Oxigenación por membrana extracorpórea veno-venosa en un ratón

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que describe la técnica de oxigenación extracorporal veno-venosa de la membrana (ECMO) en una no intubados, espontáneamente respiración de ratón. Este modelo murino de ECMO puede implementarse con eficacia en estudios experimentales de aguda y enfermedades de la pulmón de fase final.

Resumen

El uso de oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO) ha aumentado sustancialmente en los últimos años. ECMO se ha convertido en una terapia fiable y eficaz para aguda así como enfermedades de la pulmón de fase final. Con el aumento de demanda clínica y el uso prolongado de ECMO, optimización de procedimientos y la prevención de daños en múltiples órganos son de vital importancia. El objetivo de este protocolo es presentar una detallada técnica de ECMO veno-venoso en un no-intubados, espontáneamente la respiración del ratón. Este protocolo demuestra el diseño técnico de la ECMO y pasos quirúrgicos. Este modelo murino de ECMO facilitará el estudio de la fisiopatología relacionada con ECMO (p. ej., inflamación, eventos hemorrágicos y tromboembólicos). Debido a la abundancia de ratones genéticamente modificados, los mecanismos moleculares implicados en las complicaciones relacionadas con el ECMO pueden también ser disecados.

Introducción

Oxigenación por membrana extracorpórea (OMEC) es un sistema de soporte de vida temporal que asume las funciones de los pulmones y el corazón para permitir la perfusión y el intercambio de gases adecuado. Hill et al¹ se describe el primer uso de ECMO en pacientes en 1972; sin embargo, sólo llegó a ser ampliamente utilizado después de su aplicación exitosa durante la pandemia de H1N1 en el 2009². Hoy en día, ECMO habitualmente se utiliza como un procedimiento para salvar vidas en fase final corazón y pulmón enfermedades³. ECMO veno-venoso es cada vez más empleada como alternativa a la ventilación mecánica invasiva en despierto, no intubados, respiración espontánea pacientes con insuficiencia respiratoria refractaria⁴.

A pesar de su adopción generalizada, se han reportado diversas complicaciones para ECMO^5,6,7. Las complicaciones que pueden ser experimentadas por los pacientes en ECMO incluyen sangrado, trombosis, sepsis, trombocitopenia, anomalías relacionadas con el dispositivo y embolia de aire. Por otra parte, un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (señores) dando por resultado daño en múltiples órganos es bien descrito clínico tanto en estudios experimentales^8,9. Complicaciones neurológicas tales como el infarto cerebral se divulgan con frecuencia en pacientes sometidos a terapia de oxigenación por membrana extracorpórea a largo plazo. Para confundir materias, a menudo es difícil distinguir si las complicaciones son causadas por ECMO sí mismo o surgen los trastornos subyacentes que acompañan la aguda y enfermedades de la fase final.

Para estudiar específicamente los efectos de ECMO en un organismo sano, se debe establecer un modelo animal experimental fiable. Hay muy pocos informes sobre el rendimiento de ECMO en pequeños animales y estan todas limitadas a las ratas. Hasta la fecha, ningún modelo de ratón de ECMO se ha descrito en la literatura. Debido a la disponibilidad de un gran número de cepas de ratón modificados genéticamente, establecimiento de un modelo de ratón ECMO permitiría mayor investigación de los mecanismos moleculares implicados en las complicaciones relacionadas con la ECMO^10,11.

Basado en el modelo murino descrita de puente cardiopulmonar (CPB)¹², hemos desarrollado un método estable para ECMO veno-venoso en no intubado, respiración espontánea ratones. El circuito ECMO (figura 1), que contiene la salida y cánulas de entrada, bomba peristáltica, oxigenador y depósito de la interceptación del aire, es similar al anteriormente descrito modelo de murino CPB¹² a excepción de un oscurecimiento más pequeño volumen (0.5 mL). Este protocolo muestra las técnicas detalladas, monitoreo fisiológico y gasometría arterial involucrado en un procedimiento acertado de la oxigenación por membrana extracorpórea.

Protocolo

Los experimentos fueron realizados en ratones C57BL/6 machos, de 12 semanas de edad. Este estudio se llevó a cabo en cumplimiento de las pautas de la ley Animal bajo protocolo TSA 16/2250.

1. preparación de materiales

Nota: Todas las medidas se realizan bajo condiciones limpias, no estériles. Condiciones estériles sería necesarias si el animal debe ser sobrevivió después de la operación.

1. Introducir 3 huecos en un tubo de poliuretano de 2 Fr usando una cuchilla quirúrgica en un microscopio con aumentos de 16.
   Nota: Todos los huecos deben ubicarse en el tercio distal de la cánula para el drenaje de sangre óptima.
2. Preparar la solución de cebado (Tabla de materiales). Incluyen 30 UI/mL heparina y 2,5% v/v de una solución al 8,4% de NaHCO₃. Refrigerar esta solución a 4 ° C hasta que esté listo para usar. Cebar el circuito con 500 uL de solución de cebado.
3. Coloque la cánula de salida en la solución de cebado y llenar la máquina ECMO encendiendo la bomba peristáltica. Seguir a circular la solución de cebado por la máquina para los próximo 30 min a un flujo de 1 mL/min.
4. Dar 0.5 L/min de oxígeno 100% para el oxigenador.

