Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Zusammenfassung

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Zusammenfassung

Screening für Protein-Protein-Interaktionen mit der Hefe-2-Hybrid-Assay ist seit langem ein wirksames Instrument, aber seine Verwendung wurde weitgehend auf die Entdeckung der hohen Affinität Interaktoren, die in der Bibliothek der interagierenden Kandidaten hochangereichertes sind begrenzt. In einem traditionellen Format kann Hefe 2-Hybrid Assay zu viele Kolonien zu analysieren, wenn bei niedrigen Stringenz durchgeführt ergeben, wo geringe Affinität Interaktoren gefunden werden könnte. Darüber hinaus kann nicht ohne eine umfassende und vollständige Befragung derselben Bibliothek gegen verschiedene Köder Plasmide, eine vergleichende Analyse erreicht werden. Obwohl einige dieser Probleme behoben werden kann, angeordneten Beute Bibliotheken verwenden, können die Kosten und die erforderliche Infrastruktur für solche Bildschirme betreiben unerschwinglich sein. Als Alternative haben wir die Hefe 2-Hybrid Assay um gleichzeitig entdecken Sie Dutzende von Transienten angepasst und statische Protein-Interaktionen in einem einzigen Bildschirm mit Hilfe einer Strategie bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks), die enthält Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und Berechnung, mit der die Entwicklung einer Population von Plasmiden folgen, die Interaktionspartnern zu kodieren. Hier beschreiben wir maßgeschneiderte Reagenzien und Protokolle, die einen DEEPN Bildschirm einfach und kostengünstig ausgeführt werden können.

Einleitung

Ein vollständiges Verständnis der biologischen Zellprozesse stützt sich auf die Suche nach der Protein-Interaktion-Netzwerke, die ihre molekularen Mechanismen zugrunde liegen. Ein Ansatz zur Protein-Interaktionen zu identifizieren ist die Hefe 2-Hybrid (Y2H) Assay, die Arbeiten durch einen funktionierenden Chimären Transkriptionsfaktor zusammenfügen, sobald zwei Protein Domänen von Interesse an einander¹binden. Ein typische Y2H-Bildschirm erfolgt durch die Schaffung einer Bevölkerung von Hefe, die beide eine Bibliothek von Plasmiden Codierung interagierenden Proteine verschmolzen zu einem transcriptional Aktivator beherbergt (zB., "Beute" Schmelzverfahren Protein) und ein bestimmtes "Köder" Plasmid bestehend aus dem Protein von Interesse verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne (z.B. die Gal4 DNA-bindende Domäne, die an die Gal4-upstream aktivierende Sequenz bindet). Einer der Hauptvorteile des Y2H-Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und kostengünstig durchzuführen in einem typischen Labor für Routinearbeiten molekularen biologischen^{2 ausgestattet}. Jedoch wenn traditionell durchgeführt, Proben ein Benutzer einzelne Kolonien, die bei der Auswahl für eine positive Y2H-Interaktion entstehen. Dies schränkt die Anzahl der Bibliothek "Beute"-Klone, die befragt werden können. Dieses Problem wird verstärkt, wenn die Fülle an eine bestimmte interagierenden Beute sehr hoch im Vergleich zu anderen, verringern die Chance Interaktion von niedrigen Fülle Beute Plasmide zu erkennen ist.

Eine Lösung für die Verwendung der Y2H-Prinzip in umfassende Abdeckung des Proteoms ist die Verwendung eines Matrix-formatierte Ansatzes, wobei ein Array mit bekannten individuelle Beute Plasmide Digital abgefragt werden kann. Ein solches Vorgehen erfordert jedoch eine Infrastruktur, die nicht ohne weiteres zugänglich oder kostengünstig an die einzelnen Ermittler ist, die bei der Festlegung der Interaktom einer kleinen Anzahl von Proteinen oder Domänen³interessiert sind. Darüber hinaus würde sehr komplexe Beute-Bibliotheken, die mehrere Fragmente von interagierenden Proteine kodieren können solche Matrix Arrays zu unpraktisch Größen vergrößern. Eine Alternative ist Assays mit komplexen Bibliotheken in Chargen und das Vorhandensein von interagierenden Klone mit massiv parallelen Hochdurchsatz-Sequenzierung⁴zu bewerten. Dies kann angewendet werden, um das Vorhandensein von Beute Plasmide assay, die in mehrere Kolonien mit einem typischen entstehen Y2H formatiert Ansatz in der Hefe Zellen Gehäuse interagierenden Pair von Fusionsproteinen dürfen auf einer Platte^5,6wachsen. Diese allgemeine Idee kann akzentuiert werden, zur Steigerung der Abfrage der beiden mehrere Köder und Komponenten in der gleichen Zeit^7,8zum Opfer.

