Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.

Abstract

Quantificazione di metilazione del DNA può essere ottenuto utilizzando del bisolfuro, che sfrutta la proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile, in un contesto di DNA single-stranded. Del bisolfuro può essere mirato (mediante PCR) o eseguite sul genoma intero e fornisce quantificazione assoluta di metilazione della citosina alla singola base-risoluzione. Data la natura distinta del DNA nucleare e mitocondriale, in particolare nella struttura secondaria, adattamenti di metodi di sequenziamento di bisolfito per indagare la metilazione della citosina nel mtDNA dovrebbero essere fatto. Struttura secondaria e terziaria di mtDNA può effettivamente portare ad bisolfito sequenziamento artefatti che conduce a falsi positivi a causa di scarso accesso denaturazione incompleta di bisolfito a DNA single-stranded. Qui, descriviamo un protocollo con una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con pipeline di analisi bioinformatica per consentire la quantificazione accurata della citosina i livelli di metilazione nel mtDNA. Inoltre, forniamo le linee guida per la progettazione il primer di sequenziamento di bisolfito specifici di mtDNA, al fine di evitare indesiderabili segmenti nucleare mitocondriale di targeting (NUMTs) inserito nel genoma nucleare.

Introduzione

Il genoma mitocondriale è una struttura circolare, doppio filamento di circa 16,5 kg base (kb), che costituiscono un pesante e un filo di luce. Il genoma mitocondriale è presente in più copie all'interno di ogni cella, maternamente ereditata e codifica componenti essenziali della catena respiratoria complessi¹. Simili ai genomi batterici e a differenza di genoma nucleare, il genoma mitocondriale è organizzato in numerose strutture secondarie e terziarie, come strutture a spirale e supercoiled², che può rendere difficile l'accesso durante la sequenza esperimenti³.

Nel nucleo, metilazione del DNA è un contrassegno epigenetico estesamente studiato che svolge un ruolo in numerosi processi, in particolare nella regolazione dell'espressione genica. Nel genoma di mammiferi, metilazione del DNA avviene principalmente sulla posizione 5 dell'anello pirimidinico di deoxycytidines, per lo più su dinucleotidi CG (o CpG). Metilazione della citosina è trovata al 70% di tutti i CpG nel genoma di cellule somatiche e conti per ~ 1% del totale^{che 4}basi di DNA. Iperomocisteinemici del DNA è stata descritta anche in contesti non-CpG, come CpA, CpT e CpC ed esiste in varie quantità nel DNA nucleare, con valori fino al 25% di tutti i cytosines metilati in cellule staminali embrionali^5,6,7.

Mentre la metilazione della citosina del genoma nucleare è ampiamente accettata, l'esistenza di metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale è ancora discutibile. Il primo studio investigativo del mtDNA metilazione è stata eseguita in cellule coltivate dove la metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata prontamente, anche se a livelli inferiori rispetto al nucleare DNA⁸. Nelle cellule umane e murine, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche a livelli bassi (2-5%). Usando le analisi basandosi su 5 metilcitosina cattura quali immunoprecipitazione di DNA metilato (MeDIP) seguita da PCR quantitativa, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche in vari mouse e umani e cellule linee^{9,10, 11,12}. Usando gli anticorpi contro la 5-metilcitosina in un test ELISA o spettrometria di massa, notevoli livelli di metilazione del DNA sono stati rilevati dalle frazioni mitocondriali purificate^{13,14,15, 16}. Tuttavia, la maggior parte dei saggi negli studi suddetti usato tecniche che non sono stati progettati per fornire una quantificazione assoluta di metilazione del DNA a singola base-risoluzione.

Analisi di metilazione del DNA quantitativa e risolutiva può avvenire mediante una tecnica denominata "bisolfito di sequenziamento", che si avvale della proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile nel DNA single-stranded contesto¹⁷ . Utilizzo del bisolfuro, una costellazione di studi ha rilevato la presenza di metilazione della citosina a vari livelli. MtDNA di metilazione della regione D-loop, il 12S o della regione 16S è stato rilevato prontamente in umano^{18,19,20,21,22,}mouse e^{23 24} tessuti e cellule, tuttavia, con una variabilità intrigante, 1-20% del totale cytosines attraverso gli studi.

