Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

요약

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

초록

인간의 신체에서 부드러운 조직 일반적으로 kilopascal (kPa) 범위에 강성을 있다. 따라서, 실리콘 및 히드로 유연한 기판 경작 조건 비보에 부분적으로 모방 하는 실제 microenvironment에서 셀에 대 한 유용한 기판 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 영의 계수 등방성 선형 탄성 기판 mechanobiology 연구에 일반적으로 사용의 특성화에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 준비 하는 페 트리 접시 또는 뻣 뻣 한 실리콘에 부드러운 실리콘 기판, 형광 구슬 실리콘 기판의 윗 표면 코팅,는 형광 이미징 (중력)에 의해 상면을 밀리미터 단위 구체를 사용 하 여 프로토콜 구성 들여쓰기 실리콘에 구슬 표면 형광 현미경을 사용 하 여 및 실리콘 기판의 영의 계수 계산 결과 이미지를 분석 합니다. 기판의 상면 (형광 구슬) 뿐만 아니라 응용 세포 외 기질 단백질 커플링 실리콘 기판을 셀 도금 및 견인 힘 현미경 실험을 사용 하 여 후속 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 베이스로 페 트리 접시 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용을 외부 뻗 기를 포함 하는 mechanobiology 연구를 사용 하 여 수 있습니다. 이 프로토콜의 구체적인 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 widefield 형광 현미경,이 절차에 필요한 주요 장비입니다. 우리는 다른 탄성 계수의 부드러운 실리콘 기판의 영의 계수를 측정 하 여이 프로토콜을 보여 줍니다.

서문

부드러운 조직에 세포의 강성은 kilopascal 범위¹, 누구의 강성은 몇 배나 더 높은 조직 문화 요리 달리 마이크로-환경에 거주. 세포 외 기질 단백질 코팅 부드러운 기판에 초기 실험 기판 강성 영향 어떻게 세포 이동으로^2,3아래 기질을 보여주었다. 사실, 기판 강성 근본적으로 영향을 퍼지는 생 화 확 적인 신호를 유사한 방식으로 셀 기능⁴ . (세포 외 기질 단백질 코팅) polyacrylamide 젤은 (물 permeating) hydrogels mechanobiology 연구⁵대 문화 기질 세포로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 입니다 (PDMS), 가장 일반적인 실리콘 (polysiloxane), 널리 사용 되었습니다 뻣 뻣 한 실리콘으로 megapascal 범위 강성과 마이크론 스케일 제조⁶. 더 최근에, 소프트 실리콘 기판 더 순수 관련 kilopascal 범위에서 경직 된 mechanobiology 연구^7,8셀 문화 기판으로 고용 되었습니다.

여러 가지 방법은 유연한 기판, 원자 힘 현미경 검사 법, 스트레칭, 유동성, 및 들여쓰기 영역을 사용 하 고 둥글게 밀고 microindentors^{9 시 전체 샘플의 거시적인 변형 등의 강성을 측정 하는 데 사용 되었습니다.} . 각 기술에는 그것의 자신의 이점 및 불리, 구체와 들여쓰기만 widefield 형광 현미경에 액세스 해야 하는 특히 단순 하지만 상당히 정확한 방법입니다. 금속 구체와 들여쓰기 hydrogels 이전 작업^3,,910의 강성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 셀 운동 기판 강성의 중요성을 설명 하는 초기 작업 히드로 기판 강성³를 결정 하는이 방법을 활용. 더 최근에, confocal 현미경 검사 법 또한 우아한 특성¹⁰에 대 한 사용 되었습니다.

여기, 우리 제시 부드러운 실리콘 기판 준비 단계별 프로토콜 형광 구슬 커플링 (과 콜라겐과 같은 세포 외 기질 단백질 나) 상단 표면에 단지 단계 들여쓰기 구와 최고 표면 사용 하 여 이미징 및 형광 이미징, 각각, 그리고 마지막으로 실리콘 기판의 영의 계수를 계산 하기 위해 이미지를 분석. 이 방식으로 준비 하는 부드러운 실리콘 기판 견인 힘 현미경 실험에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 기반으로 (배양 접시) 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용은 또한 mechanobiology 연구를 외부 뻗 기를 사용 하 여 수 있습니다. 보증, 어디 가능한 합병증 방지에 필요한 실용적인 고려 사항 또한 표시 됩니다.