Dennoch, viele Untersuchungen erfordern, dass ein einfacher noch mehr Aufwand auf nur wenige Protein "Köder" konzentriert und profitieren mehr von einer erschöpfenden und semi-quantitativen Abfrage einer einzigen komplexen Beute-Bibliothek. Wir haben entwickelt und validiert ein Konzept für die breit angelegte Protein Wechselwirkungsstudien mit einem Y2H-Prinzip in Batch Format⁴durchführen. Dies nutzt das Wachstumstempo von einem bestimmten Beute Plasmid als Proxy für die relative Stärke der Y2H Interaktion⁹. Tiefe Sequenzierung aller Plasmide innerhalb einer Population normales Wachstum ausgesetzt oder selektive Wachstumsbedingungen produziert eine vollständige Karte der Klone, die starke und schwache Y2H Interaktionen ergeben. Das Repertoire der interagierenden werden erhalten und direkt über mehrere Köder Plasmide verglichen. Die resultierende Workflow bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks) kann so zum differenziellen Interactomes aus den gleichen Beute Bibliotheken, Proteine, Vergleich zwischen ein Protein vs. anderen zu identifizieren identifizieren.

Hier zeigen wir DEEPN und Verbesserungen in die Labormethoden, die seine Verwendung zu erleichtern, die in Abbildung 1aufgeführt sind. Signifikante Verbesserungen umfassen:

Generation der Beute Hefe Bevölkerung. Eine der wichtigsten Voraussetzungen der DEEPN erzeugt Populationen von Hefe mit verschiedenen Köder Plasmide, die die gleiche Verteilung der Plasmid-Beute-Bibliotheken haben. Gleichwertige Grundlinie Populationen der Beute Plasmid Bibliothek sind essentiell für genaue Vergleiche zwischen den Interactomes von unterschiedlichen Ködern. Dies geschieht am besten, wenn ein Bibliothek-Plasmid sich bereits in einer Population von haploiden Hefe befindet und Umzug eines bestimmten Köder-Plasmid in dieser Population erreicht wird, indem die Paarung um einen diploiden zu produzieren. Hier bieten wir einen klaren Leitfaden wie man solche Populationen mit kommerziellen Bibliotheken in haploiden Hefe untergebracht. Obwohl wir Methoden, die eine hohe Anzahl von diploiden zu erzeugen gefunden, war die Paarung Gesamteffizienz des diese kommerzielle Bibliothek-haltigen Hefestämme gering. Daher haben wir eine neue Sorte, die Beute Bibliotheken aufnehmen kann, die weit mehr diploiden pro Paarung Reaktion ergibt.

New set Köder Plasmide. Viele aktuelle Plasmide, die "Köder" Schmelzverfahren Proteine enthalten des Proteins des Interesses und eine DNA-bindende Domäne Ausdrücken basieren auf 2µ, so dass sie ihre Kopienzahl verstärken. Diese Kopienzahl kann sehr variabel in der Bevölkerung und führen zu Schwankungen in der Y2H transcriptional Antwort. Dies könnte wiederum die Fähigkeit zu beurteilen, die Stärke einer bestimmten Protein Interaktion anhand der Antwort Wachstum von Zellen unter Auswahl verzerren. Dies kann teilweise Adresse sein, mit einem niedrigen Kopie Plasmid, von denen einige wie die im Handel erhältlichen pDEST32¹⁰zuvor beschrieben wurden. Wir konstruierten eine neue Köder-Plasmid (pTEF-GBD), das produziert Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionsproteine innerhalb einer TRP1 Zentromer-basierte niedrigen Kopie Plasmid trägt die Kanr-Resistenz-Gen, die auch ermöglicht, Klonen von Köder Fragmente sowohl stromaufwärts und unterhalb des Gal4 DNA-bindende Domäne.

Neue High-Density Y2H fragmentbibliothek. Wir ein neues Plasmid, Haus Y2H Beute Bibliotheken gebaut und benutzte es, um eine hochkomplexe Y2H-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip geschert Bruchstücke von genomischer DNA aus Saccharomyces Cerevisiaegemacht zu bauen. Sequenzanalyse zeigte, dass diese Bibliothek mehr als 1 Million verschiedene Elemente, die weitaus komplexer als die zuvor beschriebenen Hefe genomische Y2H Plasmid Bibliotheken¹¹. Mit dieser neuen Bibliothek konnten wir zeigen, dass der DEEPN-Workflow robust genug ist, um komplexe Bibliotheken mit vielen unterschiedlichen Plasmide in einer Art und Weise aufzunehmen, die zuverlässig und reproduzierbar ist.

Protokoll

1. Vorbereitung von Medien und Platten

Hinweis: Alle Platten minimal 2 Tage vor Beginn des Protokolls vorgenommen werden müssen. Die Medien können jederzeit vorgenommen werden. Die gepufferten Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker Adenin (bYPDA) muss jedoch am Tag gemacht werden, von dem es verwendet wird. Einige Medien erfolgt über eine Ergänzung-Mischung mit einem Niveau von Adenin, das größer als das, was in der Regel gewohnt ist. Die meisten minimal Medien Ergänzungen geben Sie 10 mg/L Adenin. Nahrungsergänzungsmittel mit der Bezeichnung "+ 40Ade" geben Sie eine Gesamtmenge von 40 mg/L Adenin.

