Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Resumen

En este artículo se presentan métodos de preparación de muestras para un método analítico único en tiempo real basado en la espectrometría de masas ambientales. Este método nos permite realizar análisis en tiempo real de las moléculas biológicas in vivo sin ningún pretratamiento especial.

Resumen

La espectrometría de masas (MS) es una herramienta poderosa en la química analítica porque proporciona información muy precisa sobre moléculas, como las relaciones masa-carga(m/z),que son útiles para deducir pesos y estructuras moleculares. Si bien es esencialmente un método analítico destructivo, los recientes avances en la técnica de ionización ambiental nos han permitido adquirir datos mientras demos el tejido en un estado relativamente intacto en términos de integridad. La ionización por electrospray de sonda (PESI) es un método llamado directo porque no requiere un pretratamiento complejo y lento de las muestras. Una aguja fina sirve como un selector de muestras, así como un emisor de ionización. Sobre la base de la propiedad muy afilada y fina de la punta de la sonda, la destrucción de las muestras es mínima, lo que nos permite adquirir la información molecular en tiempo real de los seres vivos in situ. En este documento, presentamos tres aplicaciones de la técnica PESI-MS que serán útiles para la investigación y el desarrollo biomédicos. Se trata de la aplicación al tejido sólido, que es la aplicación básica de esta técnica para el diagnóstico médico. Como esta técnica requiere sólo 10 mg de la muestra, puede ser muy útil en los entornos clínicos de rutina. La segunda aplicación es para el diagnóstico médico in vitro donde se mide el suero sanguíneo humano. La capacidad de medir muestras de fluidos también es valiosa en varios experimentos biológicos en los que no se puede proporcionar un volumen suficiente de muestras para técnicas analíticas convencionales. La tercera aplicación se inclina hacia la aplicación directa de agujas de sonda en animales vivos, donde podemos obtener dinámica sin tiempo de metabolitos o fármacos en órganos específicos. En cada aplicación, podemos inferir las moléculas que han sido detectadas por la EP o utilizar inteligencia artificial para obtener un diagnóstico médico.

Introducción

La espectrometría de masas (Em) es una realización tecnológica del reduccionismo; reduce el objeto de análisis a una unidad que puede interpretarse sobre la base de especies moleculares o cascadas. Por lo tanto, es un método representativo de química analítica. Se compone de cuatro procesos: ionización, análisis, detección y adquisición espectral. Debido a que la ionización de la molécula es el primer proceso en espectrometría de masas, generalmente restringe la forma de los analitos a procesar. La mayoría de los procedimientos de ionización requieren la destrucción de la estructura, morfología y procesos biológicos en tiempo real de muestras orgánicas. Por ejemplo, la ionización por electrospray (ESI) MS requiere que las muestras estén en estado líquido para una ionización eficiente¹. Las muestras, por lo tanto, deben pasar por una compleja preparación bioquímica, que altera la composición de las moléculas. Alternativamente, mientras que la ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI) MS puede reconstruir mapas moleculares de tejido seccionado delgado^2,3, su eficiencia de ionización es demasiado baja para detectar todas las moléculas en las muestras, y es particularmente pobre en el análisis de ácidos grasos. Teniendo en cuenta estas limitaciones, la ionización de electrospray de sonda (PESI)⁴ se puede utilizar para observar los cambios en tiempo real en los sistemas biológicos in situ sin destruir la integridad estructural^5,mientras que el organismo biológico que se observa está técnicamente en un estado vivo. Una aguja muy fina se utiliza en este caso que sirve simultáneamente como un selector de muestras y un emisor de iones. Esto significa que las complejas secuencias de pretratamiento de muestras se pueden omitir para obtener espectros de masa que reflejen los componentes moleculares del sistema vivo in situ.

