Имплантация изопротеренола Мини-насоса, чтобы вызвать сердечную недостаточность у мышей

Резюме

Хроническое введение изопротеренола через имплантированный осмотический насос широко используется для имитации прогрессирующей сердечной недостаточности у мышей. Здесь мы описываем подробные методы хирургической мини-насосной имплантации для непрерывного введения изопротеренола в течение 3 недель, а также эхокардиографическую оценку для успешного создания модели.

Аннотация

Изопротеренол (ISO), является неселективным бета-адренергическим агонистом, который широко используется для индуцирования сердечной травмы у мышей. В то время как острая модель имитирует стресс-индуцированной кардиомиопатии, хроническая модель, вводимая через осмотический насос, имитирует прогрессирующую сердечную недостаточность у людей. Целью описанного протокола является создание хронической модели сердечной недостаточности, вызванной ИСО, у мышей с помощью имплантированного мини-насоса. Этот протокол был использован, чтобы вызвать сердечную недостаточность в 100 штаммов инбредных мышей. Методы хирургической имплантации насоса описаны в деталях и могут иметь отношение к любому, кто заинтересован в создании модели сердечной недостаточности у мышей. Кроме того, представлены еженедельные изменения в кардиорекардиографии на основе эхокардиографических параметров для каждого штамма и ожидаемого времени для моделирования разработки. Таким образом, метод прост и воспроизводим. Непрерывного ISO, вводимого через имплантированный мини-насос в течение 3-4 недель, достаточно для того, чтобы вызвать ремоделирование сердца. Наконец, успех создания модели ISO можно оценить в vivo по серийной эхокардиографии, демонстрирующей гипертрофию, расширение желудочков и дисфункцию.

Введение

Сердечная недостаточность с уменьшенной фракцией выброса (HFrEF) сопровождается хорошо признанной компенсационной реакцией симпатической нервной системы для поддержания сердечно-сосудистого гомеостаза^1. Гемодинамический стресс и пагубное воздействие на сердце и кровообращение наблюдались при хронической активации. Они стали краеугольным камнем современной фармакотерапии при сердечной недостаточности и являются важными механизмами в прогрессировании сердечной недостаточности и терапевтического антагонизма нейрогормональных систем^1.

Несколько моделей мыши доступны для основных исследований сердечной недостаточности. Генетические модели привлекательны для изучения молекулярной терапии и изучения сигнальных путей. Однако эти модели могут не иметь отношения к распространенным формам сердечной недостаточности. Другие распространенные модели включают в себя левую переднюю нисбытку (LAD) перевязку артерий, трансаортное сужение (TAC) и изопротеренол (ISO), каждая изцельновая на различные патологические этиологии^{2,3,4,5 ,6}. Лад артерии лигация индуцирует передней стенки инфаркта миокарда, создавая таким образом модель, специфичные для ишемической кардиомиопатии. TAC вызывает острую перегрузку давления для создания гипертонической модели сердечной недостаточности. Хотя градиент давления может быть измерен, что позволяет стратификации гипертрофии, острое начало гипертонии не имеет прямой клинической значимости⁴. Как LAD, так и TAC модели требуют высокого уровня хирургического опыта для выполнения. Острая модель ISO сердечной недостаточности имитирует стресс-индуцированной кардиомиопатии, также известный как болезнь Такоцубо, которая характеризуется заметным увеличением катехоламинов и активности в левом желудочке, который имитирует острый инфаркт миокарда^{7, 8}. В отличие от этого, хронические модели ISO сердечной недостаточности представляют симптомы симптомов прогрессирующей сердечной недостаточности, с хронически повышенным уровнем катехоламинов¹. Преимущества хронической модели ISO заключаются в том, что она обеспечивает хроническую андренергическую стимуляцию, имитирующую прогрессирующую сердечную недостаточность, и которую она относительно легко создать. Следователь должен выбрать модель, которая наилучшим образом резюмирует их патологии интерес.