1. Bereiten Sie Glukose-Lösung (50 % w/V). Für 1 L, 500 g D-(+) auflösen-Glukose in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Stellen Sie die Lautstärke auf 1.000 mL mit einem Messzylinder und Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile 1.000 mL-Medien-Vorratsflasche.
2. Bereiten Sie Hefeextrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Platten. Für 1 L, 20 g Pepton und 10 g Hefeextrakt in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
3. Bereiten Sie komplette synthetische minimalste Medien (CSM)-Trp-Platten. Für 1 L, 6,7 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 0,7 g - Trp-Dropout-Mix, 20 mg Methionin und 15 g Agar getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
4. CSM-Leu-Met Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder und füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Leu-ausfallende Mischung und 15 g des Nährbodens getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
5. CSM-Leu-Trp Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Trp-Leu + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
6. CSM-Leu-Trp-seine Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
7. CSM-Leu-Trp-His-3AT Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. In 100 µL einer 1 M steril Aktie des 3-amino-1,2,4-Triazol (3AT) durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
8. LB-Kanr Platten vorbereiten. Für 1 L, 10 g Tryptone, 5 g Hefe auflösen extrahieren und 10 g NaCl in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 1.000 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Fügen Sie 50 mg Kanamycin und durch Umschwenken mischen.
   1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
9. YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp und CSM-Leu-Trp-HSI Medien vorbereiten. Verwenden Sie das Verfahren oben für außer statt in einen Erlenmeyerkolben gießen, Gießen Sie in ein Medien-Vorratsflasche und der Agar weglassen-Platten.
10. BYPDA (gepufferte YPDA) vorzubereiten. Nehmen Sie sterile YPD Medien und fügen Sie 200 mg/L Adenin in sterilem destilliertem Wasser hinzu. PH bis 3.7 mit HCl. Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile Flasche einstellen.
11. Bereiten Sie Transformation Puffer: 2 M Sorbit, 1 M Lithium Acetat Dihydrat, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM-Kalzium-Chlorid in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
12. Bereiten Sie PEG-Lösung: 70 % w/V Polyethylenglykol 3350 in destilliertem Wasser. Von Autoklaven sterilisieren.
13. Bereiten Sie Wirbeln: 8 M Harnstoff, 4 % w/V SDS, 50 mM Tris, pH 6,8, 10 % V/V Glycerin, destilliert 0,02 % w/V Bromophenol blue in sterilen Wasser.
14. STE (starke TE) vorbereiten: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
15. Vorbereitung Zymolase-Stammlösung: 10 mg/mL Zymolase 100 t 50 mM Kalium Phosphat Diabas-pH 7,5, 50 % V/V Glycerin Puffer in sterilem destilliertem Wasser (bei-20 ° C gelagert).

2. Klonen und die Überprüfung der Köder Plasmide

Hinweis: Bau des Gal4-DNA-bindende Domäne Plasmide. Derzeit gibt es eine Vielzahl von im Handel erhältlichen und akademisch verfügbare Y2H-Systeme. DEEPN kann viele davon aufnehmen, vorausgesetzt, dass der Köder Plasmid mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne in einem TRP1-Plasmid enthalten. Andere nachgeschaltete Anforderungen sind, die die Sequenz sofort stromaufwärts der Beute Bibliothek einfügen bekannt ist und, die eine positive Y2H-Interaktion kann erzielt werden, durch die Produktion von His3 ermöglichen in Medien fehlt Histidin zur Auswahl. Hier beschreiben wir Gebrauch von einer neuen Y2H Köder Plasmid (pTEF-GBD, Abbildung 2), jedoch können andere Y2H-Köder-Plasmide einschließlich pGBKT7 sowie verwendet werden. Für Konstruktion und Evaluation von Köder Plasmide beschreiben wir Verwendung von pTEF-GBD. Generell empfehlen wir Gensynthese, einen offenen Leserahmen zu produzieren, die hält sich an die Hefe Codon Vorspannung zu guter Ausdruck und Leichtigkeit mit dem Klonen zu gewährleisten. Sicherstellen Sie, dass das Klonen Schema den Köder ermöglicht zu sein in-Frame mit dem Gal4 DNA-bindende Domäne und beim Klonen in der 3'-Website ein Stopcodon die Köder-kodierende Region folgt.

