测量超极化 [1-13C]硫化的旋转-莱迪兹松弛磁场依赖性

摘要

提出了一种利用快速场循环松弛测定法，利用动态核极化方法超极化^的13种C富集化合物自旋晶格松弛时间的磁场依赖性。具体来说，我们已经^用[1-13C]丙酮进行了演示，但该协议可以扩展到其他超极化基板。

摘要

超极^化13C富集化合物在体内成像应用的基本限制是其有限的自旋晶格松弛时间。影响松弛速率的各种因素，如缓冲液成分、溶液pH、温度和磁场。在最后一方面，自旋晶格放松时间可以测量临床场强度，但在较低的领域，这些化合物从偏振器中分配并输送到MRI，松弛更快，难以测量。为了更好地了解运输过程中磁化损失的数量，我们采用快速场循环松弛测量法，在±0.75 T时^对13C核进行磁共振检测，以测量超极化 [1-¹³C]丙酮的自旋晶格松弛时间。溶解动态核极化用于在浓度为80 mmol/L和生理pH（±7.8）下产生超极化的丙酮酸盐样品。这些溶液被迅速转移到快速场循环松弛计，以便使用校准的小翻转角度（3°-5°）测量样品磁化的松弛度作为时间的函数。为了绘制丙酮酸的C-1的T1色散图，我们记录了介于0.237 mT和0.705 T之间的不同松弛场的数据。利用这些信息，我们确定了一个经验方程，以估计上述磁场范围内超极化基板的自旋晶格松弛。这些结果可用于预测传输过程中磁化损失的数量，并改进实验设计，以尽量减少信号损耗。

引言

磁共振光谱成像（MRSI）可以生成光谱成像检测到的代谢物的空间图，但其实际应用往往受到其灵敏度相对较低的限制。这种体内磁共振成像和光谱方法的低灵敏度源于在体温下可实现的少量核磁化和合理的磁场强度。然而，通过使用动态核极化（DNP）来大大增强液体基质的体外磁化，从而利用MRSI^1，2，这种基质被注射到体内代谢中去探索，从而克服这一限制。^,3,4. DNP能够增强大多数核的磁化，具有非零核自旋，并用于^提高13种C富集化合物（如丙^酮5、6、碳酸氢碳酸盐）^{的体内MRSI敏感性7、8、}富^马9、乳^酸10、谷氨^酰胺11等，超过4^级12级。其应用包括血管疾病^{成像 13，14，15，}器官灌注^{13，16，17，18，}癌症检测1，19，20，21，22，肿瘤分^{期23，24，}并量化治疗反应2^{,6,23,24,25,26}.

缓慢的旋转晶格放松对于MRSI体内检测至关重要。对于溶液中小分子中陀螺比低的原子核，旋转晶格松弛时间（T₁s）在数十秒之间是可能的。几个物理因素影响核自旋过渡与其环境（晶格）之间的能量转移，导致松弛，包括磁场强度、温度和分子构^象27。在分子中减少双极松弛，没有直接连接质子的碳位置，溶解介质的分解可以进一步减少分子间双极松弛。不幸的是，脱化溶剂在体内扩展放松的能力有限。由于化学移位各向异性，在高磁场强度下，碳基酸或碳化物酸（如丙酮酸）的松弛度会有所增强。极化后溶解过程中流体路径中存在的顺磁杂质会导致快速松弛，需要使用夹子避免或消除。

在低场^中，13种含C化合物的松弛数据非常少，在低场中，自旋晶格的松弛速度会明显加快。然而，在低磁场测量T1，以了解在制备用于体内成像的制剂时的松弛，很重要，因为超极化造影剂通常是从靠近或位于地球的DNP仪器中分配的。领域。其他物理因素，^如13C富集基板浓度、溶液pH、缓冲液和温度也会影响松弛，从而对制剂的配方产生影响。所有这些因素对于确定优化 DNP 溶解过程的关键参数以及计算样品从 DNP 设备到成像磁体过程中发生的信号损耗量至关重要。