Hay varios otros métodos de ionización que rivalizan con PESI-MS. Una es la espectrometría de masas de ionización evaporativa rápida (REIMS)⁶. Esta técnica funciona bien durante la cirugía porque se ensambla con un cuchillo eléctrico y recoge el penacho iónico generado durante la incisión. Si bien REIMS es muy útil para la cirugía, es esencialmente un método destructivo que requiere la ablación eléctrica del tejido. Por lo tanto, no es útil para el análisis detallado de células y tejidos en una muestra preparatoria o en análisis de laboratorio. Además, debido a que recoge una gran cantidad de residuos de tejido que contienen penacho, requiere un largo mantenimiento de los dispositivos después de cada uso, limitando así el uso de esta máquina a procedimientos quirúrgicos especiales. Un método similar, llamado espectrometría de masas de ionización láser (LDI-MS)⁷, es otra técnica que no es invasiva y útil para el análisis de superficie. Debido a que esta técnica es buena para escanear la superficie de una muestra, logra un análisis bidimensional integral como espectrometría de masas de imágenes MALDI^8,9. Sin embargo, debido a que LDI-MS sólo es aplicable al análisis de superficie, PESI-MS es ventajoso para analizar las muestras, por ejemplo, dentro del tejido. Otra técnica, la MasSpec Pen^10,se informó para lograr una alta especificidad y sensibilidad en el diagnóstico del cáncer de tiroides, pero el diámetro de la sonda está en el orden de mm y es específico para el análisis de la superficie, lo que significa que no puede detectar pequeños nódulos de cáncer o lesiones profundamente localizadas. Además, dado que este método utiliza un canal de flujo microcapilar incrustado en la pluma de la sonda, debe tenerse en cuenta la contaminación cruzada, similar a LDI-MS. Existen otras técnicas que se han aplicado a entornos clínicos, como la sonda de flujo y la forma de ionización del hisopo^11,pero no están muy extendidas.

PESI es una miniaturización extrema de ESI, donde el capilar del nanoelectrospray converge en una aguja sólida con un radio de curvatura de la punta de varios cientos de nm. La ionización tiene lugar en el área extremadamente restringida de la punta de la aguja mediante la formación de un cono Taylor, en el que quedan muestras hasta la ionización de todo el líquido en la punta se completa¹². Si el analito permanece en la punta de la aguja de metal, el exceso de carga se genera continuamente en la interfaz entre la aguja de metal y los analitos. Por lo tanto, la ionización secuencial de moléculas ocurre dependiendo de su actividad superficial. Esta propiedad hace que la punta de la aguja sea una especie de cromatograma, separando los analitos dependiendo de su actividad superficial. Más técnicamente, las moléculas con la actividad superficial más fuerte llegan a la superficie del cono Taylor y se ionizan antes que aquellas con una actividad superficial más débil, que se adhieren a la superficie de la aguja hasta el final del proceso de ionización. Por lo tanto, la ionización completa de todas las moléculas recogidas por la aguja se logra¹³. Además, debido a que esta técnica no implica la adición de disolvente superfluo a la muestra, varios cientos de femtolitros son suficientes para obtener espectros de masa lo suficientemente fuertes para un análisis posterior¹⁴. Estas propiedades son ventajosas para el análisis de muestras biológicas intactas. Sin embargo, una desventaja importante de PESI-MS radica en la discontinuidad de la ionización debido al movimiento recíproco de la aguja a lo largo del eje vertical, similar a una máquina de aserrado. La ionización sólo tiene lugar cuando la punta de la sonda alcanza el punto más alto cuando la altura del orificio iónico está alineada en el eje horizontal. La ionización cesa mientras la aguja recoge muestras, por lo que la estabilidad de la ionización no es igual a la de la ESI convencional. Por lo tanto, PESI-MS no es un método ideal para la proteómica.