1. Vorbereiten des Plasmid-Vektors. Plasmid pTEF-GBD ermöglicht das Klonen ein Fragment, die Codierung des Proteins des Interesses entweder 5' oder 3' der Region Codierung die Gal4 DNA-bindende Domäne mit einer schnellen Montage-Methode. Für Einfügung an der 5' Website, 3 µg pTEF-GBD NarI mit EcoRI zu verdauen oder für Einfügung an der 3'-Website, zu verdauen, mit BamHI und XhoI für 2-4 h Elektrophorese Probe in 1 % DNA Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL Interkalation Bromid (EtBr) bei 100 V. Verbrauchsteuern Schnitt 5.630 bp TEF-GBD und reinigen mit den DNA-Gel Extraction Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm durch Spektralphotometer¹².
   Hinweis: Generation der Köder-Codierung Einsätze. DNA-Fragmenten codieren Proteine oder PROTEINFRAGMENTE von Interesse können mit Gensynthese erhältlich und als uncloned Fragmente. Es wird empfohlen, dass Codons für Ausdruck in Saccharomyces Cerevisiae optimiert sind und online-Tools zur Optimierung der Codon sind in der Liste der Materialien enthalten.
2. Für 5' Insertion, flankieren das DNA-Fragment Kodierung ein ATG-Start-Codon durch 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 "und 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3", beziehungsweise. Für 3' Insertion im Rahmen mit den Gal4 DNA-bindende Domäne, flankieren die Codierung Fragment von 5'-Ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'und 5'-Tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. Verwenden Sie für Plasmid Bau die schnelle Montage-Methode gemäß Anweisungen des Herstellers für Klonen Fragmente in geschnittenen pTEF-GBD.
   1. Teller alle E. Coli auf LB-Kanr Teller umgewandelt und 16-20 h bei 37 ° c inkubieren Kolonien Gehäuse pTEF-GBD mit dem gewünschten Einsatz können durch PCR-Amplifikation mit der Oligonukleotide identifiziert werden: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' und 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Einfügen und 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 "und 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 "für 3' einfügen. Diese Oligonukleotide können auch als Primer für die Sequenzierung des Einsatzes dienen.
   2. Zur Vorbereitung planen > 10 µg jedes pTEF-GBD-Derivat und pTEF-GBD allein um Material für die Sequenzierung und Hefe Transformationen.
   3. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: 3 min bei 98 ° C, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 98 ° C, 30 s bei 55 ° C und 2 min bei 72 ° C, gefolgt von 5 min bei 72 ° C mit einem Puffer mit 2,5 mM MgCl₂ , U/100 0,5 µL DNA Polymerase und proprietäre Buffer.