In confronto a questi numerosi studi, solo pochi studi, tra cui dal nostro gruppo, hanno contestato la presenza del mtDNA metilazione^3,25,26,27 o messo in discussione la rilevanza biologica di livelli molto bassi di mtDNA livelli (inferiore al 2%)²⁸. Recentemente, abbiamo segnalato l'osservazione di un artefatto del bisolfuro potenziale nel complesso mitocondriale bisolfito sequenziamento³. Abbiamo fornito la prova che la struttura secondaria del DNA mitocondriale potrebbe portare a falsi positivi in bisolfuro, sopravvalutando quindi i livelli di metilazione. Qui forniamo un protocollo per prevenire un artefatto del bisolfito-conversione del mtDNA. Questo protocollo utilizza una semplice digestione enzimatica del DNA di distruggere strutture secondarie del mtDNA e consentire l'accesso completo al bisolfito seguendo un protocollo di sequenziamento di bisolfito. Inoltre, forniamo un'accompagnamento pipeline di bioinformatica per l'analisi di bisolfuro.

Protocollo

1. trattamento degli enzimi di limitazione

1. Linearizzare mtDNA trattando totale DNA umano con l'enzima di restrizione BamHI, che taglia in posizione 14258 nel DNA mitocondriale umano.
   Nota: Per mouse DNA, utilizzare l'enzima di restrizione BglII in condizioni identiche come di seguito.
2. Per ogni campione dove la metilazione del DNA mitocondriale è di essere valutati, preparare una provetta di reazione di 0,2 mL e aggiungere il seguente miscela: 3 μg DNA genomico (quantificato dalla fluorometria), 15 µ l tampone 3, 3 μL BamHI e acqua fino a di 150 μL
3. Inserire le provette in un termociclatore per 4 h a 37 ° C.

2. bisolfito conversione

1. Convertire DNA BamHI-trattato con bisolfito di sodio come descritto altrove²⁹.
2. Utilizzare 200-500 ng DNA BamHI-trattato per ogni reazione di conversione a un volume totale di 20 μL. Il recupero di DNA è 50-70%.
3. Eluire il DNA bisolfuro-convertito in tampone di eluizione 10 μL.
4. Quantificare il DNA single-stranded dalla fluorometria.
5. Optional: Memorizzare bisolfito-convertito DNA a-20 ° C prima di procedere il restante del protocollo. Per l'archiviazione a lungo termine, archiviare DNA bisolfuro-convertito a-80 ° C

3. design di bisolfito primer di sequenziamento

1. Disegnare primers per bisolfuro utilizzando gli strumenti online Methprimer³⁰ e BiSearch^31,32.
   Nota: Methprimer e BiSearch consentono di cercare sequenze dell'associazione iniettore su sequenze genomiche dove cytosines vengono convertiti in thymines, similmente al post-bisolfito di trattamento.
2. Per l'amplificazione ottima e imparziale, evitare i dinucleotidi CpG in primers e progettare la dimensione amplicone tra 100-300 bp.
3. Garantire che gli iniettori progettati sono specifici per il DNA mitocondriale utilizzando la funzione di BiSearch Ricerca di Primer. Inserire i primers già progettato bisolfito convertito, barrare la casella di bisolfito e includono un genoma di riferimento e parametri PCR.
   Nota: Verrà visualizzato un elenco di possibili prodotti di PCR.
4. Copiare la parte superiore 1-5 sequenze dell'iniettore e incollarli in un modulo d'ordine per la sintesi del oligonucleotide.
   Nota: Un elenco di umani e sequenze dell'iniettore del mtDNA del mouse che è stato convalidato in laboratorio viene visualizzata nella tabella 1.
5. Primer di test utilizzando bisolfito convertito PCR dopo l'elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto nel passaggio 4. Testare e ottimizzare tutte le coppie di primer separatamente e garantire che la dimensione corretta amplicone appare sul gel dell'agarosi.
   Nota: Se gli iniettori multiplexing sono necessari, aggiungere primer multiple ad una singola reazione di PCR e visualizzare i prodotti di PCR su elettroforesi del gel dell'agarosi o, un metodo più risolutivo come elettroforesi del gel di poliacrilammide, per distinguere i prodotti di simile dimensione.