Hasta la fecha, PESI-MS se ha aplicado principalmente al análisis de sistemas biológicos, cubriendo una amplia gama de campos, desde la investigación básica hasta los entornos clínicos. Por ejemplo, el análisis directo del tejido humano preparado durante la cirugía fue capaz de revelar la acumulación de triacilglycerol tanto en el carcinoma de células renales¹⁵ como en el carcinoma escamoso faríngeo^16. Este método también puede medir muestras líquidas, como la sangre, para centrarse en el perfil lipídico. Por ejemplo, algunas moléculas se han delineado durante los cambios en la dieta en los conejos; se informó que algunas de estas moléculas disminuyeron en etapas muy tempranas de los experimentos, lo que indica la alta sensibilidad y utilidad de este sistema para el diagnóstico clínico^17. Además, la aplicación directa a un animal vivo permitió la detección de cambios bioquímicos del hígado después de sólo una noche de ayuno⁵. ¹⁸ revisitó este experimento⁵ y analizó los perfiles metabólicos del hígado de casi la misma manera, con resultados que reforzaron la estabilidad y reproducibilidad de nuestro método original. Además, pudimos discriminar el tejido canceroso del hígado no canceroso circundante en ratones utilizando esta técnica¹⁹. Por lo tanto, esta es una técnica de espectrometría de masas versátil que es útil en varios entornos, tanto in vivo como in vitro. Desde otro punto de vista, el módulo PESI se puede hacer para adaptarse a varios espectrómetros de masa ajustando el accesorio de montaje. En este breve artículo, presentamos los conceptos básicos y ejemplos de aplicaciones(Figura 1), incluidas las aplicaciones con animales vivos⁵.

De acuerdo con las regulaciones y leyes de cada país, algunas partes de este protocolo tendrán que ser revisadas para cumplir con los criterios de cada institución. La aplicación al organismo vivo es la más interesante y desafiante porque puede proporcionar cambios bioquímicos o metabólicos en tejidos u órganos en animales vivos in situ. Si bien esta solicitud fue aprobada por el comité institucional para el cuidado de animales en la Universidad de Yamanashi, en 2013⁵, otra ronda de aprobación será ahora necesaria debido a los recientes cambios en las regulaciones para los experimentos con animales. Por lo tanto, son aconsejables varias modificaciones en el esquema experimental. En cuanto a los espectros de masa obtenidos en experimentos, teniendo en cuenta las fluctuaciones de los espectros de masa entre cada medición, no existe un sistema de intercambio de información espectral que sea común a la comunidad de secuenciación de nucleótidos. Se debe tener cuidado cuando el operador manihace la aguja para evitar accidentes con aguja, especialmente cuando se retira la aguja del soporte de la aguja. Un dispositivo especial para desmontar la aguja es muy útil para este propósito. Dado que el compartimiento del módulo PESI es una cámara hermética y cerrada, la fuga del penacho iónico no se produce si el espectrómetro de masas funciona de acuerdo con las instrucciones.

Protocolo

El comité institucional para el cuidado de animales de la Universidad de Yamanashi aprobó todos los protocolos y el uso de animales experimentales aquí indicados. El uso de muestras humanas fue aprobado por la junta de ética institucional de la Universidad de Yamanashi.

1. Preparación de tejidos sólidos

NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo después de su eliminación del cuerpo animal o humano para preservar la frescura del tejido. Si las mediciones no siguen inmediatamente a la disección, se recomienda almacenar tejido a -80 oC. No es aconsejable colocar el tejido en cualquier tipo de tampón o solución salina, ya que pueden extraer ciertos contenidos del tejido. El tejido que se ha fijado con aldehídos o incrustado en parafina/cera o criogel no es adecuado para las mediciones de EM.