(3) Ausdruck von Fusionsproteinen Gal4-DNA-bindende Domäne

1. Zuständigen Hefe zu machen.
   1. Streifen aus PJ69-4A Hefe auf einen YPD-Teller mit einem sterilen hölzerne Applikator, Schaben 1 mm³ -80 ° c eingefroren Lager und rieb es sanft über die YPD-Platte. Die Platte verschieben Sie den hölzernen Applikator so dass jedem Durchgang in einen unberührten Teil der Medienoberfläche geht. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Machen Sie den gefrorenen Bestand an PJ69-4A Hefe durch Aussetzung Hefe in Wasser oder Wachstum Medien, Ergänzung mit DMSO auf 7 % und bei-80 ° c Lagern
   2. Eine einzige Kolonie in 5 mL Kultur der YPD in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr mit einer sterilen hölzernen Applikator zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min.
   3. 50 mL YPD in einem 250 mL sterile Erlenmeyerkolben mit 4 mL der Nacht Kultur der PJ69-4A Hefestamm zu impfen. Wachsen Sie in einem schütteln Inkubator bei 30 ° C, 200 u/min zu einer optischen Dichte (OD₆₀₀) von ca. 1,2 durch Spektralphotometrie mit einer standard 1 cm Schichtdicke bestimmt. Wachstum braucht in der Regel 5-7 h.
   4. Isolieren Sie Hefe durch Sedimentation in einer 50 mL konische Rohr 4.696 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Entsorgen Sie überstand von dumping in flüssigem Abfall. Mit einer Pipette, Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL Transformation Puffer und Transfer zum 15 mL konische Rohr. Resediment überstand verwerfen, und die Hefe in 1 mL der letzte Band der Transformation Puffer mit einer 1000 µL Pipette aufzuwirbeln.
   5. Hefezellen für 60 min. bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min inkubieren und dann für 30-90 min auf Eis legen.
2. Hefe-Plasmid-Transformation.
   1. Fügen Sie in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Schlauch 1 µg Plasmid pTEF-GBD-basierte und 5 µL 10 mg/mL Lachs Spermien Träger DNA-Lösung. Auch ein Röhrchen mit nur Lachs Spermien Träger DNA negative Veränderung zur Kontrolle. Jedes Rohr 100 µL Zellsuspension eiskalte Hefe mit Pipette hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL 70 % PEG-Lösung mit 1000 µL Pipette und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 5 - 10 mal (nicht Wirbel zu tun).
   2. Bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min für 45 min inkubieren.
   3. Hitzeschock bei 42 ° C für 15 Minuten.
   4. Sediment in einem Microcentrifuge 845 X g für 3 min bei Raumtemperatur, pipette aus überstand verwerfen, Aufschwemmen Pellet in 150 µL steriles Wasser von oben und unten pipettieren und über die Oberfläche eines CSM-Trp-Platte verteilt.
   5. Legen Sie Platten rechts oben in 30 ° C Brutschrank und inkubieren Sie für 2-3 Tage, bis die Kolonien sichtbar sind. Platten können umgedreht werden zur Vermeidung von Kondensation auf der Plattenoberfläche nach der Inkubation bei 30 ° C für 6 bis 12 h.
   6. Nehmen Sie 2-3 Kolonien pro Transformation und Streifen als Patch auf einem CSM-Trp-Teller mit einem sterilen Zahnstocher. Für 24 h bei 30 ° c wachsen lassen
3. Lysates für Protein-Expression zu machen.
   1. 3 mL CSM-Trp flüssiger Medien mit einer Spiel-Kopf-Größe von Hefe aus dem Patch zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr unter Schütteln bei 200 u/min. Machen Sie zwei Übernachtungen Kulturen pro Köder und leeren pTEF-GBD Vektor.
   2. 1 mL der YPD zu je 3 mL der CSM-Trp über Nacht Kultur hinzufügen. Für 1 h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min wachsen. Überprüfen Sie OD der Zellen durch Spektralfotometer.
   3. Sediment eine entsprechende Anzahl von Zellen, Normalisierung nach der OD. Verwenden Sie sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit eine 5 min Spritztour auf 2.348 x g bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um überstand verwerfen. Der Endbestand entspricht mindestens 2,1 OD.
      Hinweis: Bei der Berechnung der entsprechende Anzahl von Zellen kann es vorkommen, dass unterschiedliche Volumina aus jede Nacht Kultur, die minimale 2.1 OD zu erreichen erforderlich ist.
   4. Aufschwemmen Sie das Pellet in 450 µL 0,2 M NaOH durch pipettieren rauf und runter. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederausschleudern Sie Zellen für 2 min bei 2.348 x g bei Zimmertemperatur, und entsorgen Sie des Überstands mit Pipette.
   5. Aufschwemmen der Pellet mit 50 µL TWIRL Puffer durch pipettieren oben und unten vorsichtig Luftblasen nicht zu machen. Hitze-Probe für 5 min bei 70 ° C.
4. Suchen Sie nach Proteinexpression durch SDS-PAGE.
   1. Verwenden Sie eine gradient Gel von 4-20 % auf eine Vielzahl von Molekulargewichten sorgen gelöst werden kann. Last Gegenwert (gleiche OD) der Proben in einem SDS-PAGE gel und achten Sie darauf, mindestens eine Probe mit der unveränderten pTEF-GBD Vektor^13,14,15gehören.
   2. Übertragen Sie nach der elektrophoretischen Trennung Gel auf Nitrozellulose und Immunoblot mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörper Anti-Myc und ECL Angriffsermittlungslösung (Abbildung 3).