4. bisolfito convertito PCR ed estrazione del Gel

1. Per amplificare le regioni di interesse, eseguire PCR utilizzando un'avvio a caldo Taq polimerasi. Brevemente, mix 100 ng convertito DNA, 500 µ m di primer senso e antisenso, 1 µ l dei dNTP mix (10 µ m di ciascun dNTP) e della polimerasi a 7,5 U/reazione in un volume totale di 50 µ l. PCR eseguita con le seguenti condizioni: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) 35 cicli; 10 min 72 ° C. Uso il primer o separatamente o multiplex.
2. Opzionale: Quando multiplazione primer, convertito uso 200 ng DNA e le seguenti condizioni in bicicletta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 cicli; 10 min 72 ° C.
   Nota: La temperatura può variare a seconda della temperatura di fusione degli iniettori.
3. Prodotti di PCR soggetti al gel elettroforesi su agarosio al 2% a 100 volt.
4. Dolce luce UV, estrarre i prodotti PCR con un bisturi e aggiungere microprovette. Non esporre i prodotti di PCR a luce UV eccessiva per evitare danni al DNA. Evitare il tempo di esposizione più di 30 s.
5. Purificare i prodotti PCR con purificazione del gel come descritto in precedenza³.
6. Quantificare il DNA purificato dal passaggio 4.5 utilizzando fluorometria. Procedere al passaggio 5 o archivio campioni a-20 ° C.

