Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Resumen

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Resumen

Una variedad de procesos biológicos implica las interacciones célula-célula, generalmente mediadas por las proteínas que interactúan en la interfaz entre células vecinas. De interés, sólo algunos ensayos son capaces de sondear específicamente tales interacciones directamente en las células vivas. Aquí, presentamos un ensayo para medir la Unión de las proteínas expresadas en las superficies de las células vecinas, en los contactos célula-célula. Este análisis consisten de dos pasos: mezcla de células que expresan las proteínas de interés unida a diversas proteínas fluorescentes, seguido por las medidas de espectroscopia de fluorescencia fluctuación en los contactos de la célula usando un láser confocal de barrido microscopio. Demostramos la factibilidad de este ensayo en un contexto biológico pertinente mediante la medición de las interacciones de la proteína amiloidea del precursor-como 1 (APLP1) a través de las ensambladuras de la célula. Ofrecemos protocolos detallados en la adquisición de datos usando técnicas basadas en fluorescencia (análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia, número de la correlación cruzada y análisis de brillo) y las calibraciones del instrumento requerido. Además, discutimos los pasos críticos en el análisis de datos y cómo identificar y corregir las variaciones de la señal externa, falsas, tales como debido al movimiento de fotoblanqueo o celular.

En general, el análisis presentado es aplicable a cualquier homo - o heterotípicos proteínas interacción en los contactos de la célula, las células de las misma o diferentes tipos y pueden implementarse en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Un requisito importante es la estabilidad del sistema, que debe ser suficiente para sondear la dinámica de difusión de las proteínas de interés durante varios minutos.

Introducción

Muchos procesos biológicos ocurren en los sitios de las interacciones célula-célula, por ejemplo, célula adhesión^1,2,3, célula fusion⁴ y reconocimiento celular⁵. Estos eventos son particularmente importantes durante el desarrollo de los organismos multicelulares y para la comunicación de la célula, por ejemplo, durante la respuesta inmune. Estos procesos son típicamente mediados por las proteínas que se localizan en la superficie, es decir, en la membrana plasmática (PM) de los vecinos de las células y....

Protocolo

1. Preparación: Célula mezcla ensayo

Nota: El siguiente protocolo describe el procedimiento de mezcla para células adherentes. Puede ser modificada para que las células cultivadas en suspensión.

1. Un número apropiado de células en una placa de 6 pozos, por ejemplo, 800.000 células HEK 293T (cuentan con una cámara de recuento de Neubauer), un día antes de la transfección de la semilla. El número puede ser modificado dependiendo del tiempo entre siembra y transfección y ajustado para otros tipos de células. Para realizar un experimento básico (es decir, proteínas de interés y control negativo), prepare por lo menos 4....

Resultados

Una primera prueba para el análisis de interacción de proteínas, es decir, mezcla de células que expresan proteínas fluorescentes espectralmente distintas seguidas por sFCCS/ccN y las mediciones de B (figura 1), debe realizarse en las proteínas que no se esperan que interactuar en el contacto célula-célula (es decir, un control negativo). Por lo tanto, se mezclaron células HEK 293T expresando myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-P.......

Discusión

El procedimiento experimental que se describe aquí permite la investigación de proteínas trans interacciones en los contactos célula-célula, empleando técnicas de espectroscopia fluctuación de fluorescencia, a saber sFCCS y ccN & B. Estos métodos implican un análisis estadístico de las fluctuaciones de la fluorescencia emitida por dos separados espectralmente FPs fusionado a la proteína de interés en un contacto de dos células vecinas, cada una expresando uno o la otra proteína de fusión. La prese.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110