4. selbst Aktivierung Test

1. Streifen aus der MATalpha Hefe aus dem-80 ° C entspricht der Belastung die Beute-Bibliothek von Interesse auf einen Teller YPD durch eine sterile hölzernen Applikator, Schaben eine kleine Menge der Hefe aus der Flasche und Streifen sie über die YPD-Platte Gehäuse. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Ein Paare einzelne Kolonien auf einen Teller YPD Patch und Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
   Hinweis: Die neue Sorte entwickelte sich hier zu Haus Beute Bibliothek ist PLY5725, während einige kompatibel im Handel erhältlichen Y2H-Bibliotheken in Y187 untergebracht sind.
2. Folgen Sie die Anweisungen unter 3.3.1 - 3.3.4, PLY5725 mit LEU2zu verwandeln-basierte Plasmid verwendet, um die gewünschte Beute Bibliothek Haus. Für Bibliotheken entwickelte sich hier die entsprechenden Plasmid ist pGal4AD (pPL6343). Platte auf CSM-Leu-Met Teller Hefe transformanten wiederherstellen. Entstehen Sie nach Kolonien, Streifen als Flecken auf einen Teller CSM-Leu-Met und 24 h bei 30 ° c inkubieren
3. Befolgen Sie das Protokoll in 3.4 Ausdruck pPL6343 leerer Vektor mit anti-bestätigen-HA monoklonalen oder polyklonalen Antikörper und ECL-Erkennung-Lösung.
4. Streifen, die jeweils die transformierte PJ69-4A-Hefe in einem Kreuzmuster mit PLY5725 baut auf eine YPD-Platte, die bestätigt wurde, um Protein in Protokoll Abschnitt 3.4 und 4.3 express und über Nacht bei 30 ° C inkubieren. Nehmen Sie 1 mm³ Zellen, wo die beiden Stämme sind zusammengewachsen und patch auf, separate CSM-Leu-Met, CSM-Trp und CSM-Trp-Leu-Platten und 24 h zu wachsen.
   Hinweis: Gewünschte diploiden wachsen auf den CSM-Trp-Leu-Platten. Wachstum auf CSM-Leu-Met und CSM-Trp-Platten dienen als Positivkontrolle für Hefe Wachstum.
5. Wachsen Sie lassen in 1 mL der CSM-Trp-Leu Medien über Nacht bei 30 ° C. Sediment 500 µL Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 2.348 x g, 3 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Die Zellen in 1 mL sterilem Wasser aufschwemmen und Sedimentation und Wiederfreisetzung zu wiederholen. Überprüfen Sie die OD₆₀₀ Zellen.
6. Machen Sie eine Reihe von 01:10 serielle Verdünnungen von jedem Zellsuspension mit sterilem Wasser mit dem Ausgangspunkt die meisten konzentrierten Lösung von jeweils eine OD von 0,5. Spot 5 µL jeder Verdünnung auf einem CSM-Leu-Trp-Teller, CSM-Leu-Trp-seine Platte und ein CSM-Leu-Trp-seine + 3AT Platte. Bei 30 ° C inkubieren und untersuchen auf Wachstum täglich über 3 Tage (Abbildung 4).
   Hinweis: für die 01:10 serielle Verdünnung, pipette 10 µL des Rohres mit einem OD 0,5 in 90 µL Wasser und Mischen von pipettieren rauf und runter. Weiterhin 01:10 serielle Verdünnungen bis insgesamt sechs verschiedenen Konzentrationen zu erkennen gibt.

5. Erstellen Sie Hefe Populationen mit Köder und Beute-Bibliothek

Hinweis: Die Y187 Belastung, die kommerzielle Beute Bibliothek Plasmide Häuser nicht gut Paaren. Somit sind folgenden optimierte Bedingungen verpflichtet, Komplexität der Bibliothek zu wahren. Die PLY5725 belasten enthaltenden Y2H Beute Bibliotheken Kumpels besser und der gleichen Paarung Verfahren kann verwendet werden, bei dieser Sorte (Abbildung 5).