5. bisolfito di sequenziamento libreria preparazione

1. Eseguire la libreria preparazione dei prodotti PCR del bisolfuro-convertito.
   Optional: multisala prodotti di PCR in questa fase.
2. Eseguire fine-riparazione utilizzando fino a 100 ng di prodotto di PCR. Aggiungere 3 µ l fine preparazione enzima e tampone di reazione (10x) di 6,5 µ l fine riparazione al prodotto di PCR 55,5 µ l in un tubo di 0,2 mL. Posizionare e incubare la provetta in un termociclatore per 30 min a 20 ° C, seguita da 30 min a 65 ° C.
3. Legare gli adattatori sequenziamento mescolando il DNA fine-riparato con 15 µ l Blunt/TA ligasi, 2,5 µ l adattatore e 1 µ l legatura enhancer. Se si utilizza < 100 prodotto di PCR di ng come input, diluire adattatore 10 volte.
4. Mettere il mix (punto 5.3) in un termociclatore e incubare per 15 min a 20 ° C. Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 3 µ l utente enzima al tubo. Mescolare e collocare la provetta nel termociclatore e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
5. Dimensioni selezionare il DNA adattatore-legati utilizzando perline solido fase reversibile immobilizzazione (SPRI) con diversi rapporti di perline al DNA a seconda delle dimensioni del prodotto PCR.
6. Aggiungere 13,5 µ l H₂O al DNA adattatore-legati da passo 5.4 e 55 µ l risospese SPRI perline. Incubare a temperatura ambiente per tubo 5 min e posto su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida, trasferire il surnatante in una provetta nuova e gettare il tubo contenente le perle.
   Nota: Il surnatante contiene il DNA adattatore-legati e grandi frammenti indesiderati sono vincolati ai talloni scartati.
7. Aggiungere 25 µ l risospese SPRI perline al supernatante dal punto 5.6, miscelare e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e scartare il surnatante quando la soluzione è limpida.
   Nota: Il supernatante scartato contiene DNA indesiderato, mentre il DNA adattatore-legati è associato a perline.
8. Mentre il tubo è su supporto magnetico, aggiungere 200 µ l 80% etanolo (preparata) per lavare le perle. Incubare 30 s e rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi.
9. Branelli dell'aria secche per 5 min mentre il tubo è su supporto magnetico con un coperchio aperto.
10. Rimuovere il tubo dal magnete, eluire il DNA in 23 µ l di tampone di eluizione e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
11. Mettete il tubo su un supporto magnetico e quando la soluzione è limpida, trasferire 2 µ l in una piastra a 96 pozzetti PCR per l'amplificazione di pre-PCR (passo 5.14).
12. Trasferire il resto circa 21 µ l ad un nuovo tubo di 0,2 mL per l'amplificazione di PCR (passo 5,17).
    Nota: Assicurarsi di non trasferire tutti i branelli come perle in grado di inibire le reazioni enzimatiche di passaggi successivi.
13. Procedere al passo 5.14 o archivio campioni a-20 ° C.
14. Eseguire l'amplificazione di pre-PCR di RT-qPCR per stimare il numero di cicli necessari per amplificare il DNA adattatore-legati. Per reazione, aggiungere quanto segue nella PCR 96 pozzetti piastra contenente 2 µ l DNA (passo 5.11): 0,4 µ l indice primer, primer PCR universale di 0,4 µ l, 7,2 µ l H₂O, mix master RT-qPCR di 10 µ l.
15. Posizionare la piastra in una macchina PCR in tempo reale e la piastra di soggetto alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 cicli; 5 min 65 ° C.
16. Stimare il numero di cicli di amplificazione necessari per ciascun campione sottraendo un Ct-valore per il valore Ct della pre-amplificazione RT-qPCR corrispondente alla fine della fase lineare della reazione PCR.
17. Amplificare il DNA adattatore-legati dal passaggio 5.12 mescolando: 21 µ l DNA, 25 mix master di µ l PCR, primer di indice 1 µ l, primer di PCR universale 1 µ l e 2 µ l H₂O. In un termociclatore, soggetto ogni campione alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [Ct calcolato dal passaggio 5.16] cicli; 5 min 65 ° C.
    Nota: Ricordarsi di utilizzare solo un iniettore di indice per campione per consentire per multiplexing. L'indice viene inserito durante la PCR.
18. Purificare le perline SPRI DNA amplificate ed eluire in 22 µ l di tampone di eluizione.
19. Controllo di qualità di biblioteca di metodo gel elettroforesi o alternativa. Guardare per le dimensioni di picco libreria corretta (dimensione del prodotto PCR più adattatore).
20. Stimare le dimensioni medie di base-accoppiamenti dei prodotti libreria di analisi di striscio: In avanzate impostazioni globali, fare doppio clic su "tabella" sotto analisi di striscio. Definire l'area da 100-1000 bp e fare clic su OK. Sotto Tabella Region, viene visualizzata l'area definita e libreria media dimensione (bp) è calcolata.
21. Quantificare le librerie dalla fluorometria. Procedere al passaggio 6 o archivio librerie a-20 ° C.

6. sequenziamento di nuova generazione

1. Calcolare la concentrazione di nM di librerie utilizzando la formula:
   
2. Diluire le librerie per la stessa concentrazione ad esempio 2 nanometro (Scegli 4 nM, 2 nM, 1 nM, o 0.5 nM a seconda delle concentrazioni di biblioteca). Piscina tutte le librerie per ottenere un pool di 2 librerie di nM.
3. Denaturare e diluire le librerie seguendo la Guida di strumento di sequenziamento. In breve: denaturare la piscina nM 2 aggiungendo 0,2 N NaOH e incubare a temperatura ambiente per 5 min, diluire la piscina denaturata a una diluizione finale del 22. Denaturare e diluire una libreria di controlli disponibile in commercio a una diluizione finale di 12:05. Ad un nuovo tubo, mescolare la piscina di 22 con libreria di controllo di 20% 12:05.
   Nota: Conversione di bisolfito introduce complessità molto basso. Spike-in libreria di controllo 20% si tradurrà in una migliore qualità di sequenziamento.
4. Eseguire una sequenza di accoppiato-fine bp 150 utilizzando uno strumento di sequenziamento profondo.

