Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Zusammenfassung

Die Verwendung präklinischer Modelle, um unser Verständnis der Tumorbiologie zu verbessern und die Wirksamkeit von therapeutischen Wirkstoffen zu untersuchen, ist der Schlüssel zur Krebsforschung. Obwohl es viele etablierte Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser In-vitro- und In-vivo-Modelle ihre Anwendungen ein. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen. So werden alternative Modelle entwickelt, die die Tumorheterogenität besser repräsentieren. Patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten die intratumorale Heterogenität bei und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung wider. Allerdings dauert es in der Regel 4-8 Monate, um ein PDX-Modell zu entwickeln, das länger ist als das erwartete Überleben vieler Magenpatienten. Aus diesem Grund kann die Etablierung primärer Krebszelllinien eine wirksame ergänzende Methode für Studien zur Wirkstoffreaktion sein. Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Diese Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Einleitung

Magenkrebs ist die fünfthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste Krebstodesursache. Im Jahr 2018 wurden weltweit über 1.000.000 neue Fälle von Magenkrebs diagnostiziert, und schätzungsweise 783.000 Menschen wurden durch diese Krankheit getötet¹. Die Inzidenz und Sterblichkeit von Magenkrebs ist in den nordöstlichen asiatischen Ländern nach wie vor sehr hoch^2,3. Trotz signifikanter Fortschritte auf dem Gebiet der Krebstherapeutika bleibt die Prognose von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 25%^{4,5,6, 7,}. Daher besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Magenkrebs

Die Behandlung von Magenkrebs ist aufgrund seiner hohen Heterogenität eine Herausforderung^8,9. So ist die Frage, wie man die Herausforderungen der Tumorheterogenität angehen kann, um Präzisionsmedizin zu realisieren, von zentraler Bedeutung für die Krebsforschung. In-vitro- und In-vivo-Modelle spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung der heterogenen Mechanismen und der Biologie von Magenkrebs. Obwohl es zahlreiche Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser Modelle ihre Anwendungen^{ein 10}. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen¹¹. Diese Probleme schränken die Möglichkeit der Identifizierung von Untergruppen von Krebspatienten, die auf gezielte Medikamente ansprechen, stark ein. Die kurzfristige Kultur der Primärtumoren bietet eine relativ schnelle und personalisierte Möglichkeit, anticancer pharmakologische Eigenschaften zu untersuchen, die wahrscheinlich das Markenzeichen der personalisierten Krebsbehandlung sein wird.

Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs) werden als alternatives präklinisches Modell für die Wirkstoff-Profilierung¹²bevorzugt. Darüber hinaus bieten PDX-Modelle ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Initiierung und des Fortschreitens von Krebs^13,14. PDX-Modelle bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten intratumorale Heterogenität und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung^15,16wider. Die Einschränkung der weit verbreiteten PDX-Modelle ist jedoch die geringe Erfolgsrate bei der Etablierung und seriellen Verbreitung von soliden Tumoren beim Menschen. In dieser Studie werden anständig erfolgreiche Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben.

Protokoll

Diese Studie am Menschen wurde vom Institutional Ethics Review Board des Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, China) genehmigt. Die Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sun Yat-sen University genehmigt. Hinweis: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt, einschließlich der Leitlinie für den Schutz der beruflichen Exposition gegen blutübertragene Krankheitserreger.

1. Probenvorbereitung

1. Erhalten Sie Magenkrebsgewebe (P0 = Durchgang 0) direkt aus der Operation. Die Tumorprobe sollte größer als 0,5 cm³sein.
2. Bereiten Sie 3-4 ml Stammlösung vor: zum Beispiel RPMI-1640 medium (1x) ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin.
3. Die frische Tumorprobe nicht länger als 4 Stunden in die Stammlösung bei 4 °C einlagern.