1. 3 mL der Kulturen aller der PJ69-4A transformanten tragen die verschiedenen TRP1zu impfen-mit pTEF-GBD Köder Plasmid in CSM-Trp-Medien in einem Kultur-Rohr. Gehören Sie zwei getrennte Kulturen mit pTEF-GBD Vector Plasmid allein, als verfahrenskontrollen dienen. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C, 200 u/min für 6 h und dann in ein 25 mL der Kultur in einem sterilen Erlenmeyer-Kolben für Übernachtung Wachstum verdünnen.
2. Tauen Sie ein Fläschchen gefroren (-80 ° C) die MATalpha Zellen, enthalten die LEU2-Ausführung "Beute" Bibliothek bei Raumtemperatur. 125 mL der CSM-Leu-Met Medien in eine sterile Erlenmeyerkolben mit der gesamten aufgetauten Durchstechflasche zu impfen. Alle Kulturen über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 200 u/min zu wachsen.
   Hinweis: Die OD₆₀₀ der Nacht Kulturen muss zwischen 1,0 bis 1,5 bevor Sie zu den nächsten Schritten fortfahren.
3. Zentrifugieren Sie 21 OD Entsprechungen der einzelnen PJ69-4A-Transformant-Kulturen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur. Für jede 10 Paarung Reaktionen auf Wunsch Pellet 39 OD₆₀₀ Entsprechungen der MATalpha Belastung tragen die Bibliothek Plasmide in separaten 50 mL konische Röhrchen.
   1. Zellen in 10 mL sterilem Wasser und neu pellet in neuen 50 mL konische Rohr 4.696 x g 5 min bei Raumtemperatur in einer Zentrifuge Benchtop aufzuwirbeln. Mit einer Pipette, Sie vorsichtig, den überstand ohne Unterbrechung die gebeizte Zellen zu entfernen.
   2. Aufschwemmen Sie Pellets PJ69-4A in 4 mL und PLY5725 Zellen in 10 mL bYPDA (pH 3,7).
4. Set-up fügen Paarung Reaktionen, Sie 1 mL PJ69-4A Zellen, 1 mL der MATalpha Bibliothek-haltigen Zellen und 1 mL bYPDA pH 3,7 bis neue 50 mL konische Rohr verwandelt. Bei 30 ° C mit sanften orbital Agitation (100-130 u/min) für 90 min inkubieren.
   1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g, bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette entfernen und erneut das Pellet in 2 mL 1:1 bYPDA:YPD. Platte auf einen 100 mm YPD Teller alle 2 mL mit Pipette und inkubieren Sie bei 30 ° C für ca. 20 h.
5. Ernte-Zellen von den YPD-Platten mit einer Zelle Schaber, um die Zellen in 2-3 mL der CSM-Leu-Trp Medien zu verdrängen. Pipette verdrängt Zellen in ein 50 mL konische Rohr. Spülen Sie die Platten 4-5 Mal mit 2-3 mL CSM-Leu-Trp Medien von oben, die die Medien mit einer 1000 µL pipette pipettieren und sanft Auswerfen der Medien über die Plattenoberfläche YPD.
   1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 40 mL der CSM-Leu-Trp Medien durch pipettieren rauf und runter (Do nicht Wirbel).
6. Zur Schätzung der Anzahl der diploiden Zellen gebildet, verdünnen Sie 4 µL der diploiden Mischung in 200 µL und 2000 µL CSM-Trp-Leu Medien. Platte 200 µL jeder Verdünnung auf einen Teller CSM-Leu-Trp.
   Hinweis: Die beiden Platten stellen eine 1: 10.000 und 1: 100.000 fache Verdünnung des Bestandes an diploiden geerntet und nachgiebig einem erwarteten ~ 9.000-27.000 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 nach Inkubation bei 30 ° C für 36-40 h Check Platten nach Schritt 5.7. Eine Mindestanzahl von 200 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 ist erforderlich, um zum Schritt 5.8
7. Sofort nehmen Sie den Rest von je 40 mL der Zelle Wiederfreisetzung und impfen Sie eine 1.000 mL Erlenmeyerkolben, 500 mL von CSM-Leu-Trp Medien enthält. Nehmen Sie eine anfängliche OD₆₀₀. Inkubieren Sie diese Flaschen bei 30 ° C mit schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung (~2.0 OD/mL). Dies dauert in der Regel ca. 36-40 h. Monitor Wachstum um 24 Uhr dann wieder bei 36 h OD₆₀₀.
8. Mit einer Pipette 20 mL Aliquote aller gesättigten 500 mL von Kulturen und Innoculate 2.000 mL Erlenmeyerkolben, ein mit 750 mL von CSM-Leu-Trp-Medien und die zweite mit 750 mL CSM-Leu-Trp-sein mit der niedrigsten 3AT entfernen, Hintergrund (vorher bestimmt in Abschnitt 4.5) beseitigt. Mischen Sie die neuen Kulturen (770 mL) gut durch Umschwenken und nehmen Sie eine erste OD₆₀₀.
9. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung, die in der Regel tritt innerhalb von 24 h für die nicht ausgewählten CSM-Leu-Trp-Kultur und kann über 70 h für Kulturen unter Auswahl für Y2H-Interaktionen.
10. Wenn Kulturen Sättigung (OD ~ 2.0) erreicht haben, entfernen Sie die Zellen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur 11 mL Pipette, Sediment zu, verwerfen Sie überstand, Pipette, und bei-20 ° C frieren Sie ein oder fahren Sie auf die DNA-Extraktion. Die ausgewählten und nicht ausgewählten Proben werden sowohl für die Tiefe Sequenzierung verwendet werden.

(6) Probenvorbereitung für DEEPN Deep Sequencing

1. DNA-Extraktion.
   1. Verwenden Sie eine Pipette, um Zelle Pellets aus Protokoll Abschnitt 5.7 in 500 µL Puffer sTE und Transfer zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln. Fügen Sie 3 µL Betamercaptoethanol und 10 µL des Zymolase bestand. Gut mischen und im Inkubator für 24-36 h 37 ° C inkubieren.
   2. Extrahieren Sie die Probe zwei Mal mit 500 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol während der Verwendung ein Dunstabzugshaube¹⁶.
   3. Fügen Sie 7 µL 4 M NaCl, 900 µL eiskalt 100 % Ethanol (ETOH), Mix durch Umkehrung und entweder frieren-20 ° C oder Sediment DNA durch Spinnen 21.130 x g für 10 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge weiter.
   4. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Waschen Sie die Pellets dreimal mit 900 µL 70 % ETOH.
   5. Sediment pellet 21.130 x g für 2 min und Rest ETOH-Waschanlagen mit Pipette zu entfernen. Trockene Pellets für 7 min bei 42 ° C.
   6. Aufschwemmen Pellet in 120 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Röhren alle 30 min. zu mischen.
   7. Pipette 60 µL der extrahierten DNA in eine sterile 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 120 µL sTE, 3,5 µL RNase A Lager, Flick zu mischen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
   8. Ethanol-Niederschlag wie bereits in Abschnitt 6.1.3 - 6.1.5, getan, sondern verwenden 7 µL 5 M Ammoniumacetat statt 4 M NaCl.
   9. Aufschwemmen RNase A-behandelte DNA in 55 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Rohre zu mischen alle 30 min. Quantify DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.
2. Fügt ein PCR cDNA.
   1. Führen Sie zwei, 50 µL PCR-Reaktionen pro DNA-Probe. Jede Reaktion enthält 25 Pmol jedes vorwärts und rückwärts Grundierung passend die Beute-Bibliothek-Plasmid (siehe Material). Reaktionen auch enthalten 25 µL der High-Fidelity-2 X PCR Master Mix, 5 µg DNA-Probe, und Wasser bis zu 50 µL. Amplify Reaktionen für 25 Zyklen mit Verlängerung von 3 min bei 72 ° C, einer Temperung Temperatur von 55 ° C für 30 s und bei 98 ° C für 10 S. vorauszugehen Denaturierung Radfahren durch eine 30 s Denaturierung bei 98 ° C und folgen mit einer 5 min Inkubation bei 72 ° C.
   2. Analysieren Sie 4 µL jeder PCR-Reaktion von 1 % DNA-Agarose-Gelelektrophorese mit DNA-Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr¹⁷. Visualisieren Sie DNA-Probe durch UV durchleuchtbaren. Beispiele zeigen, dass ein Abstrich der DNA etwa 1-3 kb, wo bandenmuster für Proben gefunden werden kann, wo war eine Y2H-Interaktion (Abbildung 6) ausgewählt.
   3. Doppelte PCR Proben zu kombinieren und mit dem PCR-Reinigung-Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und zu quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.