7. calcolo analisi - i livelli di metilazione di stima

1. Generazione di file. fastq (qui chiamati sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), un indice di bismark dell'intero genoma di interesse (qui in una cartella denominata bismarkIndex) e assicurarsi che la sequenza genomic di chrM è disponibile in fasta formato (qui in una cartella denominata chrM).
2. Pre-elaborare letture per rimuovere schede e bias introdotto dai primer: utilizzare lo strumento Trim_galore³³. Rimuovere due nucleotidi dall'estremità 5' di entrambe le letture avanti e indietro.
   trim_galore - clip_R1 2--clip_R2 2 -o. / --accoppiato di trim1..--sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
3. Allineare le letture pre-elaborate per l'intero genoma utilizzando Bismark³⁴
   Bismark - a coda di rondine - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
   Nota: Se viene utilizzato un altro assetto, assicurarsi che le letture che non possono essere allineate in modo univoco vengono scartate.
4. Estratto di legge mappatura sul cromosoma M, qui usando Samtools³⁵
   samtools ordinare -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
   sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
   samtools Indice sample1_sorted.bam
   Mostra samtools -u sample1_sorted.bam chrM | samtools ordinare - n - O BAM -o sample1_chrM.bam
5. Estrarre le informazioni di metilazione
   bismark_methylation_extractor -p - CX - cytosine_report..--completa..--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam
6. Utilizzare il .bedGraph, il COV o i file di CX_report.txt per un'ulteriore analisi. Utilizzare il file di sample1_chrM.CX_report.txt per la visualizzazione e il test.
7. Eseguire ulteriori ritaglio nella fase pre-elaborazione, se più aree vengono interrogati e una polarizzazione di primer può essere visibile nelle trame M-bias generate durante il mapping. Fare riferimento alla documentazione di Bismark per ulteriori informazioni.

8. computational Analysis - Test delle differenze

1. Assicurarsi che il file CX_report.txt contiene 7 colonne, cromosoma (qui chrM), posizione, strand, numero di letture metilate, numero di letture non metilate, contesto C e sequenza circostante, per ogni C sul cromosoma M.
2. Come il CX_report copre chrM nella sua interezza, controllare il sottoinsieme per le regioni che viene amplificate.
3. Utilizzare test non parametrici per le differenze tra i campioni, come il test esatto di un pescatori per singoli di C o un segno-test per un'intera regione.
   Nota: Quantificazione sarà spesso vicino metilazione 0%, che è il motivo per cui assumendo normalità non è appropriato.
4. Allo stesso modo, per la visualizzazione, o visualizzare quantili o calcolare intervalli di confidenza della proporzione binomiale.

Risultati

Due punti in questo protocollo sono cruciali durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. 1) l'apertura della struttura secondaria e 2) il disegno di primer specifici del DNA mitocondriale.

Digerendo il DNA genomico umano con l'enzima di restrizione BamHI (Figura 1), la struttura di DNA mitocondriale sarà tagliata alla posizione del nucleotide 14.258 e la struttura secondaria sarà apert...

Discussione

Qui, forniamo un protocollo del bisolfuro che è specificamente progettato per interrogare la metilazione del DNA mitocondriale. Le differenze con del bisolfuro protocolli utilizzati per DNA genomico si trova nell'utilizzazione di una fase di digestione degli enzimi di limitazione preventiva e un'analisi bioinformatica sentenza fuori falsi positivi derivanti da sequenze di NUMT.

Forniamo un protocollo per evitare artefatti del bisolfuro durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. M...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA methylation-lightning kit	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
High Sensitivity DNA chip	Agilent	# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
Sodium hydroxide	Sigma	# S5881
Thermal cycler C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	#1855195
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq instrument	Illumina	# SY-410-1003