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы вызвать сердечную недостаточность у мышей с помощью имплантированного мини-насоса, который высвобождает ISO непрерывно имитировать хроническую симпатическую активацию, обнаруженную у пациентов с сердечной недостаточностью^1. Метод прост и воспроизводим. Хотя есть явные различия между штаммами мыши, ISO вводят в течение 3 до 4 недель на 30 мг/кг /день достаточно, чтобы вызвать сердечной ремоделирования у большинства мышей. В частности, ISO приводит к про-гипертрофической компенсационной фазы в течение недели 1 следуют истончение стен, желудочковой расширение и снижение систолической функции на 2 и 3². Успех создания модели ISO можно оценить в vivo по серийной эхокардиографии, демонстрирующей гипертрофию, расширение и дисфункцию желудочков, а также ex vivo с помощью гистологической и молекулярной оценки собранной сердечной ткани для интрамиокардии накопление липидов, фиброз, СТРЕСС ER, апоптоз, и экспрессия^{генов 9,10,11,12}.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам по уходу за животными Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (протокол ARC #2010-075). Читателям рекомендуется придерживаться своего собственного протокола, одобренного IACUC, так как пери-процедура ухода за мышью и управление обезболиванием могут быть специфическими для учреждений.

1. Приготовление изопротеренола осмотического насоса

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была успешно применена на 9 "недельных самок мышей весом 18" г из более чем 100 инбредных штаммов мыши, а также, у мышей мужского пола в подмножестве штаммов. Существует нет максимального предела веса тела для этой процедуры. Всегда включают в себя возрастные элементы управления, так как неизвестно, влияет ли возраст лечения на изопротеренол, индуцированный восприимчивостью к развитию сердечной недостаточности.

1. Взвешивание и запись веса тела для каждой мыши.
2. Рассчитайте соответствующее количество и концентрацию изопротеренола для каждой мыши (см. таблицу 1; Дополнительный файл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотические насосы, используемые в этом эксперименте(Таблица материалов) имеют объем резервуара 100 Л и предназначены для доставки лекарств с непрерывной скоростью потока на срок до 28 дней. Подготовьте дополнительный 20 л изопротеренола на насос, чтобы учесть потерю объема в заправочной трубе во время погрузки насоса.
3. Взвесьте соответствующее количество изопротеренола(таблица 1)с помощью аналитического баланса и растворите его в 120 л стерильного раствора NaCl 0,9%. Пипетка энергично или вихрь в течение 1 мин, чтобы полностью растворить изопротеренол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка осмотических насосов в кабинете биобезопасности лаборатории. Насосы должны быть обработаны хирургическими перчатками. Стерильная техника рекомендуется при подготовке осмотических насосов и во время хирургической имплантации.
4. Взвешивание и запись пустой осмотический насос вместе с его модератором потока, а затем удалить поток модератора.
5. Аспир 120 л изопротеренола раствора в шприц 1,0 мл и прикрепить 27-калийную тупонаклонную трубку с осмотической трубкой с осмотическими насосами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шприц и заполнение трубки свободны от пузырьков воздуха.
6. Удерживая насос в вертикальном положении, вставьте заполненную трубку через отверстие насоса в верхней части до тех пор, пока кончик заправочной трубки не будет сидеть на дне резервуара насоса.
7. Загрузите осмотический насос, нажав шприц поршень медленно, пока изопротеренол раствор заполняет до открытия насоса.
8. Аккуратно снимите трубку для заполнения и снимите лишний раствор.
9. Вставьте обратно модератор потока, чтобы закрыть насос и стереть любое избыточное решение.
10. Подтвердите, что более 90% объема резервуара было заполнено путем перевешивает осмотический насос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные насосы готовятся таким же образом, заполняя резервуар насоса стерильным раствором NaCl 0,9%.

2. Подготовка хирургических инструментов

1. Очистите все хирургические инструменты, в том числе волоконно-оптический окольный световой микроскоп иллюминатор, 2 щипцы, держатель иглы, горячие стерилизаторы шарика, стеклянные бусы и ножницы (Таблица материалов).
2. Автоклавные хирургические инструменты при 121 "C" в течение 30 минут для стерилизации инструментов до операции.