(7) deep sequencing

Hinweis: Probenvorbereitung und Sequenzierung auf eine Tiefe Sequenzierung-Plattform ist in der Regel in kommerziellen und akademischen DNA-Sequenzierung Kern Einrichtungen erhältlich.

1. Scher 600 ng PCR-Produktes mit einem Hochleistungs-Ultra-sonikator, die Fragmente von einer durchschnittlichen Länge von ~ 300 bp.
2. Generieren Sie indizierte Sequenzierung Bibliotheken mit ein vorbereitungssatz für tiefe Sequenzierung, die Linker Codierung Barcodes, Websites, Grundieren hinzufügt und erfassen Sie Sequenzen asymmetrisch an den Enden der DNA-Fragmente zu.
3. Durchführen Sie Bibliothek-Zubereitung nach Herstellerangaben. Pool indiziert Bibliotheken und Sequenz als lange gepaart Ende liest auf einer tiefen Sequenzierung Plattform (z. B. 2 x 150 bp PE gelesen). Die gewünschte Anzahl der Lesevorgänge für jede Probe gezielt liegt zwischen 10 und 40 Millionen, mit mehr liest, für den nicht ausgewählten Populationen, die in der Regel komplexer sind gewünscht. Es wird empfohlen, mindestens 20 Millionen oder mehr liest für die nicht ausgewählten Populationen.

8. Bioinformatic Verarbeitung und Prüfung

1. Prozess DNA Sequenzierung Daten in Form von Fastq mit einer Reihe von Stand-Alone-Software, die Programme gebaut, um die Karte (1) Reihenfolge gelesen, dass Dateien in einem universellen SAM-Format () (2) quantifizieren gen Bereicherung zwischen Datensätzen () (3) führen Sie statistische Analyse der Daten in Auftrag, welcher Kandidat Gene Rang sind positiv für Y2H Interaktion () 4) bieten Informationen, was positive Y2H Region(en) und welche translationale Rahmen der Beute cDNA pro gen-Fragmente ergeben Wechselwirkungen bestehen, und (5) Werkzeuge, nicht nur die 5' sondern auch die 3'-Ende der interagierenden Fragmente ermöglicht ihren Wiederaufbau und Überprüfung in einem traditionellen Y2H-Format zu rekonstruieren. Betrieb dieser Programme ist in der begleitenden Studie detailliert.

Ergebnisse

Die Y2H-Assay ist weit verbreitet für die Suche nach Protein: Protein-Interaktionen und mehrere Anpassungen und Systeme entwickelt worden. Zum größten Teil sind die gleichen Überlegungen, die helfen, Erfolg mit diesen früheren Ansätzen für DEEPN wichtig. Beispiele für wichtige Benchmarks: Ausdruck der DNA-bindende Domäne Fusionsproteine, gewährleisten einem niedrigen Hintergrund der unechten seine + Wachstum in der diploiden, enthält den Köder mit einer leeren Beute Plasmid, e...

Diskussion

Hier bieten wir Ihnen eine Anleitung für Y2H-Assays im Batch mit optimierten Methoden durchführen. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Verfahren um sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Hefe, die Auswahl unterstellt würde Vertreter der Start-Bibliothek ist, genug der Ausgangspunkt Hefe Bevölkerung dient zur Auswahl um Variabilität zu begrenzen zu unterziehen . Diese Benchmarks sind relativ leicht zu erreichen, neben der Anpassung der Methoden und Materialien für einen traditionellen Y2H-Assay, wodurch dieser...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100