JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Zararsız ve uzun-dönem için bir adım adım Protokolü vasküler remodeling ve gerçek zamanlı kültür iskele yıkımı biyobozunur polimer iskele tabanlı doku mühendisliği kan damarlarının pulsatil stimülasyon ile işlem izleme Optik koherens tomografi kullanılarak burada açıklanmıştır.

Özet

Yapısal ve mekanik özellikleri doğal kan damarları için benzer ile mühendislik vasküler Greftler atardamar bypass için artan talebi karşılamak için bekleniyor. Büyüme dinamikleri karakterizasyonu ve remodeling süreci parçalanabilir polimer iskele tabanlı doku mühendisliği kan damarlarının (TEBVs) pulsatil stimülasyon ile damar doku mühendisliği için önemlidir. Optik görüntüleme teknikleri vaskülarizasyon mühendislik doku yüksek çözünürlüklü görüntü gerçek zamanlı kültür etkinleştirme izleme için güçlü araçlar olarak göze çarpıyor. Bu kağıt bir zararsız ve hızlı gerçek zamanlı strateji büyüme izlemek için görüntüleme ve TEBVs uzun vadeli kültüründe optik koherens tomografi (OCT) kullanarak remodeling gösteriyor. Geometrik morfoloji vasküler remodeling süreci, duvar kalınlığı ve karşılaştırma TEBV kalınlıkta farklı kültür zaman puan ve pulsatil stimülasyon varlığı da dahil olmak üzere değerlendirilir. Son olarak, OCT veya gerçek zamanlı gözlem altında pulsatil stimülasyon reconstructing dokularda polimer bozulması için pratik olanakları sağlar tarafından değil ve her gemi segmentinde polimer bozulması kullanarak değerlendirmesi ile karşılaştırıldığında Tarama elektron microscopic(SEM) ve polarize mikroskop.

Giriş

Kan damarları (TEBVs) doku mühendisliği en umut verici malzeme bir ideal vasküler greft1' dir. Klinik olarak benzer yapısal ve işlevsel özellikleri olarak yerli gemiler ile yararlı olması için Greftler geliştirmek için bir çok teknik vasküler işlevi2,3korumak için tasarlanmıştır. Her ne kadar kabul edilebilir a_ılabilinirse oranları ile mühendislik damarları implantasyon sırasında ve faz III klinik çalışmada4, uzun vadeli kültür ve yüksek maliyet de TEBVs gelişimi izleme gerekliliği gösterir. Hücre dışı matrix(ECM) büyüme, yenileme ve uyum süreçlerinde TEBVs biomimetic kemoterapi-mekanik ortamında anlayış damar doku mühendisliği gelişimi için çok önemli bilgiler sağlar.

Küçük çaplı mühendislik damarları5 gelişimini izlemek için ideal strateji zararsız, steril, boyuna, üç boyutlu ve nicel olmalıdır. TEBVs farklı kültür koşullar altında bile değişiklikler öncesi ve sonrası damar nakli dahil olmak üzere bu görüntüleme yöntemi tarafından değerlendirildi. Mühendislik yaşam gemilerin özelliklerini açıklamak üzere stratejileri ihtiyaç vardır. Optik görüntüleme teknikleri görselleştirme ve miktar Biyomalzeme ve doku birikimi sağlar. Diğer avantajları ile yüksek çözünürlük6,7derin doku ve etiket içermeyen görüntülemede etkinleştirmek için olasılığı vardır. Ancak, görüntü özgü molekülleri ve daha az kolayca erişilebilir optik donanımları, gerçek zamanlı izleme için doğrusal olmayan optik mikroskobu kapsamlı uygulama sınırlı olan önemli bir pratik engel olur. Optik koherens tomografi (OCT) kardiyak girişimsel tedavi8rehberlik için bir çok kullanılan klinik araç olarak damar içi görüntüleme yöntemi ile optik bir yaklaşımdır. Literatürde, Ekim yöntemi TEBVs9,10damar doku mühendisliği araştırma için olumlu görüntüleme yöntemleri ile birleştiğinde, duvar kalınlığı değerlendirmek için bir yol olarak bildirildi. Dinamikleri vasküler mühendislik ise büyüme ve remodeling değil görülmektedir.

