Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.

Abstract

Stomatica movimento media lo scambio di gas della pianta, che è essenziale per la fotosintesi e traspirazione. Apertura e di chiusura stomatica sono compiute da un significativo aumento e diminuzione nel volume delle cellule di guardia, rispettivamente. Perché il servizio di trasporto di ioni e acqua avviene tra cellule di guardia e cellule epidermiche vicine più grandi durante il movimento stomatica, la distribuzione distanziata di stomi pianta è considerata una distribuzione ottimale per il movimento stomatica. Sistemi sperimentali per perturbare il modello distanziato di stomi sono utili per esaminare il significato del pattern spaziatura. Sono stati identificati diversi geni chiave associate alla distribuzione stomatica distanziata e stomi cluster possono essere sperimentalmente indotta alterando questi geni. In alternativa, gli stomi cluster possono essere anche indotta da trattamenti esogeni senza modificazione genetica. In questo articolo, descriviamo un sistema di induzione semplice per cluster stomi nei semenzali di Arabidopsis thaliana dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Il nostro metodo è facile ed è direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutante. Più grandi dei cloroplasti sono presentati come un marchio di garanzia biologico delle cellule delle cellule di guardia cluster indotta da saccarosio. Inoltre, un'immagine al microscopio confocale rappresentativa dei microtubuli corticali è indicata come un esempio dell'osservazione intracellulare delle cellule di guardia in cluster. L'orientamento radiale dei microtubuli corticali è mantenuto in cluster cellule di guardia come nelle cellule di guardia distanziate in condizioni di controllo.

Introduzione

Lo stoma di pianta è un organo essenziale per lo scambio di gas per la fotosintesi e traspirazione, e movimento stomatica è compiuto dai cambiamenti significativi nelle cellule di guardia attraverso l'assorbimento dello ione-driven e rilascio di acqua. Sotto un microscopio, possiamo osservare un modello di distribuzione distanziati di stomi sulle superfici delle foglie e steli. Questa distribuzione distanziata di stomi è considerata per aiutare il movimento stomatica, che è regolata da scambio di acqua e ioni tra cellule di guardia e vicine cellule epidermiche^1,2. Sistemi ad induzione sperimentale per cluster stomi sono utili per indagare l'importanza della distribuzione distanziata di stomi.

È stato segnalato che spatial clustering di stomi può essere indotta da modificazioni genetiche di geni chiave per la differenziazione delle cellule di guardia^3,4 o il trattamento con un composto chimico⁵. Abbiamo anche riferito che il trattamento ad immersione con una soluzione media completati con zuccheri tra cui saccarosio, glucosio, e fruttosio causato stomatica clustering in cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine⁶. Callosio ridotta in nuove pareti cellulari che separa meristemoids e cellule epidermiche è stata osservata nell'epidermide saccarosio-trattati cotiledone, suggerendo che il saccarosio soluzione immersione trattamento colpisce negativamente la parete cellulare, che impedisce la fuoriuscita e azione ectopica dei prodotti del gene chiave per la differenziazione delle cellule di guardia (ad es. fattori di trascrizione) verso adiacente epidermica cellule⁶. Un meccanismo simile è stato suggerito da studi sulla gsl8/chor mutanti^7,8. Il nostro sistema sperimentale per induzione riproducibile di stomi cluster utilizzando soluzione Media contenente saccarosio è abbastanza facile ed economico. Può anche essere utilizzato per indagare le strutture intracellulari come organelli e il citoscheletro nelle cellule di guardia del cluster quando applicato a linee transgeniche che esprimono marcatori fluorescenti che etichetta strutture intracellulari^{9, 10}.

Protocollo

1. preparazione della soluzione medio 3% contenenti saccarosio Murashige 1/2-Skoog

1. Aggiungere 1,1 g di sali medi Murashige-Skoog e 15 g di saccarosio in un becher.
2. Aggiungere 490 mL di acqua distillata e miscelare bene utilizzando una barra per l'agitazione.
3. Regolare il pH a 5,8 utilizzando KOH.
4. Diluire a 500 mL con acqua distillata e trasferire la soluzione in una bottiglia di media.
5. Sterilizzare la soluzione in autoclave (121 ° C, 20 min). Se non utilizzato immediatamente, questa soluzione può essere conservata a 4 ° C dopo la sterilizzazione.

