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要約

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。

要約

従来のトランスジェネシスアプローチを使用して造血幹細胞の遺伝子を操作することは、時間がかかり、コストがかかり、困難な場合があります。ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランスジーン送達システムの進歩の恩恵を受け、造血幹細胞で遺伝子が特異的に操作されるマウスを確立する効率的かつ経済的な方法がここに記載されています。レンチウイルスは、特定の遺伝子と赤色蛍光レポーター遺伝子(RFP)を標的とするガイドRNA(gRNA)を用いてCas9発現系統陰性骨髄細胞をトランスデュースするために使用され、次いでこれらの細胞を致死照照照射C57BL/6マウスに移植する。非標的gRNAを発現するレンチウイルスで移植されたマウスは、対照として使用される。トランスプリエド造血幹細胞の移植は、末梢血のRFP陽性白血病のフローサイトメトリック解析により評価される。この方法を用いて、移植後4週間でミエロイド細胞の約90%、リンパ球細胞の約70%のトランスダクションを達成することができる。ゲノムDNAはRFP陽性血液細胞から単離され、標的部位DNAの一部をPCRによって増幅してゲノム編集を検証します。このプロトコルは、血化調節遺伝子のハイスループット評価を提供し、血化細胞関与を有する様々なマウス疾患モデルに拡張することができる。

概要

血液学と免疫学の多くの研究は、Mx1-Cre、Vav-Creなどの血液系特異的なCreドライバを利用する従来および条件付きトランスジェニック/ノックアウトマウスを含む遺伝子組み換えマウスの利用可能性に依存しています。1,2,3,4,5.これらの戦略は、時間がかかり、財政的負担になる可能性があり、新しいマウス株の確立を必要とします。ゲノム編集技術の革命的な進歩は、適切な技術的専門知識6、7、8、9とわずか3〜4ヶ月で新しいマウス株の生成を可能にしました、実験を追求する前にマウスのコロニーを増幅するためにはるかに多くの時間が必要です。さらに、これらの手順はコストがかかります。例えば、ジャクソン研究所は、ノックアウトマウス生成サービスの現在の価格を1株当たり16,845ドル(2018年12月現在)でリストしています。したがって、従来のマウストランスジェニックアプローチよりも経済的かつ効率的な方法がより有利である。

クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、迅速かつ効率的なRNAベースの配列特異的ゲノム編集のための新しいツールの開発につながっています。もともと侵入病原体DNAを破壊する細菌適応免疫機構として発見されたCRISPR/Cas9システムは、真核細胞および動物モデルにおけるゲノム編集の有効性を高めるためのツールとして使用されてきた。CRISPR/Cas9機械を造血幹細胞(例えば、エレクトロポレーション、核産生、脂肪減少、ウイルス送達など)に送達するアプローチが数多く採用されています。

ここでは、Cas9発現マウス造血幹細胞に効果的に感染し、ガイドRNA発現構造、プロモーター、調節配列、およびコードする遺伝子を一緒にパッケージ化する能力のために細胞をトランスデュースするためにレンチウイルスシステムが採用されています。蛍光レポータータンパク質(すなわち、GFP、RFP)。この方法を用いて、マウス造血幹細胞のex vivo遺伝子編集が達成され、続いて致死的に照射されたマウス10における骨髄の再構成に成功した。本研究に用いられるレンチウイルスベクターは、レポーター遺伝子から上流に上流の内部リボソーム入口部位を持つ共通コアEF1aプロモーターからのCas9およびGFPレポーター遺伝子を発現する。ガイドRNA配列は、別個のU6プロモーターから発現される。このシステムは、次いで、候補クローン無毛症ドライバ遺伝子Tet2およびDnmt3a10における挿入および欠失変異を作成するために使用される。しかし、この方法による経流効率は比較的低い(~5%-10%)。伝達効率を制限し、生産中にウイルス力を減少させるベクター挿入物(13 Kbp)の大きさのために。

他の研究では、より大きなウイルスRNAサイズがウイルス産生とトランスダクション効率の両方に悪影響を及ぼすことが示されている。例えば、挿入サイズの1kbの増加は、ウイルス産生を〜50%減少させることが報告され、および経転移効率はマウス造血幹細胞11において50%以上に減少する。したがって、システムの効率を向上させるためにウイルスインサートのサイズを可能な限り小さくすることが有利である。

