Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Summary

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Abstract

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten en kinaseenzym van naar schatting 8-13% van de Proteoom; het aantal vastgestelde doelstellingen voor Cdk1, met name in menselijke cellen is echter nog steeds laag. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, aangezien zij mechanistische inzicht verwerven in hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Celcyclus verordening is essentieel voor trouwe chromosoom segregatie en gebreken in dit ingewikkelde proces leiden tot chromosoomafwijkingen en kanker.

Hier beschrijven we een in vitro kinase test die wordt gebruikt voor het identificeren van Cdk1-specifieke fosforylatie sites. In deze test, is een gezuiverde eiwit gefosforyleerd in vitro door commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B. Successful fosforylatie wordt bevestigd door SDS-PAGE en fosforylering sites worden vervolgens geïdentificeerd door massaspectrometrie. Ook beschrijven we zuivering protocollen die opbrengst zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase-bepaling en een bindende bepaling voor de functionele verificatie van de geïdentificeerde fosforylatie sites, die de interactie tussen probes een klassieke nucleaire localisatie signaal (cNLS) en haar nucleair vervoer receptor karyopherin α. Om te helpen met de proefopzet, bekijken we methoden voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites uit proteïne sequenties. Deze protocollen presenteren samen een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk organisme en opbrengsten betrouwbaar modelresultaten, vooral wanneer gecombineerd met functionele studies van de cel.

Introduction

Kinases zijn enzymen die overdracht van fosfaat groepen van ATP op substraten en veel cellulaire processen regelen. Deze fosforylatie is omkeerbaar, snel, voegt twee negatieve ladingen, vrije energie worden opgeslagen en is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties gebruikt door cellen. Cdk1, die ook bekend staat als celdeling cyclus eiwit 2 homolog (cdc2) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten^1,2,3,4,5, en kinaseenzym een naar schatting 8-13% van de Proteoom

Protocol

1. de voorspelling van fosforylering van de Cdk1-specifieke Sites van de eiwit-volgorde

1. Voordat u begint de kinase-bepaling, de volgorde van de eiwitten voor voorspelde Cdk1-specifieke fosforylatie sites analyseren en de literatuur voor experimenteel gevestigde fosforylatie sites zoeken met onbekende kinase specificiteit. Gebruik de volgende hulpmiddelen, databases en verwijzingen die worden samengevat.
   1. De BGA 3.0 software^36,37 (http://gps.biocu.......

Discussion

Onze kinase in vitro assay is een zeer krachtige methode om het identificeren van moleculaire targets voor de kinase Cdk1, die een hoofdbesturing van de celcyclus en regelt veel belangrijke cellulaire processen. De methode wordt bepaald of een gezuiverde proteïne een substraat voor Cdk1 is en identificatie van specifieke fosforylatie sites kunt. Dit vergemakkelijkt het mechanistische studies voor de regulatie van cellulaire processen door fosforylering via Cdk1.

De meest kritische fa.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778