核磁共振分散 （NMRD） 测量，即T₁测量，作为磁场的函数，通常使用 NMR 光谱仪获得。为了获得这些测量，可以使用一种穿梭方法，当样品首先从光谱仪中穿梭出来，以在由其在磁^{体28、29、30}边缘场中的位置决定的某个场中放松然后迅速移回 NMR 磁体以测量其剩余的磁化。通过在磁场中在同一点重复这个过程，但随着松弛时间的延长，可以得到一条松弛曲线，然后可以对其进行分析以估计T1。

我们使用一种称为快速场循环松弛测量31，32，33的替代技术来获取我们的NMRD数据。我们修改了商业场循环松弛计（见材料表），用于T1测量含有超极^化13C核的溶液。与穿梭方法相比，场循环使该松弛计能够在较小的磁场范围（0.25 mT 至 1 T）上系统地获取 NMRD 数据。这是通过快速改变磁场本身，而不是磁场中的样品位置来实现的。因此，样品可以在高场强度下磁化，在较低的场强度下"放松"，然后在固定场（和Larmor频率）上采集自由感应衰减以最大化信号。这意味着样品温度可以在测量过程中控制，NMR 探头不需要在每个松弛场进行调谐，以便在整个磁场范围内自动采集。

本工作专注于在低磁场下分配和运输超极化溶液的影响，提出了使用快速测量超极^化13C-硫化酸盐的自旋晶格松弛时间的详细方法磁场循环松弛测量，磁场范围为0.237 mT至0.705 T。使用这种方法的主要结果以前曾提出过[1-13 C]丙酸^酯34和13C富集钠和碳酸氢^钠35，其中其他因素，如基质浓度和溶解pH具有也进行了研究。

