Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Una variedad de procesos biológicos implica las interacciones célula-célula, generalmente mediadas por las proteínas que interactúan en la interfaz entre células vecinas. De interés, sólo algunos ensayos son capaces de sondear específicamente tales interacciones directamente en las células vivas. Aquí, presentamos un ensayo para medir la Unión de las proteínas expresadas en las superficies de las células vecinas, en los contactos célula-célula. Este análisis consisten de dos pasos: mezcla de células que expresan las proteínas de interés unida a diversas proteínas fluorescentes, seguido por las medidas de espectroscopia de fluorescencia fluctuación en los contactos de la célula usando un láser confocal de barrido microscopio. Demostramos la factibilidad de este ensayo en un contexto biológico pertinente mediante la medición de las interacciones de la proteína amiloidea del precursor-como 1 (APLP1) a través de las ensambladuras de la célula. Ofrecemos protocolos detallados en la adquisición de datos usando técnicas basadas en fluorescencia (análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia, número de la correlación cruzada y análisis de brillo) y las calibraciones del instrumento requerido. Además, discutimos los pasos críticos en el análisis de datos y cómo identificar y corregir las variaciones de la señal externa, falsas, tales como debido al movimiento de fotoblanqueo o celular.

En general, el análisis presentado es aplicable a cualquier homo - o heterotípicos proteínas interacción en los contactos de la célula, las células de las misma o diferentes tipos y pueden implementarse en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Un requisito importante es la estabilidad del sistema, que debe ser suficiente para sondear la dinámica de difusión de las proteínas de interés durante varios minutos.