この欠点は、Cas9トランスジェニックマウスを採用することによって克服することができ、Cas9タンパク質は構成的または誘導可能な方法12のいずれかで発現される。構成的なCRISPR/Cas9ノックインマウスは、ローザ26遺伝子座のCAGプロモーターからCas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPをユビキタスな方法で発現する。これにより、コアEF1aプロモーターの制御下にあるU6プロモーターおよびRFPレポーター遺伝子の制御下でsgRNAを用いて構築し、レンチウイルスベクターを用いてゲノム編集を達成することができる。このシステムにより、造血幹細胞の遺伝子の編集に成功し、約90%の経流効率を示しました。したがって、このプロトコルは、標的遺伝子変異が人工系に導入されるマウスを迅速かつ効果的に作成する方法を提供する。私たちの研究室は、主に心血管疾患プロセス13、14、15におけるクローンヘマチオピスの役割を研究するために、このタイプの技術を使用していますが、それはまた、血液学の研究に適用可能です悪性腫瘍16.さらに、このプロトコルは、HSPCにおけるDNA突然変異が、人工システムにおける他の疾患または発達過程にどのように影響するかの分析に拡張することができる。

堅牢なレンチウイルスベクターシステムを確立するためには、高価気力ウイルスストックと血行細胞の移植および移植のための最適化された条件が必要とされる。プロトコルでは、セクション1の高チテーターウイルスストックの調製に関する指示が提供され、セクション2におけるマウス造血幹細胞の培養条件を最適化し、セクション3における骨髄移植の方法、および評価を行う。セクション4の移植。

プロトコル

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. レンチウイルス粒子の生成と精製

注:最適化されたガイドRNAを含むレンチウイルス粒子は、Addgeneによって提供される詳細なプロトコルによって生成することができます: 。高チターレンチウイルスの調製および貯蔵のための最適化された方法は、他の場所で議論されています 17,18.簡単に言えば、レンチウイルスは、レンチウイルスベクタープラスミド、psPAX2、およびpMD2.GをHEK 293T細胞に共トランスフェクションすることによって産生される。培養上清は48時間後トランスフェクションで採取し、超遠心分離によって濃縮される。レンチウイルス力価は、市販のqPCRベースのアッセイによって決定される。この手順は、バイオセーフティクラスIIキャビネットで実行する必要があります。

  1. コラーゲンの1:200溶液を調作する(0.0005%)1x PBSで。
  2. 6ウェルプレートにコラーゲン溶液を塗り、37°C、5%CO2~30分間インキュベートします。
  3. 種子293T細胞をウェル当たり1x106細胞の密度で、37°C、5%CO2〜2hでインキュベートする。
  4. 3つのトランスフェクションプラスミドを1つのウェルに対して調製するには、レンチウイルスベクターの0.9 μg、psPAX2の0.6 μg、pMD2.Gの0.3 μgを組み合わせ、脱イオン水を加えて10μLの総体積を達成します。井戸の数に応じて、それに応じて量を調整します。各プラスミドの量と比率は、研究者のニーズに合わせてさらに最適化する必要があります。.
  5. 希釈されたPEI MAX(1.0mg/mL)の1x PBSの50 μLと5μLをプラスミド混合物に慎重に加え、室温(RT)で15分間インキュベートします(表1)。
  6. 混合物にDMEMの1 mLを追加します。
  7. 6ウェルプレートから吸引培地を、プラスミド混合物の1mLを加え、37°C、5%CO2〜3時間でインキュベートする。
  8. 新鮮なDMEMの2 mLでメディアを交換し、37 °C、24時間のCO25%でインキュベートします。
  9. 新鮮なDMEMを1mL加え、37°Cでインキュベートし、さらに24時間(合計インキュベーション時間は48時間)の場合は5%CO2をインキュベートします。
  10. 培養上清を50mLチューブに移し、遠心分離機を3,000 x gで15分間移し、自由浮動細胞を除去します。
  11. 0.45 μm フィルターを通して上清をフィルター処理します。
  12. 濾液をポリプロピレン遠心管に移します。
  13. 4 °Cおよび72,100 x gのr最高で3時間の超遠心分離機。
  14. 慎重に上清を吸引し、白いペレットの後ろに残します。
  15. 無血清無血質細胞膨張培地の100μLを通気なしでペレットを再中断する。
  16. 10 μLのアリコートを保持してウイルスの定量を測定し、必要になるまで-80 °Cで残りのアリコートをすべて保存します。
  17. 10 μLウイルスアリコートを使用して、製造元の指示に従ってqPCRベースのアッセイでウイルスを刺激します。

2. マウス骨髄からの系統陰性細胞の単離と伝達 (図1A)