2. Einrichtung des PDX-Modells (Abbildung 1)

1. Um einen sterilen Operationsbereich zu gewährleisten, desinfizieren Sie alle Materialien mit ultraviolettem Licht für mehr als 30 min vor der Übertragung in das Tierlabor.
   Hinweis: Der Operationssaal muss 30 min lang mit ultraviolettem Licht desinfiziert werden, bevor wir den Schreibtisch mit dichlorisocyanurinsäureNatrium-Suppositorien-Desinfektionsmittel reinigen. Dann wird Povidon-Jod verwendet, um die Haut zu desinfizieren.
2. Mit Zangen und Schere die Tumorgewebe sorgfältig sezieren und unter sterilen Bedingungen in mehrere kleine Stücke (ca. 1 mm³ Würfel) schneiden.
3. Anästhetisieren Sie weibliche 5- bis 7 Wochen alte NOD-SCID-IL2rg (NSG) Mäuse durch Exposition gegenüber 1-1,5% Isofluran mit einer Anästhesiemaschine.
   1. Anästhesisieren Sie die Maus, bis sie aufhört zu kämpfen, aber hält sogar Atmung.
      HINWEIS: Das 50 ml Rohr ist ein einfaches Gerät, das einer Anästhesiemaschine ähnelt. Der Einsatz von tierärztlicher Augensalbe zur Trockenheitistierung ist aufgrund der kurzen Betriebszeit unnötig.
4. Machen Sie einen 1 cm Schnitt auf beiden Rückenflanken mit steriler Schere, und implantieren Sie ein Tumorstück in jede Flanke der Maus.
   1. Um sicherzustellen, dass das Tumorstück nicht ausrutscht, verwenden Sie sterile Zangen, um das unterkutane Gewebe zu stören. Schneiden Sie dann ein Stück des Tumorgewebes ab und legen Sie es in die tiefe Stelle.
5. Schließen Sie den Implantatbereich durch subkutane Naht mit chirurgischen Nahtnadeln, und markieren Sie die Mausohren mit beschrifteten Ohrmarken
6. Sterilisieren Sie die Wunde mit Jod.
7. Legen Sie die Mäuse nach der Operation vorsichtig in einen leeren Käfig, während Sie die Brustbelebung beibehalten. Achten Sie genau auf den Zustand der Mäuse; sie wachen auf und beginnen ca. 3-4 min später zu gehen. Platzieren Sie Mäuse, die operiert werden, in einem anderen neuen Käfig, getrennt von denen, die nicht operiert werden.
8. Bewerten Sie die Tumorgröße durch Palpation der Implantationsstelle. Messen Sie die Tumore zweimal pro Woche mit einem Vernier-Sättel.
9. Sobald der Tumor einen Durchmesser von 10 mm erreicht, verschlechtert sich der Zustand des Tieres oder der Tumor ulcerates, euthanisieren Sie die Maus mit einer IRB-zugelassenen Methode. Reimplant erntete frische Tumorfragmente in 2 neue Mäuse für die Passierung oder lagern die Proben vorübergehend in PBS auf Eis, um primäre Zelllinien zu isolieren.

3. Gewebekryokonservierung

HINWEIS: Dieser Teil verweist in erster Linie auf die Methoden für das Live Tissue Kit Cryo Kit. Die wichtigsten Bausätze und Ausrüstungen sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1. Euthanisieren Sie die Mäuse mit einer IRB-zugelassenen Methode, wenn der Tumor einen Durchmesser von mehr als 10 mm hat.
2. Mit sterilen Zangen und Scheren, langsam isolieren den Tumor von den Mäusen.
3. Waschen Sie das Tumorgewebe mit DPBS in einer 10 cm Schale. Sezieren und entfernen Nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe mit Zangen und Schere.
4. Schneiden Sie das Tumorgewebe mit einer Form auf eine Dicke von maximal 1 mm ab.
5. Waschen Sie die Scheiben mit DPBS in einer 10 cm Schale.
   HINWEIS: Bei der Verglasung werden Rohre mit der Bezeichnung V1/V2/V3 in den Schritten 3.6-3.8 verwendet. Die Hauptbestandteile sind DMSO und Saccharose.
6. Die Scheiben mit Zangen in Rohr V1 geben und das Rohr bei 4 °C für 4 min inkubieren. Das Rohr kurz rollen und invertieren und bei 4 °C für weitere 4 min legen.
7. Gießen Sie die V1-Lösung und schneiden Sie in eine 10 cm Schale. Die Scheiben mit Zangen in Rohr V2 geben und Tube V2 bei 4 °C für 4 min inkubieren. Das Rohr kurz rollen und invertieren und bei 4 °C für weitere 4 min legen.
8. Gießen Sie die V2-Lösung und in Scheiben in eine 10 cm Schale. Übertragen Sie die Scheiben in Dasröhre V3 mit Zangen, und inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C für 5 min. Rollen und invertieren Sie das Rohr kurz, und legen Sie es bei 4 °C für mindestens 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben alle auf den Boden des Rohres sinken.
   1. Wenn mehrere Scheiben schweben bleiben, rollen und invertieren Sie das Rohr kurz, und legen Sie das Rohr wieder auf 4 °C, bis alle Scheiben vollständig sinken; Falls erforderlich, entsorgen Sie die schwebenden Slices.
9. Gießen Sie die V3-Lösung und schneiden Sie in eine 10 cm Schale.
10. Schneiden Sie die Gewebehalter auf die richtige Länge, und legen Sie sie auf sterile Gaze. Übertragen Sie die Scheiben auf die Halter. Wickeln Sie die Halter mit der Gaze, und legen Sie sie in flüssigen Stickstoff mit Zangen, gefolgt von inkubation für 5 min.
11. Beschriften Sie die kryogenen Durchstechflaschen mit den Gewebeinformationen.
12. Übertragen Sie die Halter mit Gewebescheiben in kryogene Durchstechflaschen, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