2. induzione di cluster stomi da contenenti saccarosio immersione media di solubilizzazione

1. Sterilizzare i semi.
   1. Preparare la soluzione di sterilizzazione aggiungendo 500 µ l di cloro attivo 5% soluzione di NaClO e 1 µ l di 10% Triton X-100 per acqua sterile di 500 µ l.
   2. Posto ca. 50 transgenici semi di a. thaliana portando un marcatore fluorescente come CT-GFP¹¹ o GFP-TUB6¹² in una provetta da 1,5 mL.
   3. Aggiungere 1 mL di soluzione di etanolo 70% e mescolare bene capovolgendo cinque volte. Lasciare agire per 1 min.
   4. I semi affonderanno alla parte inferiore del tubo. Su un banco pulito, delicatamente rimuovere l'etanolo al 70% utilizzando una micropipetta e aggiungere 1 mL di soluzione di sterilizzazione. Mescolare bene capovolgendo cinque volte e lasciare per 5 min.
   5. Lavare i semi. Ancora lavorando in condizioni asettiche, un banco pulito, delicatamente rimuovere la soluzione utilizzando una micropipetta e aggiungere 1 mL di acqua sterile. Ripetere questo passaggio cinque volte.
2. Aggiungere 1,5 mL di sterilizzata 3% saccarosio-1/2 Murashige-Skoog medie soluzione contenente in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti su un banco pulito.
3. Aggiungere due semi sterilizzati in ciascun pozzetto. Nastro il coperchio sulla piastra 24 pozzetti utilizzando due strati di parafilm.
4. Trasferire la piastra a 24 pozzetti a un set di camera di crescita a 23,5 ° C con un ciclo luce-buio 12-h/12-h utilizzando 100 µmol m^{− 2} s^{− 1} bianco luce e incubare per 14 giorni.

3. microscopica osservazione di stomi cluster

1. Posto 30 µ l di 3% contenenti saccarosio di 1/2 Murashige-Skoog soluzione medio da un pozzetto della piastra 24-pozzo al centro del vetrino (dimensioni: 76 × 26 mm, spessore: 1.0-1.2 mm).
2. Rimuovere un cotiledone da un semenzale di 14-giorno-vecchio usando le forbici per dissezione. Galleggiante il cotiledone con il lato di osservazione rivolta verso l'alto la goccia di soluzione.
3. Preparare il campione di cotiledone seguendo il nostro metodo precedente¹³. Essenzialmente, porre 30 µ l della soluzione al centro di una copertura in vetro (dimensioni: 18 × 18 mm, spessore: 0.12-0.17 mm). Capovolgere il vetro di copertura e posizionarlo sul cotiledone delicatamente. Togliere il tampone in eccesso con un panno privo di lanugine.
4. Impostare un esemplare sul palco di un microscopio confocale e selezionare cluster cellule di guardia per osservazione usando illuminazione in campo chiaro.
5. Acquisire immagini confocal di strutture intracellulari fluorescente etichettati secondo le istruzioni del produttore del microscopio.

Risultati

Qui, è stato presentato il protocollo per un semplice metodo di induzione stomatica clustering con soluzione Media contenente saccarosio nei semenzali di a. thaliana . Le cellule di guardia cluster coltivate in soluzione Media contenente saccarosio (Figura 1B) hanno più grandi cloroplasti di guardia le cellule coltivate in condizioni di controllo privo di saccarosio (Figura 1A). L'alla...

Discussione

Abbiamo presentato protocolli per l'induzione di stomi cluster in a. thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Come mostrato qui, questo metodo è molto semplice e non richiede nessuna abilità specializzata ma efficiente può indurre gli stomi cluster. Oltre il 45% delle cellule di guardia sono raggruppati con 3% saccarosio-contenente soluzione medio (valori medi di più di 20 osservazioni indipendenti)⁶. Inoltre, questo sistema sperim...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Sumitomo Bakelite	MS-0824R
488 nm laser	Furukawa Denko	HPU-50101-PFS2
488 nm laser	Olympus	Sapphire488-20/O
510 nm long-pass filter	Olympus	BA510IF
524 - 546 nm band-pass filter	Semrock	FF01-535/22-25
530 nm short-pass filter	Olympus	BA530RIF
561 nm laser	CVI Melles Griot	85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filter	Semrock	FF01-624/40-25
Confocal laser scanning head	Yokogawa	CSU10
Confocal laser scanning head	Olympus	FV300
Cooled CCD camera	Photometrics	CoolSNAP HQ2
Image acquisition software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition software	Olympus	FLUOVIEW v5.0
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Type-F	ne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Inverted microscope	Olympus	IX-71
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	392-00591	Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens	Olympus	UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35	NA = 1.35
Objective lens	Olympus	UPlanAPO 40x / 0.85 NA	NA = 0.85
Sucrose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015