프로토콜

1입니다. 부드러운 실리콘 기판의 제작

1. 1.75 g A 구성 요소 및 B 구성 요소의 1.75 g으로 무게 (A:B = 1:1) 부드러운 실리콘 엘라 스토 머 키트 (폴리스 티 렌)를 사용 하 여 트레이 무게.
2. A 구성 요소 무게 트레이에 B 구성 요소에 추가 하 고 적절 한 주걱 스틱을 사용 하 여 5 분 동안 함께 그들을 섞는다.
3. 35 mm 페 트리 접시 위의 혼합물을 추가 합니다. 몇 분 동안 배양 접시에 걸쳐 균등 하 게 확산 혼합물을 허용 한다.
   참고: 페 트리 접시 지름과 부드러운 실리콘의 양을 부드러운 실리콘 두께 결정 합니다. 여기, 두께 약 3.5 m m; 될 것입니다. 토론 섹션에서 고무 두께 선택 하는 것에 대 한 더 많은.
4. 모든 기포를 제거 하려면 15 분 동안 진공 챔버에, 뚜껑 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 미리 70 ° c 뜨거운 접시가 열
5. 핫 플레이트에는 70 ° C에 도달 하면, 유리 슬라이드에 놓고 유리 슬라이드에 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 실리콘을 하자 30 분 동안 70 ° C에서 치료. 로 페 트리 접시 녹아 있습니다 핫 플레이트에 직접 폴리스 티 렌 접시를 배치 하지 마십시오.

2. 부드러운 실리콘에 형광 Microbeads 커플링

1. (발견된 페 트리 접시)에 치유 부드러운 실리콘 깊은 UV 챔버 (185 및 254 nm의 빛 파장의 깊은 UV 램프와 인클로저)에 배치 합니다. 부드러운 실리콘 샘플 (UV 램프에서 ~ 5-10 cm) 5 분에 대 한 깊은 자외선 노출.
   1. 실리콘 깊은 자외선에 노출 되는, 아래 단계 2.2-2.6와 함께 진행 합니다. 깊은 자외선 노출 후 샘플을 검색 하기 전에 적어도 5 분 동안 깊은 UV 챔버를 드.
2. 한편, 19 mg microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 밖으로 무게 하 고 그것에 이온된 수 (DI) 물 500 μ를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 EDC를 분해.
3. 별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 11 mg N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo NHS)의 밖으로 무게, 디 물 500 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 떨고 sulfo NHS를 해산. 그런 다음, 단일 microcentrifuge 튜브에 EDC sulfo NHS 솔루션 결합.
4. 이 EDC/sulfo NHS 솔루션 (1 %w / v 재고 농도)와 30 μ 0.44 μ m 직경 빨간색 (또는 필터 큐브 형광 현미경에서 사용할 수에 따라 다른 형광 색)의 수정 카복실산 형광 microbeads을 추가 합니다.
5. EDC/sulfo NHS/비드 혼합물에 추가 하는 콜라겐의 0.02 m g (쥐 꼬리, 0.02 M 초 산에 4 mg/mL의 재고 농도)에서 나 약 0.02 mg/mL의 농도를.
6. EDC/NHS/구슬/콜라겐 소용돌이 나 구슬 결합 하기 전에,에 걸쳐 균등 하 게 분산은 되도록 짧게 혼합물.
7. 플라스틱 EDC/NHS/구슬/콜라겐의 1 mL 나 혼합물 parafilm 다른 얕은, 평면 뚜껑 (작은 직경)의 상단에 배치의 조각에. 반전이 혼합물에 부드러운 실리콘 페 트리 접시는 부드러운 실리콘 표면 혼합물을 연결 하지만 아래 작은 페 트리 접시의 뚜껑의 표면을 직접 만지지 않는다. 거꾸로 페 트리 접시 스페이서의 양쪽에서 하나 또는 두 개의 유리 슬라이드를 사용 하 여 거꾸로 페 트리 접시, 인상.
   참고: 그림 1 단계 2.7를 수행 하는 방법을 볼 수를 참조 하십시오.
8. 알루미늄 호 일 샘플을 커버 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
9. 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 제거 하 고 그것을 똑바로 설정 (실리콘-쪽).
10. 접시에 PBS (pH 7.4)의 2 개 mL를 추가 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 부드러운 실리콘 표면 세척. 몇 분 동안 앉아 보자. PBS에서 aspirate 그리고 2 mL의 PBS로 다시 실리콘 세척. 실리콘 추가 대 한 치료는 하루에 대 한 하자. 그 이유로 장소 부드러운 실리콘 샘플 PBS에서 37 ° C에서 하룻밤.

3. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 영역 들여쓰기와 실리콘 강성 측정

1. 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 검색 하 고 실리콘 표면 액체 표면 아래 몇 mm을 PBS의 1 mL 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.
2. 날카로운된 핀셋을 사용 하 여, 부드러운 실리콘에 5 1 m m 지르코늄 구체 indentors 드롭. 액체 매체에 구체를 담가 그리고 실리콘 레이어 및 다른 indentors의 위치에서 적어도 5 indentor 직경의 가장자리에서 그들을 드롭.
   참고: 액체 표면 위에 떨어졌다 구체 실패할 수 있습니다 액체 매체 (부동 소수점) 입력 액체 매체의 표면 장력 때문.
3. 기본 페 트리 접시를 통해 이미지 수 있도록 현미경 스테이지에 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 놓습니다.
4. 10 X 목표 단계 이미지를 사용 하 여 (건조 10 X 같은 나 0.30의 객관적인), 찾아서 초점으로 구체 indentor를가지고.
5. 부품의 단계 이미지는 indentor의 전부를가지고 고이 이미지를 저장. 타일 스캔을 사용 하 여 사용 가능한 경우. 어떤 눈에 보이는 결점에서 indentor 있으면 삭제 하 고 다른 indentor 바꿉니다.
6. 프레임의 왼쪽된 가장자리는 적어도 ~1.5 R indentor 센터에서의 거리를 라이브 단계 영상에서 indentor의 가장자리의 왼쪽에 이동 합니다. 센터는 indentor의 그대로 오른쪽 이미지 프레임의 오른쪽 가장자리 근처에 표시 됩니다 확인 하십시오. 단계 이미지 하 고 그것을 저장 합니다.
7. 빨간 형광 채널에 대 한 조명 현미경 광원을 전환 합니다. X-및 y-좌표 변경 ( x-indentor 센터 내에서 하지만 프레임의 오른쪽 가장자리 근처의y 위치), 초점 (Z 감소) 아래로 구체 indentor의 센터 아래 빨간 형광 microbeads까지 그냥 초점 이동 합니다.
8. (영상 프레임의 왼쪽된 가장자리) 근처 indentor 멀리 실리콘의 상위 계층에 microbeads 초점 이동까지 모든 z-0.5 µ m의 증가 대 한 이미지와 z 스택을 가져가 라.
9. 샘플에 다른 indentors와 3.4-3.8 단계를 반복 합니다.

4. 실리콘의 강성 (탄성 계수)를 계산

1. ImageJ, 선 도구에 클릭을 사용 하 여 indentor의 위상 이미지를 열고 픽셀에서 indentor의 직경을 측정 합니다. 클릭 한 채로 indentor 가장자리에 지점에 커서를 정반대로 반대 지점에 가장자리에 고 길이 픽셀 커서를 해제 하기 전에 ImageJ 메인 윈도우의 상태 표시줄에 표시 합니다.
   1. 분석을 클릭 하 여 길이 단위를 픽셀로 설정 되어 있는지 확인 | 설정 규모 길이의 단위를 확인 하 고.
   2. 객관적인 확대 및 CCD 카메라 픽셀 크기에 의해 μ m indentor의 반경 픽셀 단위 변환 (μ R = R x μ m에 CCD 카메라 픽셀 크기 (픽셀)에서 / 객관적인 확대).
2. 열고 microbead 이미지의 빨강 채널 z-스택 (해당 되는 경우는 microbeads는 빨간색 형광) ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 | 가져오기 | 이미지 시퀀스 고 스택의 모든 이미지를 선택 하 고 스택의 열을 확인 을 클릭 합니다.
   참고: f 1에서 indentor 센터에서 microbeads 최상의 가능한 초점 이며 F2 프레임 번호는 프레임의 왼쪽된 가장자리 근처 (구슬 중심에서 R ~1.5의 지역)에서 microbeads에 있는 최상의 가능한 초점 프레임 번호입니다. Z-두 프레임 간의 차이 들여쓰기 깊이 δ.
   1. ImageJ에서 선 도구를 사용 하 여, 이미지에 잘 정의 된 microbead에서 선을 그립니다. 클릭 분석 | 프로필을 플롯 구슬에서 다른 프레임을 선택 하는 동안 업데이트 된 라인 스캔 강도를 라이브 버튼을 클릭 하십시오. 초점에서 프레임으로 최대 강도의 높은 가치를 제공 하는 프레임을 선택할 수 있습니다.
   2. Z-z-스택 프레임 사이 증가 0.5 μ m 이므로, δ로 μ m에서 들여쓰기 깊이 계산 (F2-F1) = 0.5 x.
3. (마이너스 반대 부 력 힘), 그것의 무게 때문 indentor 여 즉 젤에가 해지는 힘을 계산, 들여쓰기 강제 F, 중력 때문에 가속도 x indentor-액체 매체의 밀도 (밀도) x indentor의 볼륨으로. 방정식 F 를 사용 하 여 = (4/3) x (ρ_indentor -ρ_중간) x (R³) x 3.142 g R 은 indentor의 반지름 x ρ_indentor indentor, ρ_매체 의 밀도 액체 매체의 밀도 이며 g 는 중력 (9.81 m/s²) 때문에 가속도. SI 단위의 F (N)를 오른쪽에 모든 수량을 표현 한다.
4. 영의 계수 (E) 수정된¹¹ 헤르츠 모델¹² 방정식을 사용 하 여 실리콘의 계산:
   