研究方案

1. 样品制备

注:步骤 1.1-1.8 只执行一次

1. 制备1 mL的^库存13C富聚丙酸溶液，广泛用于体内研究1，2，5，6，包括15-mmol/L的三氧化二甲酸溶解在+1-¹³酸（见材料表）。此库存溶液中的等分将用于将单独极化的样品，随后在不同磁场进行松弛测量。^[1-13C_pyruvic酸分子的表示形式》如图1所示。
2. 在动态核偏振器软件界面（见材料表）上，点击冷却按钮将可变温度插入（VTI）的温度降至1.4K。
3. 一旦 DNP 达到所需温度，将库存溶液的 10 μL 加载到样品杯中，打开炮塔门，并使用专为此任务设计的插入棒将杯插入 VTI。
4. 之后，快速取出魔杖，确保杯子被释放。然后关闭炮塔门，在 VTI 温度回到 1.4 K 时继续以下步骤。
5. 准备 DNP 运行微波扫描，以便找到用于库存解决方案超极化的最佳 RF 频率。
   1. 在控制光谱仪（DNP 系统的一部分）的计算机上，通过双击超终端图标（以前配置了适当的串行通信）建立光谱仪和 DNP 控制软件之间的通信参数。
   2. 建立通信后，启动 RINMR 软件，键入其命令行。HYPERSENSENMR，然后按进入。
   3. 之后，屏幕上将显示一个新窗口，并在"配置编号"字段中键入第 1 号 （1）。然后，单击"选择配置"按钮。
   4. 点击按钮做微波扫描。将启动一个小窗口，该窗口具有秒降计数器，指示光谱仪已准备就绪，它将等待来自 DNP 控制软件的定期触发信号来采样极化。
   5. 在 DNP 控制软件上，选择"校准"选项卡，然后单击"生成"按钮。
   6. 使用校准设置窗口，输入以下信息:起始频率 = 94.117 GHz，结束频率 = 94.137 GHz，步长 = 1 MHz，步长 = 300 s，功率 = 50 mW，液氦级别 = 65%，温度 = 1.4 K。
   7. 单击"生成"按钮，该按钮将关闭设置窗口并返回到"校准"选项卡，该选项卡将显示执行所需微波扫描所需的步骤数和时间。
   8. 达到所需的 VTI 温度后，单击"启用"按钮，然后开始初始化微波扫描过程。
6. 在微波扫描结束时，回收样品并记录实现最大极化的最佳频率。此最佳频率定义为提供最大极化的极化频率，如图2所示。此频率将用于超极化从热鲁维酸特定库存溶液中获得的所有等分。
7. 在去离子水中使用40mmol/L Tris碱基溶液、50 mmol/L氯化钠和80-mmol/L氢氧化钠溶液制备250 mL的库存溶解介质。在浓度为100mg/L时加入乙烯二甲酸（EDTA），以隔离任何金属组胺污染。与pyruvic酸库存溶液类似，这种溶解介质将用于所有将极化的不同样品。有关所用化学品的更多具体细节，请参阅材料表。
8. 此外，准备500 mL的库存清洁溶液，包括100mg/L EDTA溶解在去离子水中。每次极化后，使用此清洁溶液的大约 10 mL 来清洁 DNP 的溶解路径。
   注:步骤 1.9-1.27 针对每个单独的示例执行。
9. 通过按下 DNP 主窗口中的冷却按钮，将 DNP 装置冷却至 1.4 K，以准备超极化 [1-¹³C]丙酸样品。
10. 如果用于光谱仪的软件已在选中配置1时处于活动状态，请继续执行以下步骤。否则，请执行步骤 1.5.1 到 1.5.3，然后继续执行以下步骤。
11. 在控制 DNP 光谱仪的窗口中验证配置1是否被选中后，单击"实体生成"按钮。
12. 输入文件名 SSBuilupXXX，其中"XXX"是存储与累积数据的文件序列中的一个数字。此数字由软件自动递增。然后单击"确定"。与微波扫描情况类似，将启动一个小窗口，其值为秒数，指示光谱仪已准备就绪，并将等待来自 DNP 控制软件的定期触发信号来采样极化.
13. 使用步骤 1.1 中制备的 pyruvic 酸 - OX063 库存溶液，在样品杯中称量 30 mg。
14. 当达到所需的 VTI 温度 （1.4 K） 单击插入样品，然后选择"普通样本"，然后单击"下一步"。按照屏幕上显示的安全预防措施，使用专为此任务设计的长棒将杯子插入冷 DNP 设备中。
15. 插入杯子后，将魔杖取下，DNP 门关闭，单击"下一步"，然后完成。此时，超极化系统将样品杯降至部分填充的辐照室（65%）与液氦。
16. 等待温度恢复到 1.4K，然后单击"极化采样"按钮。
17. 在新的弹出窗口中，将频率值设置为从步骤 1.6 中微波扫描获得的频率值。在同一窗口中，还将功率设置为 50 mW，采样时间设置为 300 s。单击"下一步"，选中"启用累积监视"框，然后单击"完成"。
    注:一旦极化启动，DNP控制软件每 300 度生成触发信号，指示光谱仪使用小尖端角度对极化进行采样。这样，光谱仪软件向固态磁化曲线添加采样点，现在显示在光谱仪软件和选项卡极化累积下的 DNP 控制软件中。在第 4 个样本和之后的每个样本之后，光谱仪软件将曲线适合窗体的指数增长函数:
    