1. Corte la muestra de tejido a aproximadamente 2 x 2 x 2 mm usando un bisturí o un cuchillo. Alternativamente, perforar la muestra con un trepan (un punzón de biopsia desechable, diámetro de 3 mm) utilizado para el examen de la piel. En este caso, recorte la longitud de la columna a 2 mm.
   NOTA: Cualquier tejido se puede analizar utilizando este método. En este experimento, el hígado¹⁵ y el riñón^19,se han analizado con éxito para obtener espectros de masa. Generalmente, los órganos parénquimales dan buenos espectros de masa, mientras que los que tienen componentes fibrosos no lo hacen.
2. Si el tejido está contaminado con sangre, lave brevemente con solución salina tamponada con fosfato helado.
   NOTA: Para minimizar el daño del tejido postmortem, complete este paso, tan pronto como sea posible, a temperatura ambiente. Si las mediciones no se realizan inmediatamente, congele el tejido en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 oC.
3. Coloque la muestra cortada o perforada (aproximadamente 10 mg) en un microtubo de plástico y agregue 100 ml de etanol al 50%.
   NOTA: El peso exacto de las muestras no se determina porque la espectrometría de masas utilizada en este sistema no proporciona datos cuantitativos. Aproximadamente 10 mg es óptimo para el tejido parénquimal.
4. Homogeneizar la muestra utilizando un micropsto.
5. Coloque 10 s de homogeneato en el pozo del cartucho(Figura 2).
6. Coloque el cartucho en la cámara de ionización del espectrómetro de masas e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de la muestra(Figura 2).
   NOTA: El fabricante suministra agujas de sonda. Están hechas de acero inoxidable y tienen un radio de curvatura de aproximadamente 400 nm.
7. Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad.
8. Inicie el equipo de a bordo haciendo clic en el icono Inicio para analizar. Usando los paneles en pantalla, aplique una tensión de 2,3 kV a la aguja para generar el electrospray y asegurarse de que la frecuencia de la aguja es de 3 Hz.
9. Espere 30 s para que se complete la medición.
   NOTA: La sesión finaliza automáticamente cuando se completa la adquisición de datos. La calidad del análisis es monitoreada por un cromatograma iónico total (TIC). El tiempo de medición se define para obtener los espectros de masa representativos y se puede acortar o ampliar.
10. Deseche el cartucho y la aguja en un eliminador de riesgo biológico después de medir cada muestra.
    NOTA: Solo se puede medir una muestra a la vez. No es necesario calibrar la máquina antes de cada medición; calibración depende del chequeo regular por parte del proveedor una vez cada seis meses.
11. Analizar los espectros de masa y exportar los datos de texto espectral de masa utilizando el software asociado con el espectrómetro de masas (ver Tabla de Materiales) como se indica en los pasos a continuación (Figura 3).
    1. Haga clic en el archivo lcd en la ventana del navegador de archivos de datos del software.
    2. Elija y haga clic en un solo pico en la ventana de espectro de masas y para representar automáticamente un cromatograma de iones extraído (EIC).
    3. Marque el TIC y el EIC y haga clic en el icono de espectro promedio para seleccionar la ventana del rango de tiempo para generar el espectro de masa.
       NOTA: En este análisis, las moléculas diana aparecen en la ventana relación masa-carga (m/z) (Figura 3). Además, debido a que la duración de la ionización por un solo golpe de movimiento de la aguja es muy corta, todos los espectros de masa obtenidos son esencialmente espectros promediados de más de 10 s (300 escaneos).
    4. Genere un archivo de texto que contenga m/z e intensidad ion haciendo clic en la pestaña Exportar para su análisis posterior. Este archivo de texto se puede almacenar en cualquier carpeta.
       NOTA: Cualquier preservativo de ARN afectará el patrón espectral nativo de las muestras. Además, es aconsejable manipular y almacenar tejido sin ningún líquido (como solución salina tamponada con fosfato) para evitar la elución de los componentes moleculares del tejido en el líquido durante el almacenamiento. Idealmente, se utilizan muestras congeladas frescas o frescas sin ningún tratamiento.

2. Preparación de fluidos corporales (suero)

NOTA: Todo este procedimiento es casi idéntico al utilizado para el tejido sólido. El cartucho para la muestra de fluido sacable está disponible en el fabricante. Debido a que la contaminación por glóbulos rojos (RBR) puede disminuir en gran medida la eficiencia de la adquisición espectral del componente previsto (plasma o suero), asegúrese de eliminar todos los glóbulos rojos centrifugando antes de las mediciones.