   장소:
   c =; 뒤에 헤르츠 모델 식을 수정 하는 수정 계수
   v = (비압축 자료⁷에 관해서는 0.5로 찍은); 실리콘 젤의 Poisson의 비율
   F = 들여쓰기 힘;
   R = indentor 반경; 그리고
   Δ = 들여쓰기 깊이.
   전자 실바에서를 SI 단위로 오른쪽에 모든 수량 표현
   1. 보정 계수 c ³을 다음과 같이 계산 합니다.
      
      장소:
      
      ; 그리고
      .
      이 수정 계수는 부드러운 실리콘 (있는 경우) 아래는 페 트리 접시 (또는 뻣 뻣 한 실리콘)을 잘 준수 하는 경우에 사용 하기 위해 특별히 주목 한다.
   2. H 양의 실리콘 추가 페 트리 접시 지름에 따라 부드러운 실리콘 층의 높이 계산 합니다. 또는, 직접 단계 영상에 의해 실리콘 층의 위쪽 및 아래쪽 표면의 z 좌표를 결정 하 여 h를 구하는 (작은 불순물 중 표면에 초점에와 서). 큰 h에 대 한 유의 (h² > Rδ), 보정 계수 c 1에 가깝다.
5. 각 indentor 단계 4.1-4.4 반복 합니다. 영의 계수는 실리콘 샘플에 대 한 평균 탄성 계수를 각 indentor에서 얻은 평균.

결과

위에서 자세히 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여, 우리 준비 35 mm 페 트리 접시에에서 부드러운 실리콘, 30 분 동안 70 ° C에서 그것을 치료 하 고 형광 microbeads 결합 (및 콜라겐 나) 개요로 서 그림 1에 표시 된 위쪽 표면에. 깊은 UV 기판¹³커플링 최종 단백질에 대 한 이전 사용 되었습니다. (나) 경화 조건 여기에 사용 되는이 부드러?...

토론

영역 들여쓰기 메서드는 쉽게 구현할 수, indentor의 선택과 부드러운 실리콘 샘플의 두께에 주의 지불 한다. 영의 계수를 계산 하는 데 사용 하는 방정식 조건¹¹의 세트에서 유효 하 고 이들은 일반적으로 실리콘 샘플의 두께 indentor 반지름의 > 10% 일 때 만족 하 고 < indentor 반지름 x 13 ~. 우리는 발견 실리콘 두께 5-10 x의 indentor 반경 했다 좋은 선택, 어떤 점에서 샘플 두께 너무 높은 (...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CY 52-276 A/B silicone elastomer kit	Dow Corning	CY 52-276	Store at room temperature
Thermo Scientific Pierce EDC	Fisher Scientific	PI22980	Store at -20°C
Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker	Fisher Scientific	PI-24510	Store at 4°C
Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL	Spherotech, Inc.	CFP-0558-2	Store at 4°C, do not freeze
1.0 mm Acid washed Zirconium beads	OPS Diagnostics LLC	BAWZ 1000-250-33
Deep UV chamber with ozone evacuator	Novascan Technologies, Inc.	PSD-UV4, OES-1000D
Wide field fluorescence microscope	Leica Microsystems	DMi8
Collagen I, from rat tail	Corning	354236	Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C
ImageJ-NIH	N/A	N/A	public-domain software