Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Summary

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Abstract

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é um controlador mestre para o ciclo celular em todos os eucariontes e fosforila um estimado 8-13% da proteoma; no entanto, o número de destinos identificados para Cdk1, particularmente em células humanas ainda é baixo. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como eles fornecem mecanicistas insights sobre como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é essencial para a segregação do cromossomo fiel, e defeitos neste processo complicado levam a aberrações cromossômicas e câncer.

Aqui, descrevemos um em vitro quinase que é usado para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, uma proteína purificada é fosforilada em vitro por comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B. bem sucedido fosforilação é confirmada por SDS-PAGE, e locais de fosforilação são posteriormente identificados por espectrometria de massa. Descrevemos também protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase e um ensaio para a verificação funcional dos sítios identificados fosforilação, que explora a interação entre um sinal de localização nuclear clássica (cNLS) e seu transporte nuclear receptor carioferinas α. Para ajudar com delineamento experimental, revemos abordagens para predição de sítios de fosforilação Cdk1 específicas de sequências de proteínas. Juntos esses protocolos apresentam uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a qualquer modelo organismo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinado com estudos funcionais de célula.

Introduction

As cinases são enzimas que tranferem grupos fosfato do ATP para substratos e regulam muitos processos celulares. Esta fosforilação é reversível, rápido, adiciona duas cargas negativas e armazena energia livre e é uma das modificações posttranslational mais comuns usadas pelas células. Cdk1, que é também conhecido como o homólogo de proteína 2 de ciclo de divisão celular (cdc2) é um controlador mestre do ciclo celular em todos os eucariontes^1,2,3,4,5e fosforila um Estima-se 8-13% do proteome

Protocol

1. Previsão de Sites específicos Cdk1 fosforilação da sequência de proteína

1. Antes de começar o ensaio da quinase, analisar a sequência da proteína para sites de fosforilação previstas Cdk1 específicos e pesquisar a literatura para sítios de fosforilação experimentalmente estabelecido com especificidade quinase desconhecido. Use as seguintes ferramentas, bancos de dados e referências que são resumidas.
   1. Use o iGPS 3.0 software^36,37

Discussion

Nosso ensaio da quinase em vitro é um método muito poderoso para identificar alvos moleculares para a quinase Cdk1, que é um controlador mestre do ciclo celular e regula muitos processos celulares importantes. O método determina se uma proteína purificada é um substrato para a Cdk1 e permite a identificação dos sítios de fosforilação específica. Isto facilita estudos mecanicistas para regulação de processos celulares por fosforilação através de Cdk1.

O fator mais crí.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778