2. anestesia

1. Lugar el animal en una cámara de inducción llena con una mezcla de oxígeno/isoflurano 2.5% v/v. Proporcionar 0.5 L/min de oxígeno 100% para el vaporizador. Antes de la cirugía, revise que esa anestesia completa se consigue probando pedal reflejos de retirada y el dolor. Aplicar el gel del ojo para evitar daños del secado.
2. Use una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal a 37 ° C.
3. Realizar anestesia de máscara inhalatoria mediante un vaporizador de isoflurano e inyectar en forma subcutánea 5 mg/kg de carprofeno.
4. Observar la respiración espontánea y ajustar la concentración de isoflurano ello es entre 1.3 y 2.5% regularmente.

3. cirugía

1. Exponer la vena yugular izquierda mediante el uso de una incisión en la piel lateral de 4 mm con la ayuda de tijeras finas en el lado izquierdo del cuello. Junto con sharp y blunt preparación utilizando hisopos micro pinzas y algodón, usar coagulación bipolar de los vasos pequeños.
2. Una vez que se expone la vena yugular izquierda, ligar la parte distal usando una sutura de seda 8-0 con la ayuda de micro pinzas.
3. Lugar un nudo deslizante en el extremo proximal de la vena. Haga una incisión en la pared anterior de la vena utilizando micro-tijeras.
4. Para lograr la heparinización completa, inyectar heparina de 2,5 UI/g en la vena yugular mediante un braunula 26 G.
5. Levantar el lado principal de la almohadilla animal 30° para evitar la pérdida de sangre excesiva de la vena durante la inserción de la cánula.
6. Inserte una cánula de (PU) poliuretano 2-Fr en la parte proximal de la vena yugular, rotándolo ligeramente mientras que empuja a una profundidad de 4 cm; al hacerlo, se alcanzará la bifurcación iliaca de la vena cava inferior (IVC).
7. Fijar la cánula con nudos de seda 8-0 con Micro-pinzas.
8. Exponer la vena yugular derecha usando los pasos descritos en 3.1, 3.2 y 3.3.
9. Canule la vena yugular derecha con una cánula de PU 1-Fr y moverlo suavemente 5 mm en la dirección de la aurícula derecha.
10. Repita el paso 3.7.
11. Cateterizar la arteria femoral izquierda con otra cánula de PU 1-Fr y utilizarlo para presión invasiva, monitoreo y muestreo de sangre para gasometría arterial (BGA).
12. Insertar agujas de Electrocardiograma (ECG) conectadas a un dispositivo de adquisición de datos por vía subcutánea en ambos miembros anteriores y en la pared torácica izquierda.
13. Inserte un termómetro rectal, conectado a un dispositivo de adquisición de datos.

4. oxigenación por membrana extracorpórea Veno-venoso y gasometría arterial

Nota: Para un esquema del circuito ECMO completado, vea la figura 1.

1. Iniciar el ECMO en el animal por encender la bomba con un caudal inicial de 0,1 mL/min ajustar el caudal de la bomba dentro de los próximos 2 minutos 3-5 mL/min.
2. En caso de aspiración de aire en la cánula de salida a través del sitio de canulación, reducir el flujo y añadir 0,1 mL de solución de cebado del circuito a través de un depósito de la interceptación del aire.
3. Bajo flujo estable, continuar monitorear en tiempo real todos los parámetros vitales mediante el dispositivo de adquisición de datos.
4. Constantemente observar reflujo desde el drenaje venoso y el nivel de la sangre en el reservorio de aire-trapper.
5. Recoger sangre goteando de heridas en una jeringa de 1 cc con la punta de un 24 G branula andreturn al circuito de ECMO mediante el depósito de la interceptación del aire.
6. Para BGA, utilice un cartucho de muestra de sangre para recoger aproximadamente 75 μl de la sangre arterial en los siguientes puntos del tiempo y de las siguientes ubicaciones:
   1. 10 min después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la vena cava inferior mediante un tubo extra construido en antes del oxigenador, vía similar tubo extra después del oxigenador (control) y directamente de la arteria femoral.
   2. 30 min después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la arteria femoral.
7. Dar un extra 0,1 mL de la solución de cebado para compensar la pérdida de líquido intravasal cada 45 minutos por aire-trapper o catéter en la arteria femoral o aspirando las burbujas de aire a través de la cánula de drenaje de sangre.
8. Para BGA, utilice un cartucho de muestra de sangre para recoger aproximadamente 75 μl de sangre arterial:
   1. 1 h después del inicio de la oxigenación por membrana extracorpórea de la arteria femoral.
   2. 2 h después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la vena cava inferior mediante un tubo extra construido en antes del oxigenador, vía similar tubo extra después del oxigenador (control) y directamente de la arteria femoral.
9. Después de 2 h, reducir el caudal de la bomba poco a poco (a lo largo de 5 minutos), tal modo parar ECMO.
10. Continúe registrar parámetros vitales para otros 10 minutos.
11. Para finalizar el experimento exanguinante el animal y la recolección de la sangre y órganos.

Resultados

Este protocolo describe el método de ECMO veno-venoso en un ratón. Este modelo es confiable y reproducible y en comparación con nuestro modelo previamente descrito de CPB con paro respiratorio y circulatorio^12,13, es técnicamente menos exigente establecer.

Flujo ECMO en el sistema venoso se mantuvo entre 1.5 y 5 mL/min. Se mantuvo la presión arterial media entre 70 ...

Discusión

Hemos descrito previamente, un exitoso modelo de CPC en un ratón^12,13. Para implementar este modelo para aguda o trastornos de pulmón fase final hemos desarrollado un circuito ECMO veno-venoso de fácil de usar para los ratones. Diferentes al modelo del CPB, veno-venosas ECMO no requiere complicados procedimientos quirúrgicos como la esternotomía y pinzamiento de la aorta, reduciendo así el riesgo de sangrado de herida en un animal completamente heparinizado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before