4. Isolierung von Primärzellen (Abbildung 2)

1. Sterilisieren Sie Zangen und Scheren mit Hochdruckdampf bei 121 °C für 30 min.
2. Resektmagen-Krebs-Proben von resektierten Proben oder geernteten PDX-Geweben. Legen Sie das Gewebe auf Eis, und dann übertragen Sie das Gewebe auf eine 10 cm sterile Kulturschale.
3. Sezieren und entfernen Nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe mit Zangen und Schere.
4. Waschen Sie das Tumorgewebe einmal mit DPBS, das 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin in einer 10 cm Schale enthält.
5. Schneiden Sie das Tumorgewebe in 1 mm³ Stück auf dem Deckel der Schale; die maximale Dicke jedes Stücks sollte 1 mm betragen.
6. Übertragen Sie das Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr mit ca. 7 ml Typ-1-Kollagenase und Trypsin (1:14) Lösung. Wirbeln Sie die Mischung kurz.
7. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad bei 37 °C für 30-40 min. Wirbel die Mischung alle 5 min.
8. Fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI-1640 medium (1x) hinzu, das mit 10% FBS ergänzt wird. Wirbel nisch die Mischung gründlich.
9. Übertragen Sie das Gemisch durch langsame Filtration durch einen 40-m-Filter in ein neues 50 ml Zentrifugenrohr.
   HINWEIS: Verwenden Sie 40-m-Filter, um ein höheres Verhältnis von Krebszellen zu gewährleisten. Bei Bedarf können 100-m-Filter verwendet werden, um mehr Zelltypen, wie z. B. immunologische Zellen, zu konservieren.
10. Zentrifugieren Sie die Filtrate bei 113-163 x g für 5-7 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
11. Waschen Sie das Pellet mit 5 ml PBS, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
12. Wenn das Pellet rot ist, enthält es viele Erythrozyten. Das Pellet vorsichtig mit 500 L roter Blutzelllysepuffer wieder aufhängen. Nach einer Inkubation von 5 min 5 ml PBS hinzufügen und den Überstand vorsichtig entfernen.
13. Das Pellet mit Kulturmedium aussetzen und die Mischung in eine sterile 10 cm Schale geben.
14. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage durch serumhaltiges Medium.
15. Durchfluss der Primärzellen mit Trypsin/EDTA, wenn sie 50% Zusammenfluss erreichen.

Ergebnisse

Hier wurden Tumorgewebe aus einer Operation bis zum nächsten Schritt in Stammlösung konserviert. Innerhalb von 4 Stunden wurden Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und in die dorsalen Flanken von NSG-Mäusen implantiert, die mit isoflurangetränkter Baumwolle betäustt worden waren. Tumoren größer als 1 cm³ könnten zur Implantation in neue Mäuse resektiert werden (Abbildung 1) oder sorgfältig geschnitten und gemäß dem Protokoll in flüssigem Stickstoff konserviert w...

Diskussion

Magenkrebs ist eine aggressive Erkrankung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten; So sind Modelle von Magenkrebs zu einer kritischen Ressource geworden, um funktionelle Forschungsstudien mit direkter Übersetzung in die Klinik^4,8,17zu ermöglichen. Hier haben wir die Methoden und das Protokoll zur Etablierung von Magenkrebs-PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben. Wichtig ist, dass sowohl morphologische als auch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017