Bu makale, biyobozunur polimer iskele tabanlı TEBVs hazırlanması için dört hafta kültür ayrıntı. İnsan göbek arterlerin vasküler düz kas hücreleri (HUASMCs) genişletilmiş ve gözenekli parçalanabilir Poliglikolik Asit (PGA) iskele biyoreaktör içinde içine tohumlari. Biyobozunur polimerler doku mühendisliği için geçici bir substrat rolü oynamak ve bir belirli bozulma hızı11var. İskele bozulması ve neo-doku oluşumu arasında uygun bir eşleşme sağlamak için ECM ve PGA iskele etkili vasküler remodeling için çok önemli faktörlerdir. Perfüzyon sistemi yerli gemilerin biyomekanik microenvironment taklit ve tutarlı bir deformasyon basınç stimülasyon altında tutar.

Sunulan Protokolü amacı görüntüleme TEBVs ve uzun vadeli kültürünü izleme için nispeten basit ve zararsız bir strateji tarif etmektir. Bu iletişim kuralı görselleştirme morfolojik değişiklikler ve farklı kültür koşullar altında mühendislik gemilerin kalınlığı ölçümleri için yararlı olabilir. Ayrıca, polimer esaslı malzemeler bozulması iskele mühendislik doku analizleri için kimlik gerçekleştirilebilir. Elektron tarama yöntemleri birleştirerek microscopic(SEM) ve bu iletişim kuralı, korelasyon ve miktar hücre dışı matriks dağıtım ve PGA yıkımı kullanılan polarize mikroskop, hangi değerlendirilmesi iskele kolaylaştırabilir yapılabilir bozulma OCT görüntüleme ile birlikte.