3. Изопротеренол осмотический насос хирургической имплантации

1. Индуцировать анестезию, поместив мышь в индукционную камеру с 3% изолюран в 95% O2 и 5% CO2. Поддержание анестезии с 2% изофларан через носекон.
2. Администрирование 5 мг/кг карпрофена s.c. к потертости шеи между лопатками для обезболивания.
3. Поместите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
4. Проверьте глубину анестезии, контролируя скорость дыхания, рефлекс щипца и цвет слизистой оболочки.
5. Поместите мышь в положение на спине на подогревом колодки. Удалить волосы из нижней части живота и дезинфицировать кожу бетадин омичидин или хлоргексидин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму послеоперационную инфекцию, убедитесь, что хирургическое поле не имеет волос.
6. Используйте пару хирургических ножниц, чтобы сократить 1 см длиной разрез кожи средней линии. Используйте пару тупых ножниц, чтобы тщательно вскрыть кожу от лежащих в основе перитонеальных стенок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интраперитонеальная доставка предпочтительнее для размещения размера насоса.
7. Вытяните перитонеальные стенки от основной кишечника с помощью щипков и вырезать 0,8 см отверстие в стенках, используя тонкие хирургические ножницы.
8. Вставьте осмотический насос в полость перитонеальной полосы с потоком модератор конца в первую очередь.
9. Закройте трюм в перитонеальных стенках, используя 5.0 поглощаемые швы в прерванном виде. Используйте 6.0 непоглощаемых швов, чтобы закрыть разрез кожи в прерванном моды.
10. Поместите мышь в специальный инкубатор, чтобы сохранить его теплым и сухим во время восстановления. Оцените восстановление после анестезии, наблюдая за мышью каждые 30 минут в первые два часа для возвращения нормального дыхания и движения.
11. После того, как мышь полностью оправилась от анестезии, верните ее в обычное жилье. Продолжайте следить за животным на осложнения ежедневно до 3 дней, а затем каждые 2 до 3 дней после окончания эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: животные должны быть проверены на наличие послеоперационной боли или инфекции, признаки потери веса, отсутствие мобильности, ненормальная осанка, неспособность жениха, и чрезмерное лизать или кусаться области разреза.
12. Администрирование карпрофена 5 мг/кг s.c. каждые 24 ч до 48 ч и после этого по мере необходимости.
13. Администрирование 0,25 мг/мл амоксициллина в питьевой воде в течение 5 дней для предотвращения хирургических инфекций сайта.
14. Удалите непоглощаемые швы через 7-10 дней.

4. Эхокардиографическая экспертиза под наркозом

ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиографическая оценка может быть выполнена неоднократно для мониторинга серийной реконструкции сердца в течение нескольких недель. Мы проводили эхокардиографические измерения с еженедельными интервалами в течение 3 недель.

1. Индуцировать анестезию в индукционной камере на 1,25% до 1,5% изофруран. После того, как надлежащим успокоительное, закрепите мышь на платформе эхокардиографии с лентой позволяет мыши продолжать получать анестезию через нос конуса.
2. Снижение изолюрани до дозировки обслуживания 1%, чтобы свести к минимуму негативные хронотропические и инотропные эффекты чрезмерного сеадации. Принять к сведению дыхательных и сердечных приступов на протяжении всего исследования и корректировать изолюран дозировку по мере необходимости.
3. Удалите волосы на груди с помощью депиляторного лосьона и протрите грудь без волос.
4. Поместите ультразвуковой гель на грудь и положение ультразвукового зонда для изображения сердца.
5. В B-режиме изображение левого желудочка (LV) в виде парастеральной длинной оси. Отрегулируйте платформу эхокардиографии, чтобы выровнять аортальный клапан и вершину LV в плоскости ультразвукового луча.
6. Наклоните платформу эхокардиографии, чтобы поместить длинную ось LV при 90 градусах к ультразвуковому лучу и максимальному диаметру LV в центре изображения.
7. Изображение LV короткая ось, повернув ультразвуковой зонд 90 градусов.
8. В M-режиме измеряют толщину стены LV и внутренние размеры.
9. Поместите мышь обратно в клетку. Монитор для возвращения нормального дыхания и спонтанных движений тела.

Результаты

В нашем ранее опубликованном исследовании, мы ввели дозировку ISO 30 мг/кг/д в течение 21 дней через осмотический насос через 105 Гибридная мышь Разнообразие Панели (HMDP) штаммов^2,13. Мы оценивали исходы с помощью эхокардиограммы, выполняемой на базовом уровне, н?...

Обсуждение

Мы применили этот метод к более чем 100 штаммов инбредных мышей для оценки сердечных исходов из-за хронической бета-адренергической стимуляции^2,13. Значительные различия в восприимчивости к изопротеренолу, как известно, существуют среди штаммов мыши и мог?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772