注:通常、十分な細胞を単離するために、脛骨、大腿骨、およびフエリのペアは、各マウスから収穫される。骨盤および脊柱の骨はまた系統陰性細胞の源として収穫されてもよい。

  1. 骨髄細胞の分離
    1. 8-10週齢の雄CRISPR/Cas9ノックインマウスを5%イソフランで安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、70%のエタノールで皮膚を消毒する。
    2. 解剖はさみを使用して、胸部のすぐ下の皮膚に横切開を行い、脚と腕を露出させるために両方向に皮膚を遠離して剥離します。
    3. 股関節を脱臼して下肢を股関節から慎重に分離します。大腿骨の頭部に沿って切断し、股関節から大腿骨を完全に取り除きます。膝を外し、骨のエピフィシスをそのままにしながら、大腿骨と脛骨を分離するために関節で切断します。足首関節を外し、足と余分な筋肉を剥離します。
    4. 解剖はさみを使用して、上肢を切り離すために肩の上にカットします。肩を外し、肘関節で切断して骨を採取する。
    5. セルロース繊維ワイプを使用して、大腿骨、脛骨、フセリから筋肉を慎重に除去します。このプロセス中に骨が壊れないように特別な予防措置を講じてください。
    6. 分離した骨をRPMIを含む50mLの円錐形チューブに入れ、氷の上に置きます。
      注:バイオセーフティクラスIIキャビネットでは、以下の手順を実行する必要があります。
    7. 無菌の100mm培養皿に骨を移します。
    8. 鈍い鉗子で骨をつかみ、解剖はさみを使用して、慎重に両方のエピフィスをカットします。
      注:切断が不十分になると骨髄のフラッシュが不完全になりますが、過度に積極的な切断は細胞喪失につながります。
    9. 10 mL注射器を氷冷RPMIで充填し、22Gの針を使用して、シャフトから骨髄を新しい100mm培養皿に洗い流します。
      注: ボーン シャフトが十分にフラッシュされている場合、ボーンは白く半透明になります。そうでない場合は、骨の端部を再切断し、再びフラッシュします。
    10. すべての骨髄が収集された後、18 G針で10 mL注射器を通して骨髄を数回通過させることによって単細胞懸濁液を作る。10x を繰り返して、単一セルの懸濁液を確保します。
    11. 70 μmの細胞ストレーナーを通して50 mL円錐管に細胞懸濁液をフィルターする。
    12. 4 °Cで10分のための310 x gの遠心分離機。
    13. 上清を吸引し、次の細胞分離プロセスに最適化された分離バッファーの適切なボリュームで細胞ペレットを再中断します。
  2. 系統陰性細胞の単離とレンチウイルスの伝導
    注:マウス系統陰性細胞は、Cas9トランスジェニックマウス3、またはマウスの他の株の骨髄から単離され、製造業者の指示に従って系統枯渇キットを使用する。典型的には、系統陰性細胞は骨髄核細胞全体の2%~5%を占め、純度は通常、単離後の90%を超える。単離された系統陰性細胞は、20 ng/mL組換えマウスTPOおよび50 ng/mL組換えマウスSCFを補充した無血清無血性血化細胞拡張培地で培養され、その後、多重性で16時間レンチウイルスベクターでトランスメアリングされる。感染 (MOI) = 100。
    1. 系統陰性細胞を単離するには、製造元の指示に従って系統細胞枯渇キットを使用してください。
    2. 単離後、血清フリー血統細胞膨張培地の1mLで系統陰性細胞を再中断した。
    3. 1.5 x 106細胞/mL(5 x 105系統陰性細胞/マウス)の密度で6ウェルプレートに細胞をシードします。
    4. 組換えマウス TPO と SCF をそれぞれ 20 ng/mL および 50 ng/mL の最終濃度でウェルに追加します。
    5. 37°Cで細胞を5%CO2~2hの予備インキュベートする。
    6. MOI=100、4 μg/mLポリブレン、ペニシリン/ストレプトマイシンをウェルに加え、37°Cでインキュベートし、16-20h(図1B)に5%CO2を加えます。
    7. 翌日、レンチウイルス変換細胞を15mL円錐管に集め、遠心分離機を300gで10分間集める。
    8. 上清を注意深く吸引し、マウス当たり200μLのRPMIでペレットを再中断します。マウスに移植されるまでRTで細胞を保つ(セクション3)。