Protokol

1. parçalanabilir PGA iskele doku mühendisliği damarları kültür dayalı

  1. PGA iskele imalatı
    1. PGA mesh (19 mm çap ve 1 mm kalınlığında) Etilen oksit (17 cm uzunluk, 5.0 mm çap ve 0.3 mm kalınlığında) tarafından sterilize silikon tüp etrafında dikmek 5-0 dikiş kullanarak.
    2. Politetrafloroetilen (ePTFE, 1 cm uzunluk) 4-0 dikiş üzerine her iki ucuna PGA mesh ile dikmek ve 2 mm tarafından üst üste.
    3. PGA İskele 1 mol/L NaOH 1 dk. için mesh kayma yapısını ayarlamak ve doku kültürü sınıf su 2 min için üç kez emmek için el ile daldırma. Yavaşça pat iskele kağıt mendil ile her zaman kuru. O zaman bir başlıklı bir körük için 1 h ile iskele kadar kuru.
  2. Biyoreaktör ve Y-Kavşak OCT görüntüleme için kurul
    1. Emmek geliştirilen cam silindirik biyoreaktör (10 cm çapında ve 11.7 cm yükseklik içinde dört dudakları ve dört yan kol Şekil 1' de gösterildiği gibi reaktör dışında), PGA iskele, silikon tüp (dış çapı 5 mm, kalınlık 0.3 mm), biyouyumlu tüpler, bağlayıcılar, heyecan bar ve derleme bir su tankında % 95 etanol 2s için donatımı.
    2. PGA iskele yan-silah konektörlü bir tarafı yanı sıra başka bir tarafı OCT embolisinin teslim etmek için kullanılan Y kavşak ile bağlı biyoreaktör üzerinden çek. Başka bir PGA iskele biyoreaktör olarak aynı şekilde bir araya getirin. Şekil 1' e bakınız.
    3. Biyoreaktör dudaklarına ePTFE 4-0 dikişler ile sıkma tarafından uygun.
    4. 1 h için tekrar etanol tankında biyoreaktör koymak ve üzerinde üfleyici ile örtünün geceleme kadar kuru.
  3. HUASMCs ve statik biyoreaktör Klima tohum
    1. HUASMCs insan umbilikal arterler standart explant teknikleriyle izole et.
    2. Genişletmek ve düz kas hücre büyüme orta hücrelerinde oluşan DMEM orta, % 20 fetal Sığır serum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL penisilin G, 50 µg/mL prolin, 20 µg/mL alanin, 50 µg/mL glisin, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL askorbik asit korumak , 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü ve 10 ng/mL trombosit-türevi büyüme faktörü.
    3. 5 × 106 hücre/mL PGA iskele üzerine yukarıdaki kültür ortamında bir konsantrasyon, tohum HUASMCs.
    4. Heyecan (1.5 cm uzunluk) bar biyoreaktör koymak. Gaz değişimi yoluyla silikon stoper kapak için bir besleme borusu (5 mm çapında, 15 cm uzunluk) ve üç kısa boru parçaları (5 mm çapında, 7 cm uzunluk) yerleştirin.
    5. PTFE 0,22 µm filtreler her hava değişimi tüp ve besleme borusu bir heparin kapağı takın. Karıştırma hızı dakikada 13 mermi olan heyecan bar ayarlayın. Cam biyoreaktör, silikon stoper kapak ve PGA iskele kültür sistemi monte.
    6. HUASMCs için 45 dk biyoreaktör yaslanmış tarafından bağlı kalmak için her 15dk birlikte, sol ve sağ için izin. Reaktör bağlantı noktaları ve eklem tüm parafin film ile mühürlendi.
    7. Luo bağlanmak-Ye pompa, PBS çanta, biyouyumlu tüp ile sürücü perfüzyon sistemi olarak. Tüpler PBS ile doldurmak için sürücüyü açın.
    8. Oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 genel biyoreaktör yerleştirin Kültür odası HUASMCs kültür orta 450 mL ile doldurulması.
    9. Durdur düğmesine basın ve sürücü aygıtın gücünü kapatın. Numaralı seribaşı iskele statik kültür altında bir hafta boyunca büyümeye.
    10. Kültür orta eski orta yoluyla besleme borusu ve taze kültür orta eşit miktarda ile reaktör dolumu yarısı aspirating tarafından her 3-4 gün değiştirin.
  4. Perfüzyon sistemi hazırlığı OCT görüntüleme
    1. Biyouyumlu tüpler aracılığıyla daha sonra tekrar çantayı dolaşımını PBS çanta içinde sıvı pompa.
    2. Sürücü gücünü açın ve pompa ayar 60 dövmek-de dakika ve çıkış sistolik basıncı 120 mmHg, frekans ile düzenleyen. Doku mühendisliği vasküler kültürü ihtiyaçlarına göre mekanik parametrelerini ayarlamak.
    3. İşe perfüzyon sistemi yapmak için Çalıştır düğmesini tıklatın. Yukarıdaki sabit pulsatil stimülasyon damarları 3 hafta için yinelemeli olarak statik kültür 1 hafta sonra biyouyumlu tüpler10,12 basınçlandırma tarafından sağlar.

2. performans Ekim ile optik görüntüleme

  1. 10-20μm Aksiyel çözünürlük ve görüntü derinliği 1-2 mm TEBV frekans etki alanı OCT intravasküler görüntüleme sistemi9tarihinde dayalı yapısını tanımlamak için emin olmak için bir ışık kaynağı kullanın.
  2. Güç geçiş açmak ve görüntü yakalama yazılımı açın.
  3. Fiber optik görüntüleme Kateter sürücü-motorlu ve optik denetleyicisi (DOC) kateter otomatik geri çekilme fonksiyonu ile bağlayın.
  4. 10 mm/s bir otomatik geri çekilme hızı ile resim alma hızı saniyede 10 kare için parametreleri ayarlama.
  5. Görüntüleme kateter Y-kavşak için heparin kap ile 18 G iğne ile ekleyin.
  6. Kateter silikon tüp içine yerleştirin ve PGA iskele biyoreaktör üzerine yüklemeden önce PGA örgü dikiş gerginlik tanımlar.
  7. Kateter ucu faiz bölge üzerinde yerleştirin. Geri çekilme aygıt ve onay için görüntü kalitesi8ayarlayın.
  8. Görüntüler 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 gün içinde kültür her bireysel TEBV için kazanmak ve sıralı olarak kaydetmek TEBV mikroyapı gerçek zamanlı gözlenmesi ile yüzey morfolojisi, iç yapısı ve kompozisyonu da dahil olmak üzere.
  9. Ölçüm için güvenilir ölçüm mühendislik gemilerin her zaman 3 kez tekrarlayın. Bir dizi görüntü yakalama yazılımı kullanarak test boyunca görüntü yakalama.