    S = A +exp （-t/t_p） = y₀
    
    其中A是极化振幅，以任意单位表示，t是采样时间，Tp 是极化时间常数（均以秒为单位），y0 是偏移量。根据拟合参数，软件还计算到该时间点达到的百分比极化，该百分比也显示在 DNP 的极化状态选项卡中。
18. 极化，直到固态磁化的累积达到最大（约一小时）的至少 95%。
19. 当样品偏振时，请准备快速场循环放松计，如下所述第 2 节。
20. 当达到所需的极化时，单击"运行溶解"，并在"方法"下选择Pyruvic 酸测试。然后，单击"下一步"。
21. 按照屏幕上的说明，打开 DNP 炮塔门，用第 1.5 节中制备的 4.55 mL 的溶解介质加载设备顶部的加热和增压室，在 1.5 节中产生 80-mmol/L 丙酮的浓度pH值为±7.75，温度为+37°C。
22. 将回收的魔杖放置在正确的位置，关闭炮塔门，并在计算机单击"下一步"，然后单击"完成"。此时，溶解介质将过热，直到压力达到 10 bar。
23. 一旦达到10bar压力，冷冻和超极化的丙酮会自动从液氦浴中取出，快速混合，并与过热的溶解介质解冻，并通过毛细管喷射成梨形烧瓶。当超极化的丙酮/溶解介质混合物被喷射时，不断旋转烧瓶以确保均匀的混合物。
24. 当所有混合物被喷射出时，迅速将1.1 mL的液体抽入注射器，转移到预加热（37°C）10毫米直径的NMR管中，并迅速输送到场循环松弛计（参见步骤2.2.12）。
25. 将每个丙酮溶解物的剩余等分分配到0.55-T台式NMR光谱仪（见材料表），以检查可能的系统性实验效果。
26. 立即使用清洁溶解介质清洁 DNP 流体路径，然后使用乙醇。通过流体路径吹气，以清除剩余的清洁液并清除氧气。清洁所有玻璃器皿。
27. 每次测量后，记录台式顶部光谱仪和场循环松弛计样品的pH值。
    注:每个T1测量都是从 DNP 装置分离的超极化溶解，因此需要注意确保样品成分的测量与测量的可重复性。这是通过称量所有剂和溶剂，精度为0.1毫克，以确保准确和可重复的制备最终超极化溶液来实现。

2. 放松测量

注意:请参阅表 1，以便更好地了解以下步骤中描述的不同参数的选择和使用。在溶解之前，必须计算松弛计翻转角度，并且必须设置松弛计并准备好测量超极化溶液（见下文）。

1. 翻转角度校准
   1. 在 NMR 管中制备 1 mL 的整洁 [1-¹³C]丙酸，并加入高岭土造影剂，将¹³C 核的T₁减小到小于 200 ms 但超过 50 ms 的值。
   2. 密封 NMR 管，以便可以多次用作校准标准。
   3. 使用松弛计的深度计，将 NMR 管的插入深度设置为适当的高度，以确保样品位于松弛计 RF 线圈的中心。
   4. 用胶带标记¹³C 丙酮校准标准的插入深度，以确保可重复性。
   5. 将 NMR 管上的深度塞置于胶带指示的位置，并将此校准标准插入场循环松弛计的孔中。使用重量使 NMR 管保持在位。
   6. 打开仪表空气阀，从松弛计前面板将温度控制器设置为 37°C。在实验过程中，使用加热空气将样品温度保持在37°C（±0.5°C）。
   7. 设置场循环放松计硬件，^获取13C核信号。这包括安装外部盘片线圈并通电（参见材料表），调整和匹配RF线圈至8 MHz（13C核为±0.75 T），并使用适当的+/4电缆。
   8. 在仪器软件中，执行以下步骤:
      1. 选择主面值选项卡
      2. 单击标签"实验"旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动以选择脉冲序列"13CANGLE"。FFC".
      3. 设置以下采集参数:RFA = 5;SWT = 0.005，RD = 0.5，BPOL = 30 MHz，TPOL = 0.5。
      4. 选择"基本"par选项卡，然后选择"基本子"选项卡。
      5. 单击标签"Nucleus"旁边的单元格，然后向下滚动弹出窗口以选择13C。
      6. 然后，设置以下参数:SF = 8 MHz，SW = 1000000，BS = 652，FLTR = 100000，MS = 32。
      7. 选择"Conf"子选项卡。
      8. 设置以下参数:RINH = 25，ACQD = 25。
      9. 选择nDim子选项卡
      10. 设置 NBLK = 32，BINI = 2，BEND = 62。
      11. 选择"评估"选项卡，然后选择"参数"子选项卡。
      12. 设置以下参数:EWIP = 10，EWEP = 128，EWIB = 1，EWEB = 32。
      13. 然后，单击"开始采集"图标以运行脉冲序列。
   9. 采集完成后，保存数据，选择"评估"对话框图标，并从分析菜单中选择WAM 窗口:绝对量级。然后选择报表、图表和导出文件，最后单击"执行"。
   10. 在"报告"窗口中，找到提供最大振幅的 RF 脉冲宽度，并在显示的图形中光标的帮助下微调该值，这与图 3底部行所示的绘图类似。此脉冲宽度将用于以下实验的参数 PW90。
   11. 单击F1图标可调整放松计的频率偏移。
       注:WAM 窗口:绝对量级是将单个或一系列自由感应衰减采集 （FID） 的大小从EWIP定义的点到EWEP指定的点和块的过程由EWIB定义为EWEB指定的块。
2. T₁- 测量
   1. 确保安装外部盘装线圈并通电。
   2. 在仪器软件中执行以下步骤:
      1. 选择主面值选项卡
      2. 单击标签"实验"旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动以选择脉冲序列HPUB/S，如图4所示。
      3. 设置以下采集参数:RFA = 25，T1MX = 介于 3 和 5 之间的值;SWT = 0.2，RD = 0，BRLX = 所需松弛场（质子 Larmor 频率）。
      4. 选择"基本"par选项卡，然后选择"基本子"选项卡。
      5. 单击标签"Nucleus"旁边的单元格，然后向下滚动弹出窗口以选择13C。
      6. 然后，设置以下参数:SF = 8 MHz，SW = 1000000，BS = 652，FLTR = 50000。
      7. 选择"Conf"子选项卡。
      8. 设置以下参数:PW90 等于步骤 2.1.10 中的值，RINH = 25，ACQD = 25。
      9. 选择脉冲子选项卡并设置 PW = 5。
      10. 选择nDim子选项卡并设置 NBLK = 100。
      11. 等待并准备好接收超极化解决方案以启动数据采集。
      12. 在将样品插入松弛计之前，请从控制台手动启动脉冲序列，以避免将样品插入空磁场中。因此，在数据分析期间忽略第一个自由感应衰减 （FID） 非常重要。
      13. 采集完成后，单击"保存"按钮保存数据。
   3. 使用分析软件，集成每个 FID 信号的大小，以生成由采样磁化作为时间函数的数据系列。
   4. 使用商业分析软件中实现的标准非线性最小二乘拟合算法（参见材料表），假设甚至加权，从三参数指数模型中提取自旋晶格松弛时间所有数据:
      
      其中A是初始信号振幅（y-截距），T ₁是自旋格松弛时间，T _R是重复时间，这是一个已知值，y ₀是信号偏移，和cos^（n-1）（*）是在第n测量时为翻转角度的纵向磁化损失的校正， =。

结果

图2给出了一个高分辨率全范围微波扫描热柳酸的例子。对于所呈现的情况，最佳微波频率对应于图中突出显示的 94.128 GHz。我们的 DNP 系统通常可在 93.750 GHz 到 94.241 GHz 的范围内工作，步长大小为 1 MHz，极化时间可达 600 s，功率高达 100 mW。只针对新型基板研究全范围频率。然而，根据之前^对13个C-pyruvic酸的经验，我们预计最佳频率在94.127GHz左右。因此，通常使用 94.11...

讨论

使用DNP增强信号采集是一种技术解决方案，^解决13C核在有限浓度下产生的磁共振信号不足，就像动物注射中使用的一样，但也带来了其他实验挑战。图 7所示的每个松弛测量值都表示对独特制备样品的测量，因为它在溶解后不能重新极化以进行重新测量。由于样品和溶解介质在称重过程中样品制备的微小差异，或溶解过程本身的变化（如样品的不完全提取和彻底混合...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-13C]Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	677175
10mm NMR Tube	Norell, Inc., Morganton NC, USA	1001-8
De-ionized water
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer	Oxford Instruments, Abingdon, UK		Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software
MATLAB R2017b	MathWorks, Natick, MA		Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid.
OX063 Triarylmethyl radical	Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH meter - SympHony	VWR International, Mississauga, ON., Canada	SB70P
ProHance	Bracco Diagnostics Inc.		Gadoteridol, Gd-HP-DO3A
Pure Ethanol (100% pure)	Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada	P016EAAN
Shim Coil			Developed in-house
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S8045
SpinMaster FFC2000 1T C/DC	Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy		Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper.
Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7943