3. 細胞を照射したマウスへの移植

  1. 骨髄移植の日に、レシピエントマウスを8スライスパイケージに入れ、全身照射(550 Rad/dose、総用量=1100 Rad)の2回の投与量にさらし、各照射セッションの間に約4時間を投与する。
  2. 2回目の照射セッションの後、インスリン注射器を用いてレトロ軌道静脈神経叢(合計200μL)を介して各麻酔レシピエントマウスに系統陰性細胞を注入する(図1C)。
  3. 照射後、マウスは殺菌ケージに収容され、14dの抗生物質を補充した柔らかい食事と飲料水を提供する必要があります。
  4. 骨髄移植後3~4週間で末梢血を分析し、トランスメーションドナー細胞の生着を確認する(セクション4)。

4. 末梢血のキメラを評価する

  1. 5%イソファルランでマウスを麻酔し、毛細管を用いてレトロ軌道静脈から血液サンプルを採取し、K2EDTAチューブに集める(1つの毛細管内の体積は、以下のアッセイに対して十分である)。
  2. K2EDTAチューブから20μLの血液を5mL丸底ポリスチレン試験管に移し、氷の上に置きます。
  3. 赤血球をlyseするためにRBCリシスバッファーの1.5 mLを追加します。氷の上で5分間インキュベートします。
  4. ライシスバッファーを中和するには、FACSバッファー(1.5 mL/サンプル)でサンプルを洗浄します。
  5. 4 °Cで5分間rの最高で609 x gの遠心分離機。上清を捨てます。
  6. モノクローナル抗体のカクテルで細胞をインキュベート(100 μL FACSバッファー/サンプルで希釈)を暗闇の中で20分間RTでインキュベートします。抗体の完全なリストは、上記の材料セクションで提供されています。
  7. FACSバッファ(2 mL/サンプル)で細胞を1回洗浄します。609 x gの r最大(1,800 rpm) で、4 °C で 5 分間遠心分離機。上清を完全に廃棄します。
  8. 4°Cで10分間、固定バッファー(100μL/チューブ)を含むパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
  9. FACSバッファー(3 mL/サンプル)で細胞を1回洗浄します。609 x gの r最大(1,800 rpm) で、4 °C で 5 分間遠心分離機。上清を完全に廃棄します。
  10. FACSバッファーの400 μLでペレットを中断します。
  11. フローサイトメトリーによる分析まで4°Cでサンプルを保管してください。

結果

上記のプロトコルを用いて、マウス当たり約0.8〜1.0 x 108個の骨髄細胞が得られた。我々が得る系統陰性細胞の数は、マウスあたり約3 x 106細胞である。典型的には、骨髄系統陰性細胞の収率は、全骨髄核細胞の4%〜5%である。

トランスメ因細胞のキメラ(RFP陽性)は、末梢血の流れサイトメトリーによって評価...

ディスカッション

このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、迅速かつ非常に費用対効果の高い方法で血化細胞の特定の変異を収容する動物モデルの作成です。この方法論により、造血細胞遺伝子操作を1ヶ月以内にマウスの生成が可能となることがわかった。このプロトコルには、さらに検討が必要な重要な手順がいくつかあります。

gRNA配?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

S.S.は、アメリカ心臓協会のポスドク・フェローシップ17POST33670076によって支援されました。K. W. は、NIH 助成金 R01 HL138014、R01 HL141256、および R01 HL139819 によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
293T cellsATCCCRL-3216--Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)BD Biosciences560599Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 mlBD309604general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA addedBD Bioscience365974general supply
BD Precisionglide needle, 18 GBD305195general supply
BD Precisionglide needle, 22 G BD305155general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7)Biolegend100752Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11)Biolegend100349Antibodies
Collagen from calf skinSigma-Aldrich9007-34-5general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well Millipore SigmaCLS3471general supply
CRISPR/Cas9 knock-in miceThe Jackson Laboratory028555mouse
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tubeLife Sciences352054general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate Life Science353046general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubesThermo Fisher Scientific22-362566general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)Invitrogen11-0042-85Antibodies
Fixation BufferBD Bioscience554655Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening SystemsClontech632636Kit
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit Takara631235Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mmMillipore SigmaSLHV004SLgeneral supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)eBioscience25-1152-82Antibodies
PEI MAXPolysciences24765-1Solution
Penicillin-Streptomycin MixtureLonza17-602FSolution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)BD Biosciences560602Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plasmid
pMG2DAddgene12259Plasmid
Polybrene Infection/Transfection ReagentSigma AldrichTR-1003-GSolution
Polypropylene Centrifuge TubesBECKMAN COULTER326823general supply
psPAX2 Addgene12260Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
Recombinant Murine SCFPeprotech250-03Solution
Recombinant Murine TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 

参考文献

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152CRISPR Cas9Cas9

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