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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

Zusammenfassung

Die anhaltende Entzündungswirtsreaktion auf ein implantiertes Biomaterial, die sogenannte Fremdkörperreaktion, stellt eine große Herausforderung bei der Entwicklung und Umsetzung biomedizinischer Geräte und Gewebetechnikkonstrukte dar. Makrophagen, eine angeborene Immunzelle, sind Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion, weil sie während der Lebensdauer des Geräts an der Implantatstelle bleiben und häufig untersucht werden, um ein Verständnis dieser schädlichen Wirtsreaktion zu erlangen. Viele Biomaterialforscher haben gezeigt, dass adsorbierte Proteinschichten auf implantierten Materialien das Makrophagenverhalten beeinflussen und anschließend die Wirtsreaktion beeinflussen. Die Methoden in diesem Papier beschreiben ein In-vitro-Modell mit adsorbierten Proteinschichten, die zelluläre Schadensmoleküle auf Polymerbiomaterialoberflächen enthalten, um Makrophagenreaktionen zu bewerten. Als schnelles Verfahren zur indirekten Untersuchung der NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten, die Blutproteine und schadensassoziierte molekulare Muster enthalten, wurden eine NF-B/AP-1-Makrophagen-Zelllinie und der zugehörige farbmetrische alkalische Phosphatase-Assay als schnelle Methode verwendet, um indirekt die Aktivität des NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktors als Reaktion auf komplexe adsorbierte Proteinschichten mit Blutproteinen und schadensassoziierten molekularen Mustern als Modell der komplexen adsorbierten Proteinschichten zu untersuchen, die auf biomaterialen Oberflächen in vivo gebildet wurden.

Einleitung

Die Fremdkörperreaktion (FBR) ist eine chronische Wirtsreaktion, die sich negativ auf die Leistung eines implantierten Materials oder Geräts (z. B. Arzneimittelabgabegeräte, Biosensoren) auswirken kann, durch die anhaltende Freisetzung von Entzündungsmediatoren und durch Behinderung der Integration zwischen dem implantierten Material und dem umgebenden Gewebe1. Diese angeborene Immunantwort wird durch das Implantationsverfahren eingeleitet und zeichnet sich durch die langfristige Präsenz angeborener Immunzellen und faseriger Kapselbildung um das Implantat1aus. Im Kontext von materialbasierten Host-Antworten haben Makrophagen-Material-Wechselwirkungen einen signifikanten Einfluss auf den Verlauf der Host-Antwort und die Entwicklung eines FBR1. Makrophagen sind eine vielfältige angeborene Immunzellpopulation, die entweder aus geweberesidenten Makrophagenpopulationen oder aus dem Blut als monozytenabgeleitete Makrophagen an die Implantatstelle rekrutiert wird. Sie beginnen sich kurz nach der Implantation an der Implantatstelle anzusammeln und werden innerhalb weniger Tage zur vorherrschenden Zellpopulation in der Mikroumgebung des Implantats. Materialhafte Makrophagen, zusammen mit Fremdkörper-Riesenzellen (FBGC), die durch Makrophagenfusion gebildet werden, können an der Materialoberfläche über die Lebensdauer des Implantats2,3bestehen bleiben. Makrophagen gelten daher aufgrund ihrer Rolle bei der Orchestrierung der charakteristischen Schritte des FBR als Schlüsselakteure in der Fremdkörperreaktion: akute Entzündungsreaktion, Gewebeumbau und Bildung von fibrotischem Gewebe1.

Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Mustererkennungsrezeptoren, die von vielen Immunzellen ausgedrückt werden, einschließlich Makrophagen, und haben gezeigt, dass eine bedeutende Rolle bei Entzündungen und Wundheilung spielen. Zusätzlich zu pathogenen Liganden sind TLRs in der Lage, endogene Moleküle, sogenannte damage-associated molecular patterns (DAMPs), zu binden, die während der Zellnekrose freigesetzt werden, und entzündliche Signalwege zu aktivieren, die zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führen4. Wir und andere haben vorgeschlagen, dass Schäden, die während der Implantation von Weichgewebebiomaterial entstehen, DAMPs freisetzen, die dann zusätzlich zu Blutproteinen auf biomateriale Oberflächen adsorbieren und nachfolgende Zell-Material-Wechselwirkungen modulieren5,6. Wenn Makrophagen mit der adsorbierten Proteinschicht auf einem Implantat interagieren, können ihre Oberflächen-TLRs adsorbierte DAMPs erkennen und proinflammatorische Signalkaskade aktivieren, was zur Aktivierung des NF-B- und AP-1-Transkriptionsfaktors und zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen führt. Wir haben bereits gezeigt, dass murine Makrophagen die NF-B/AP-1-Aktivität und den Tumornekrosefaktor proinflammatorischezytokin) Sekretion als Reaktion auf DAMP-haltige adsorbierte Proteinschichten auf einer Vielzahl von polymeren Oberflächen im Vergleich zu Oberflächen mit nur adsorbiertem Serum oder Plasma (d. h. keine DAMPs vorhanden), und dass diese Reaktion weitgehend durch TLR2 vermittelt wird, während TLR4 eine geringere Rolle spielt5.