3. görüntüleme Analizi

  1. TEBV duvar kalınlığı ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. Analiz edilecek resmi seçin. TEBV iç tarafında yazılım tarafından otomatik olarak tanımlamak ve el ile dış yan kroki için izleme aracını tıklatın. Bir diyagramda kalınlıkta ekranda görünür.
  2. Ölçüm için yapıları, güvenilir ölçüm 5 kez tekrarlayın. OCT analiz için elde edilen bilgi kör iki bağımsız araştırmacılar tarafından gerçekleştirildi.

4. hasat TEBV ve doku işleme

  1. Açık belgili tanımlık silikon stoper kapak kültür sona erdiğinde biyoreaktör yerleştirilen ve kültür orta atın. Biyoreaktör ağzından ePTFE gevşetin ve silikon tüpler ePTFE dış tarafındaki makasla kesme. Biyoreaktör üzerinden TEBVs hasat ve elektron mikroskobu muayene tarama için bölümlere kesti.
  2. TEBVs geri kalanı alın ve 4 µm kalınlığında bölümlere kesti. Destekleyici silikon boruyu çıkarmak ve bölümler %4 paraformaldehyde ile düzeltin. Rutin histolojik Masson'ın trichrome boyama ve kolajen ve PGA10,13,14morfolojisi incelemek için kırmızı Sirius gerçekleştirin.
  3. PGA içerik ve kollajen bileşeni değerlendirmek Sirius kırmızı tarafından polarize mikroskop boyama ile histolojik örnekleri inceleyin. PGA kalıntıları açıkça birefringence belirlenmis ve kalan alan kesit alanı10tabanlı sayılabilir.

Sonuçlar

Üç boyutlu kültür sistemi biyoreaktör ve perfüzyon sistemi bir kapalı sıvı döngüsü10,13 (Şekil 1) ile bir kültür odasında oluşuyordu. OCT görüntüleme kateter Y kavşak distal uç eklenen ve görüntüleme için silikon tüp geri çekti. OCT görüntüleme ilk biyobozunur polimer iskele tabanlı TEBVs yapısal karakterizasyon sırasında biyoreaktör ekimi betimlemek için kullanıl...

Tartışmalar

Oluşturmak için gemi ile yapısal mühendislik ve mekanik özellikleri yerel kan damarları benzer klinik kullanım süresini kısaltmak için yol açabilir ve vasküler mühendislik amacıdır. Optik görüntüleme teknikleri kültür ve pozlama Greftler bir kültür ortamına boyunca bireysel yapıları kısırlık7ödün vermeden izlenemiyor mühendislik doku vasküler belirli bileşenleri, görselleştirme izin. Bu makalede, kültür odası perfüzyon sistemden ayrılır. Nispeten bağımsı...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser desteklemek için bilim ve teknoloji planlama projeyi Çin Guangdong Eyaleti (2016B070701007) kabul etmek istiyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PGA meshSynthecon
silicone tubeCole Parmer
connectorCole Parmer
intravascular OCT systemSt. Jude Medical, IncILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopicPhilipsFEI Philips XL-30
polarized microscopeOlympusOlympus BX51
suturesJohnson & Johnson
pulsatile pumpGuangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging softwareSt. Jude Medical, Inc

Referanslar

  1. Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
  2. Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
  3. Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
  4. Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
  5. Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
  6. Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
  7. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
  8. Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
  9. Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
  10. Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
  11. Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  12. Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
  13. Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
  14. Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
  15. Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
  16. Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
  17. Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
  18. Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 140biyom hendislikoptik koherens tomografidamar doku m hendisli iPoliglikolik Asitbiyolojikmekanik ko ullar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır