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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se proporciona en detalle una serie de métodos para determinar la tasa potencial de DNRA basada en 14análisis NH4+/15NH4+. NH4+ se convierte en N2O a través de varios pasos y se analiza utilizando cromatografía de gases cuadrúpedos-espectrometría de masas.

Resumen

La importancia de entender el destino del nitrato (NO3o),−que es la especie N dominante transferida de los ecosistemas terrestres a los acuáticos, ha ido aumentando porque las cargas mundiales de nitrógeno han aumentado drásticamente tras la industrialización. La reducción disimilizante de nitratos a amonio (DNRA) y la desnitrificación son procesos microbianos que utilizan NO3para la respiración. En comparación con la desnitrificación, las determinaciones cuantitativas de la actividad de la DNRA se han llevado a cabo sólo en una medida limitada. Esto ha llevado a una comprensión insuficiente de la importancia de DNRA enlas transformaciones NO3y los factores reguladores de este proceso. El objetivo de este documento es proporcionar un procedimiento detallado para la medición de la tasa potencial de DNRA en muestras ambientales. En resumen, la tasa potencial de DNRA se puede calcular a partir de la tasa de acumulación de amonio con etiqueta N de 15(15NH4+) en 15NO3- incubación añadida. La determinación de las 14concentraciones NH4+ y 15NH4+ descritas en este documento se compone de los siguientes pasos. En primer lugar, el NH4+ en la muestra se extrae y se atrapa en un filtro de vidrio acidificado como sal de amonio. En segundo lugar, el amonio atrapado se elue y se oxida a NO3a travésde la oxidación del persulfato. En tercer lugar, el NO3se convierte en N2O a través de un denitrificador de deficiencia de N2O reductasa. Finalmente, el N2O convertido se analiza utilizando un sistema de cromatografía de gases de cuadrúpedo-espectrometría de masas previamente desarrollado. Aplicamos este método a los sedimentos de marismas y calculamos sus tasas potenciales de DNRA, demostrando que los procedimientos propuestos permiten una determinación simple y más rápida en comparación con los métodos descritos anteriormente.

Introducción

La síntesis artificial de fertilizantes nitrogenados y su aplicación generalizada han perturbado enormemente el ciclo global del nitrógeno. Se estima que la transferencia de nitrógeno reactivo de los sistemas terrestres a los costeros se ha duplicado desde tiempos preindustriales1. Una porción significativa de los fertilizantes aplicados a un campo determinado se lava lejos del suelo a los ríos o aguas subterráneas, principalmente como NO3a 2. Esto puede causar problemas ambientales como la contaminación del agua potable, la eutrofización y la formación de hipoxia. NO3en ambientes de agua se elimina o se retiene en el ecosistema a través de la asimilación biológica y varios procesos de disimilación microbiana. Se sabe que la desnitrificación y el anammox son los principales procesos de eliminación microbiana para NO3.− La desnitrificación es la reducción microbiana de NO3a los productos N gaseosos (NO, N2O y N2)junto con la oxidación de un donante de electrones, como las sustancias orgánicas, reduciendo así el riesgo de los problemas antes mencionados. Anammox también produce N2 a partir de NO2o− y NH4+; por lo tanto, elimina N inorgánico de un ecosistema. Por el contrario, DNRA trabaja para retener N en un ecosistema; generalmente se acepta que DNRA se realiza principalmente por bacterias fermentativas o bacterias quimiolitoautotróficas y que reducen el disimilario NO3a BIOdisponible y menos móvil NH4+.

Los estudios sobre DNRA se han realizado principalmente en ecosistemas marinos o estuarinas, como sedimentos oceánicos o estuarinas y agua, tierra de marisma sal o salobre, y suelo de manglar. Los ecosistemas costeros o marinos son importantes como reservorios para eliminar NO3de los ecosistemas terrestres, y en estudios anteriores se ha demostrado que DNRA contribuye en una gama muy amplia deeliminación de NO3(0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,,15,16,17,18.14 Además, la existencia de DNRA se ha demostrado en una amplia gama de ambientes, incluyendo ambientes de agua dulce19,suelos de arroz20,y suelos forestales21. Si bien estos estudios han demostrado que DNRA es potencialmente comparable a la desnitrificación para laeliminación de NO3,los estudios que miden la actividad de DNRA son todavía muy limitados en comparación con los que miden la desnitrificación.

La tasa DNRA se ha evaluado utilizando 15técnicas de etiquetado N junto con el análisis de datos a través de modelos analíticos o numéricos. Una solución analítica para calcular la tasa DNRA se basa en el aumento en el enriquecimiento de 15N de la piscina NH4+ después de la adición de 15NO3como trazador. 15 Se añade N-etiqueta no3− a una muestra e incubada, y la tasa de DNRA se puede calcular a partir de los cambios en la concentración y la relación de isótopos en NH4+ antes y después de un cierto período de tiempo. En este artículo, se describe en detalle un método para cuantificar la concentración NH4+ y la relación de isótopos, que se requieren para calcular la tasa DNRA. Básicamente, el método reportado aquí es una combinación de varias técnicas previamente reportadas22,23,24,25,26 con modificaciones añadidas a algunos procedimientos. El método se compone de una serie de cinco procedimientos componentes: (1) incubación de una muestra ambiental con la modificación de un trazador de isótopos estable, 15NO3o,−(2) extracción y recuperación de NH4+ utilizando un "procedimiento de difusión" con modificaciones, (3) oxidación de persulfato de NH4+ en la muestra, que consiste en los indígenas NH4+ y 15NH4+ derivados de 15NO3a través de la actividad DNRA, en NO3o− y 15NO3o,−(4) transformación microbiana posterior de NO3o− y 15isótopómeros NO3a N2O mediante el método desnitrificador modificado y (5) cuantificación de los isótopómeros N2O utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS). En la siguiente sección, en primer lugar, se describe la preparación para los procedimientos (2) y (4) y, posteriormente, se describen detalladamente los cinco procedimientos de componentes.

Protocolo

1. Preparación de una envolvente de PTFE para capturar cuantitativamente los gases NH3

  1. Coloque una pieza de 60 mm de cinta de politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de ancho) en una pequeña lámina de aluminio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamaño, limpiada con etanol).
  2. Ceniza de un filtro de fibra de vidrio (10 mm de diámetro con un tamaño de poro de 2,7 m) a 450 oC durante 4 h en un horno de mufla. Coloque el filtro de fibra de vidrio un poco por encima del punto medio del eje más largo de la cinta (Figura 1a).
  3. Detecte 20 l de 0,9 mol/L H2SO4 en el centro de un filtro GF/D, y doble inmediatamente la cinta de PTFE con dos pinzas: pinzas de sello de extremo plano y pinzas de extremo recto. Los pasos siguientes, los pasos 1.4–1.7, se muestran en la Figura 1 y deben llevarse a cabo rápidamente.
  4. Gire la cinta PTFE sobre el filtro GF/D en la línea de puntos que se muestra en la Figura 1a para formar la forma que se muestra en la Figura 1b.
  5. Selle ambos lados doblando y luego presionando firmemente el borde con las pinzas(Figura 1c). No presione demasiado fuerte y no rasque la cinta de PTFE.
  6. Doble el extremo abierto con las pinzas y, a continuación, presione el borde con las pinzas (Figura 1d).
  7. Selle el extremo abierto presionando firmemente el borde con las pinzas(Figura 1e). El filtro GF/D no debe ser presionado durante este procedimiento.

2. Preparación de la biomasa de un denitrificador deficiente de óxido nitroso reductasa, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, para el método de denitrificador

  1. Raya un 20% de glicerol de Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 en placas de agar de agar de triptona de 1/4 de resistencia (TSB). Incubar las placas a 25oC durante 2-3 días.
  2. Transferir una sola colonia de P. chlororaphis a un pequeño tubo de ensayo que contenga 5 ml de medio TSB autoclavado y cultivo aeróbico (sin agitar) durante un día a 25 oC en la oscuridad hasta obtener el máximo crecimiento; esto se utilizará como precultivo.
  3. Transfiera 3 ml de la precultura a una botella de 1-L con un tapón de goma de silicio que contenga 1 L de TSB modificado autoclavado recién preparado complementado con 10 mmol/L KNO323. Incubar el frasco mientras se agita con un agitador en condiciones oscuras a 25 oC. Después de cultivar durante 8 h, reemplace el tapón de goma de silicio con una tapa de tornillo y ciérrelo firmemente. Continuar el cultivo en anoxia durante la noche.
  4. Centrifugar el cultivo a 18.800 x g durante 15 min a 4oC para obtener pellets de biomasa.
  5. Lavar la biomasa embalar tres veces con 30 ml de la solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), para eliminar por completo el NO3.− Las condiciones de la centrifugación son las mismas que en el paso 2.3.
  6. Después del lavado, vuelva a suspender la biomasa envasada con 30 ml de D-PBS(-). Utilice 1 ml de la suspensión para determinar la densidad celular midiendo OD600. Pipeta 1 ml alícuotas de la suspensión restante en crioviales estériles que contienen 0,8 ml de glicerol al 45%. Conservar las existencias de glicerol preparadas a 80 oC hasta su uso (ver sección 6).

3. Eliminación de oxígeno, nitrito y nitrato del sedimento de la muestra

  1. Pesar 3,0 g (peso húmedo) de sedimento en un vial de vidrio de 20 ml y añadir 9,0 ml de agua superficial para suspenderlo (25% p/p de lodo).
  2. Sellar el vial con un tapón de goma de butilo negro (lavado con agua intercambiada por iones y esterilizado mediante autoclave) y una tapa de aluminio.
  3. Purgar la suspensión y reemplazar el espacio de la cabeza aire con Ar (>99,99%) a 0,6 L/min durante 20 min utilizando un colector.
  4. Sustituya el gas Ar headspace por ultra-puro (>99.99995%) El aspirando durante 90 s y cargando por 30 s. Repita este procedimiento cuatro veces. Ajuste la presión del gas del espacio de la cabeza a 1,5 atm.
  5. Incubar los viales a 20oC durante la noche con agitación a 150 rpm en condiciones oscuras utilizando un agitador de temperatura constante para eliminar el oxígeno, nitrato y nitrito restantes en la suspensión de sedimentos y el gas del espacio de la cabeza.

4. Experimento de curso de tiempo para determinar la tasa de DNRA

  1. Reemplazar el gas espacio de la cabeza con fresco ultra-puro El utilizando el mismo procedimiento que en el paso 3.5 pero sin las cuatro repeticiones.
  2. Añada sustratos etiquetados y no etiquetados a cada vial de acuerdo con la Tabla 1 a través del tapón de goma de butilo utilizando una jeringa hermética. Purgar las soluciones de sustrato previamente preparadas en viales de vidrio de tamaño adecuado utilizando Ultra-puro He con la presión del espacio de la cabeza establecido en 1.5 atm para evitar la contaminación del aire. Evite la inyección involuntaria de cualquier cantidad de aire durante los procedimientos de inyección.
  3. Incubar viales a 20oC con agitación a 150 rpm. Añadir los sustratos a cada vial según la Tabla 1 e incubar durante 1 h, 3 h y 5 h. Después de detener la incubación, someta la suspensión de sedimentos en los viales a los siguientes procedimientos: pasos 4.4–4.9.
  4. Retire la tapa de aluminio y el tapón de goma de butilo de cada vial. A continuación, añadir KCl (ashed a 450 oC durante 4 h) a la suspensión del sedimento hasta una concentración final de aproximadamente 2 mol/L para asegurar la recuperación de NH4+ del sedimento. Cierre los viales con un tapón de goma de butilo y un cierre de aluminio.
  5. Agitar el sedimento a 150 rpm durante 1 h a 4oC en condiciones oscuras para extraer el NH4+.
  6. Transfiera toda la suspensión de sedimentos en el vial a un tubo centrífugo de plástico de 50 ml, y centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 oC.
  7. Enjuague la pared interna de una jeringa desechable de 10 ml recién abierta y adjúntela a un filtro de membrana de acetato de celulosa desechable recién abierto (tamaño de poro 0,22 m, 25 mm de diámetro). A continuación, enjuague el filtro de membrana con 1 ml de sobrenadante. Coloque la unidad de filtro de jeringa enjuagada en un frasco de polipropileno de boca ancha (PP) de 20 ml.
  8. Filtrar el sobrenadante restante a través de un filtro de membrana de acetato en el frasco PP de 20 ml. Almacene los extractos a 20 oC hasta su posterior análisis.

5. Captura difusa NH4+ en 2M H2SO4 absorbida al filtro GF/D en la envolvente de PTFE y la oxidación de persulfato de NH4+ a NO3o−

  1. Preparar soluciones estándar de 14NH4Cl con gradientes de concentración de 0 émol/L, 10 émol/L, 40 émol/L, 100 émol/L, 200 émol/L, 400 omol/L y 500 mmol/L. Para el análisis de la relación 15N, fijar la concentración total de NH4+ a 200 émol/L y preparar relaciones de isótopos de 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 y 10:90 con soluciones puras de 14NH4Cl y 15NH4Cl estándar.
  2. Transfiera 30 mg de MgO (en cenizas a 450 oC durante 4 h) a un vial de vidrio de 20 ml y coloque el sobre de PTFE en el vial.
  3. Transfiera 5 ml de una muestra o estándar al vial que contiene el MgO y el sobre de PTFE, e inmediatamente cierre con un tapón de goma de butilo gris. Sellar con una tapa de aluminio. Si se espera que la concentración de NH4+ supere los 500 omol/L, diluya la muestra por debajo de 500 omol/L.
  4. Agitar los viales a 150 rpm durante 3 h a 4 oC en condiciones oscuras.
  5. Retire la tapa de aluminio y el tapón de goma de butilo. Saque el sobre de PTFE del vial con pinzas puntuales, enjuague bien el sobre y las pinzas con agua intercambiada por iones, límpielas con un papel de limpieza y, a continuación, coloque el sobre en un papel de limpieza fresco.
  6. Abra el sobre de PTFE con un par de pinzas (se recomienda el uso de las pinzas planas y de extremo puntual) en el orden inverso exacto del plegado realizado en los pasos 1.4–1.7.
  7. Sostenga el área periférica del filtro GF/D, donde se supone que el H2SO4 no se absorbe, con las pinzas planas, y transfiéralo a un tubo de ensayo de tapa de tornillo de 11 ml con una tapa forrada de PTFE. Enjuague las pinzas con agua intercambiada por iónico y límpielas con papel de limpieza.
  8. Repita los pasos 5.5–5.7 para los sobres restantes.
  9. Agregue 1 ml de agua intercambiada por iones a cada uno de los tubos de ensayo, cierre la tapa del tornillo y mantenla sin agitar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para eluir completamente el NH4+ del filtro GF/D. Durante este paso, realice el siguiente paso (paso 5.10) en paralelo.
  10. Preparar el reactivo de solución oxidante de persulfato (POR)25,26.
    1. Debido a que no se puede almacenar, prepare la cantidad exacta de POR necesaria para el tratamiento de un solo día de muestras.
    2. Para preparar POR para tratar 50 muestras, vierta 100 ml de agua intercambiada por iones en una botella de tapa de tornillo de 200 ml y añada 1,52 g de NaOH (grado de análisis compuesto de nitrógeno), 3 g de ácido bórico y 5 g de K2S2O8 (grado de análisis de nitrógeno y fósforo) en ese orden. Inmediatamente después de añadir cada reactivo, agitar la solución hasta que se disuelva por completo.
    3. Si es necesario, remoje la botella en agua tibia para ayudar a la disolución de los productos químicos; sin embargo, debe prestarse atención con respecto a la contaminación de NO3porque el agua del grifo normalmente contiene NO3o.−
  11. Después del paso 5.8, abra la tapa del tornillo, añada 2 ml del reactivo POR al tubo de ensayo y cierre el tubo firmemente con una tapa de tornillo para evitar cualquier pérdida o contaminación durante los siguientes pasos.
  12. Colocar los tubos de ensayo en un bastidor, envolverlos en papel de aluminio de doble capa y autoclaverlos durante 1 h a 121 oC. Mantenga los tubos en posición vertical durante este paso y evite cambios rápidos de temperatura después de terminar el autoclaving.

6. Determinación del NO3convertido de NH4+ mediante el método desnitrificador mediante cuadrúpedo GC/MS

  1. Mezclar 100 ml de tampón estéril de fosfato de 40 mmol/L (pH 7.2) y 100 ml de glucosa estéril de 30 mmol/L asépticamente (fosfato de 20 mmol/L y glucosa de 15 mmol/L; final).
  2. Añadir un volumen de 1/7,2 de glicerol de P. chlororaphis a 200 ml de la solución de glucosa tamponada con fosfato en un matraz Erlenmeyer de 300 ml, y purgar con un He ultrapurado (>99.995%) corriente durante 1 h.
  3. Dispensar 2,0 ml de la suspensión del desnitrificador en cada vial de 5 ml. Tapa los viales con un tapón de goma de butilo gris y un cierre de aluminio.
  4. Reemplazar el aire del espacio de la cabeza con ultra-puro He aspirando durante 3 minutos y cargando el He durante 1 min. Ajuste la presión positiva del gas del espacio de la cabeza a 1,3 atm para evitar la contaminación involuntaria del aire.
  5. Inyecte 1 ml de una muestra o estándar a través del tapón de goma de butilo utilizando una jeringa desechable de 1 ml. Observe la cantidad exacta de la muestra realmente inyectada.
  6. Incubar los viales durante la noche a 25oC en condiciones oscuras.
  7. Inyectar 0,3 ml de NaOH de 6 mol/LL para detener la desnitrificación y absorber el espacio de la cabezaCO2,lo que de otro modo perturbará seriamente el análisis de N2O por GC/MS porque elCO2 y N2O tienen el mismo peso molecular.
  8. Determinar las cantidades de 44N2O, 45N2O y 46N2O en el gas del espacio de la cabeza utilizando el cuadrúpedo GC/MS con un puerto de inyección modificado25. Las condiciones de funcionamiento utilizadas para el análisis GC/MS se muestran en el Cuadro 2.

7. Análisis de datos

  1. Derive la curva de calibración para la.concentración NH4+ de la relación lineal entre la concentración conocida de 14NH4+ y las intensidades de señal medida del total producido 44N2O + 45N2O + 46N2O. Derive la curva de calibración para el contenido de 15N de la relación lineal entre el átomo conocido%(es decir, 15N/14N+15N) y el átomo calculado% utilizando una ecuación previamente proporcionada27. Calcular la concentración de 15NH4+ multiplicando el total NH4+ por la relación 15N de NH4+.
  2. Calcular la tasa DNRA potencial utilizando ecuaciones proporcionadas en otros lugares28,29,30.

Resultados

Los resultados representativos presentados en este documento se derivaron de 15experimentos de rastro de N de sedimentos de marismas. La marisma muestreada fue creada recientemente después del Gran Terremoto del Este de Japón de 2011 en el área de Moune de la ciudad de Kesen-numa en la prefectura de Miyagi, Japón. En septiembre de 2017, se recogieron sedimentos superficiales (0-3 cm) en dos emplazamientos en las zonas submareales e intermareales. Primero, inmediatamente des...

Discusión

La concentración y la relación de isótopos de NH4+ para el análisis DNRA se cuantificaron utilizando varios métodos. Las concentraciones y las relaciones de isótopos de NH4+ generalmente se miden por separado. La concentración de NH4+ se mide típicamente utilizando métodos colorimétricos incluyendo un autoanalyzer4,10,15,16

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Naoto Tanaka por ayudar a la recopilación de datos y el desarrollo del protocolo. La colección de muestras fue compatible con JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
20 mL PP bottleSANPLATEC61-3210-18Wide-mouth
Aluminum capMaruemu1307-13No. 20, with hole
Boric acidWako021-02195
CentrifugeHITACHIHimac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace InjectorSANSIN INDUSTRIALIP-12
Disposable cellulose acetate membrane filterADVANTEC25CS020ASPore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringeTermoSS-10SZ10 mL
Disposable syringeTermoSS-01T1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Gastight syringeVICI Valco Instruments4075-15010Series A-2, 100 µL
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm in diameter
Glass vialMaruemu0501-0620 mL
Gray butyl rubber stopperMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Guaranteed Reagent
K2S2O8Wako169-11891Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KClWako163-03545Guaranteed Reagent
KNO3Wako160-04035Guaranteed Reagent
NaOHWako191-08625Nitrogen compounds analysis grade
NH4ClWako017-02995Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tubeASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tapeSigma-AldrichZ22188025 mm in width
Reciprocating shakerTAITEC0000207-000NR-10
Screw-cap test tubeIWAKI84-025211 mL
PTFE-lined cap for test tubeIWAKI84-0262
Tryptic Soy BrothDifco Laboratories211825

Referencias

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