1. Tomar 10 ml de la muestra de suero y ponerla en un microtubo de 1,5 ml.
   NOTA: Se puede utilizar tanto suero fresco como almacenado.
2. Añadir 190 l de etanol al tubo de 1,5 ml y, a continuación, vórtice durante 2 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar el líquido a 15.000 x g durante 1-5 min a 4oC.
4. Transfiera 10 ml de sobrenadante al pozo del cartucho.
5. Coloque el cartucho en la cámara de ionización de la máquina e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de muestras(Figura 2).
6. Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad.
7. Inicie el equipo de a bordo haciendo clic en el icono Inicio para ionizar.
8. Deseche el cartucho de muestra y la aguja como se describe en 1.10 una vez que se hayan tomado las mediciones.
9. Analice los conjuntos obtenidos de EIC como se indica a continuación(Figura 3).
   1. Abra el archivo lcd en el navegador de datos.
   2. Haga clic en un solo pico para mostrar el TIC y el EIC.
   3. Seleccione la ventana de rango de tiempo para generar espectros de masa utilizando el icono de espectro promedio.
   4. Exporte el archivo generado que contiene la intensidad m/z e ion de un pico correspondiente haciendo clic en la pestaña de exportación del monitor.
      NOTA: Este procedimiento también se puede aplicar a la saliva, la orina y otros fluidos corporales.

3. Preparación para el PESI-MS in vivo en el organismo vivo

NOTA: En esta sección, se introduce una aplicación para controlar el perfil metabólico de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdU) en un modelo de ratón vivo. Use condiciones asépticas en todas las instalaciones.

1. Infundir 100 ml de solución de 100 mM 5-Fdu en la vena de la cola de un ratón de 2 meses de edad (aproximadamente 20 g de peso).
   NOTA: No hay preferencia por el sexo, la edad o la tensión del ratón. Si bien este protocolo fue aprobado en el momento en que llevamos a cabo el experimento^5,la viabilidad de este experimento depende de las restricciones éticas del país en el que se realizará.
2. Anestetiza el ratón siguiendo tu protocolo de cuidado animal aprobado. Evaluar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco de cola.
   NOTA: Si el comité ético no permite el uso de pentobarbital sódico para experimentos con animales, se pueden utilizar métodos alternativos, como el clorhidrato de ketamina.
3. Afeitar la cavidad abdominal con una maquinilla de afeitar eléctrica y aplicar pomada de ternera en los ojos.
4. Coloque el ratón anestesiado en una posición supina y fije las patas en la placa de plástico usando cinta de reparación. Frote el sitio quirúrgico con exfoliantes de 70% de alcohol tres veces.
5. Abre la cavidad abdominal con tijeras. Primero, corte la piel lateralmente (10 mm) desde justo por encima del diafragma. Corte lateralmente el músculo de la pared abdominal del cuerpo y el peritoneo (ca. 7 mm) y mantenga la herida abierta usando alambre inoxidable para exponer la superficie hepática.
   NOTA: No es necesario perfumar la superficie del hígado.
6. Aplique la punta de la aguja de la sonda sobre la superficie del hígado. Ajuste la profundidad de la aguja a aproximadamente 0,5 mm de profundidad para optimizar la eficiencia de ionización, comprobando el TIC y el patrón espectral simultáneamente. Ajuste el alto voltaje a 2,3 kV y la frecuencia a 3 Hz en la pantalla del panel de control.
7. Retire el animal de la placa de plástico.
8. Sutura restar la herida usando una sutura quirúrgica del intestino y devolver el ratón a la jaula. No deje el ratón desatendido hasta que haya recobrado la conciencia para mantener la recumbencia esternal. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
9. Realice el curso de tiempo de intensidad de iones en EIC y el procedimiento de representación EIC como en 1.11.1 a 1.11.4.

Resultados

Como se muestra en la Figura 3,los datos obtenidos por la técnica PESI-MS son los espectros de masa, cuyo rango m/z de 10 a 1.200 en este sistema. Mientras que uno puede detectar moléculas de hasta m/z 2,000, hubo pocos picos obtenidos utilizando esta técnica en el rango de masa de m/z 1,200. Por lo tanto, analizamos picos de m/z 10 a 1.200. Había grupos visibles de picos alrededor de m/z 800 y 900; el primero ...

Discusión

Aunque PESI es un derivado de ESI para espectrometría de masas⁴, es más ventajoso para el seguimiento de metabolómica en tiempo real, así como para el análisis de reacciones bioquímicas sin realizar ningún pretratamiento complejo o lento^5,14,15,17. Es una técnica de espectrometría de masas fácil e instantánea que se puede aplicar al estado integrado de los org...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020