume direttamente nel derma profondo. Inserire l'ago con un angolo di 10-15° con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.
   2. Con questa angolazione, l'agente patogeno sarà iniettato con una profondità di circa 300-500 µm. Per garantire che l'iniezione è ben eseguita, verificare che la forma volume iniettato un bump che è assorbita qualche min dopo l'iniezione.
      Nota: L'urto formata dopo l'iniezione sarà di circa 1 cm². Questa è l'area che verrà rimosso al punto di tempo designato per l'analisi molecolare o istologica.
   3. Per intervalli di tempo di meno di 24 h (consigliato) è possibile delimitare la zona di infezione con un pennarello, poiché l'urto formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti, dopo di che viene assorbito. Per intervalli di tempo di 24 ore o più, questo passaggio non è necessario, perché o un'ulcera o una ciste sarà chiaramente visibile.

3. raccolta e preparazione per colorazione istologica del campione

1. Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali.
2. Utilizzando pinze chirurgiche, tirare la pelle al confine del sito iniettato, precedentemente contrassegnato con il pennarello. Utilizzando le forbici chirurgiche, accise sul sito infetto dal taglio di pelle che segue la linea tracciata.
   Nota: Fare attenzione a separare la pelle dal peritoneum usando le forbici punta rotonda.
3. Immergere la pelle in uno stampo di base USA e getta riempito con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto, con il lato interno della pelle rivolto verso l'alto. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciate che l'azoto liquido coprire il campione prima di esso è completamente congelato come questo danneggerebbe il campione.
   Nota: attenzione! Durante la fase 3.3, indossare una maschera facciale per la protezione da azoto liquido.
4. Se gli esempi non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione del vetrino, memorizzarle rapidamente a-80 ° C.
   Nota: Campioni possono essere conservati a-80 ° C a tempo indeterminato.

4. preparazione dei vetrini

1. Tagliare il campione a metà per preparare le fettine per istologia a partire dal centro del campione.
2. Tagliare fette spesse 5-µm con un criostato.
   Nota: Per campioni di pelle, la temperatura del criostato deve non essere supera a-25 ° C. Un' più alta temperatura causerebbe una fusione parziale di H-personalizzazione e pertanto i campioni sarebbero non essere mantenuti nella giusta posizione durante la procedura di taglio.
3. Utilizzare vetrini caricati positivamente per raccogliere le fette.
4. Se le fette raccolte non vengono utilizzate subito dopo la preparazione, li conservare a-20 ° C. A questo punto, fette possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.

5. ematossilina ed eosina

1. Macchia le diapositive mediante immersione in ematossilina di Gill per 4 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
2. Macchia che le diapositive mediante immersione in soluzione di eosina Y per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min, sciacquare le diapositive utilizzando acqua distillata prima di continuare il protocollo.
3. Disidratare mediante immersione in aumento in serie delle concentrazioni delle soluzioni di etanolo (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Immergere i vetrini per 15 s in ogni soluzione di etanolo.
4. Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.
5. Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.
6. Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio a un ingrandimento 40x.

6. acido periodico di Schiff (PAS) colorazione

1. Difficoltà le diapositive con ≥ 99.5% acetone a temperatura ambiente per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 1 min.
2. Macchia le diapositive mediante immersione in soluzione di acido periodico (1 g/dL) per 5 min, lavare i vetrini in 3 cambi di acqua distillata.
3. Macchia le diapositive per immersione nel reattivo di Schiff per 15 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
4. Colorare i vetrini mediante immersione in ematossilina di Gill per 5 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 30 s.
5. Disidratare i vetrini mediante immersione in 3 cambi di etanolo al 100%. Immergere i vetrini per 15 s ogni volta.
6. Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.
7. Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.
8. Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio.

7. raccolta e preparazione per estrazione del RNA del campione

1. Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali. Rimuovere i campioni di pelle come descritto al punto 3.2.
2. Immergere i campioni in una provetta da 2 mL-salvapercussore con 1 mL di reagente per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a-80 ° C.
3. Tagliare il campione in pezzi di circa 0,2 cm² utilizzando pinze chirurgiche.
   Nota: attenzione! La maggior parte dei reagenti per isolamento del RNA sono tossiche e mutagene. Punti 7.3 e 7.4 deve essere fatto sotto una cappa aspirante.
4. Smash il campione con un laminatoio del branello ad una velocità di 20 oscillazioni/s per 20 min. in alternativa, un vasaio meccanico possa essere utilizzato.
5. Controllare l'effettiva omogeneizzazione dei campioni cercando la presenza di parti intatte della pelle. Ripetere questo passaggio se i campioni non sono completamente omogeneizzati.
6. Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 1 min. tenere i surnatanti estrazione del RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero bloccare le colonne di estrazione.
7. Procedere con l'estrazione di RNA mediante RNA purificazione colonne¹⁴.
8. Utilizzare uno spettrofotometro per valutare la concentrazione e purificazione di RNA. Se RNA estratti non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione di cDNA, conservare i campioni a-80 ° C.

Risultati

Attraverso l'iniezione dell'agente patogeno direttamente nel derma profondo, la morfologia strutturale del tessuto rimane intatto (Figura 1A).

Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle permette la rilevazione delle cellule immuni e loro localizzazione presso il sito di infezione. Il maggiore ingrandimento mostrato in Figura 1B rivela che l'ascesso si compo...

Discussione

Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.

Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione¹⁵, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l'analisi di specifici immune cellule che partecipano per contene...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998