Die in diesem Protokoll verwendete Makrophagen-Zelllinie nF--B/AP-1-Reporter (Tabelle der Materialien) ist eine praktische Methode, um die relative NF-B- und AP-1-Aktivität in den Makrophagen5,7,8zu messen. In Kombination mit TLR-Signalweg-Inhibitoren ist diese Zelllinie ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der TLR-Aktivierung und ihrer Rolle bei Entzündungen als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen5,7,8. Die Reporterzellen sind eine modifizierte Mausmakrophagen-ähnliche Zelllinie, die bei NF-B und AP-1 Transkriptionsfaktoraktivierung9stabil abgesonderte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) erzeugen kann. Der kolorimetrische enzymatische alkalische Phosphatase-Assay (Materialtabelle) kann dann verwendet werden, um relative Mengen der SEAP-Expression als indirektes Maß für die NF-B/AP-1-Aktivität zu quantifizieren. Da NF-B und AP-1 nach geschaltet von vielen Zellsignalsignalpfaden sind, können neutralisierende Antikörper und Inhibitoren, die auf bestimmte TLRs (z. B. TLR2) oder TLR-Adaptermoleküle (z. B. MyD88) abzielen, verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Signalwegs zu überprüfen. Die in diesem Artikel beschriebene Methodik bietet einen einfachen und schnellen Ansatz zur Bewertung des Beitrags der TLR-Signalisierung in murinen Makrophagenreaktionen zu einer Vielzahl von polymeren Oberflächen mit adsorbierten Proteinschichten, die sowohl Blutproteine als auch DAMPs als In-vitro-Modell implantierter Biomaterialien enthalten.

Protokoll

1. Medien- und Reagenzienzubereitung

  1. Bereiten Sie Fibroblastenmedien vor. Kombinieren Sie 450 ml dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), 50 ml fetales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin/Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  2. Bereiten Sie Reporter Makrophagen Wachstumsmedien in 50 ml Aliquots. Kombinieren Sie 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 5 g/ml Mykoplasma-Eliminationsreagenz (Materialtabelle) und 200 g/ml Phleomycin D1(Materialtabelle). Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  3. Bereiten Sie Reporter Makrophagen Assay Medien in 50 ml Aliquots. Kombinieren Sie 45 ml DMEM, 5 ml inaktivierte FBS (HI-FBS), 5 g/ml Mykoplasmen-Eliminationsreagenz und 200 g/ml Phleomycin D1. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.

2. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit Poly(Methylmethacrylat)

  1. Poly(Methylmethacrylat) (PMMA) in Chloroform bei 20 mg/ml (z. B. 100 mg PMMA in 5 ml Chloroform) in einer 20 ml Glasszintillationsdurchstechflasche auflösen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Durchstechflasche und lassen Sie sie mindestens 2 h rühren, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben.
    ACHTUNG: Chloroform ist schädlich, wenn es eingeatmet wird. Achten Sie darauf, Lösungsmittel in einer Dunstabzugshaube zu verwenden, während Sie PVA-Handschuhe tragen.
  2. Pipette 400 l PMMA-Lösung in der Mitte eines Borosilikatglasmikroskop-Dias in einem Spincoater und Drehung bei 3000 U/min für 2 min. Bereiten Sie die Anzahl der für den Test erforderlichen Dias sowie 3-5 extra für die Wasserkontaktwinkelmessung vor. Lagern Sie Dias in einer sauberen Box (gesprüht und mit 70% Ethanol gewischt) für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: Spin-Beschichtung wird oft verwendet, um eine dünne, gleichmäßige Beschichtung auf einer flachen Oberfläche abzulagern. Ein Spincoater dreht ein Substrat mit hohen Geschwindigkeiten und verteilt die Beschichtungslösung mit Zentrifugalkraft über die Oberfläche.
    1. Messen Sie den Wasserkontaktwinkel an zwei zufälligen Positionen auf der Oberfläche von extra beschichteten Dias (d. h. nicht die für die Zellkultur verwendeten Dias) mit einem Goniometer, um sicherzustellen, dass die Glasoberfläche vollständig mit dem Polymer beschichtet wurde.
      HINWEIS: Für Wasserkontaktwinkelmessungen sollte nur Wasser mit höchster Reinheit (z.B. Glas dreifach destilliert) verwendet werden.
  3. In einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) befestigen 8-Kammer-Haftbrunnen mit steriler Zange und aseptischer Technik an PMMA-beschichteten Dias. Drücken Sie fest auf die Oberseite der klebrigen Brunnen, um sicherzustellen, dass sie fest befestigt sind. Inkubieren Sie die Dias mit befestigten Klebebrunnen bei 37 °C über Nacht, um die Dichtung zu sichern.
    1. Testen Sie die Abdichtung der klebrigen Brunnen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Zellkultur-Grade (endotoxinfreies) Wasser hinzufügen. Bei Raumtemperatur (RT) 60 min inkubieren und vor dem Fortfahren keine Leckage sicherstellen. Saugen Sie das Wasser, achten Sie darauf, die PMMA-Beschichtung nicht zu stören.
  4. Führen Sie endotoxinfreie Wasserwaschungen durch Zugabe von 300 l Endotoxin-freies Wasser zu jedem Brunnen und Inkubation für 1 h (dreimal), 12 h und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
  5. Testen Sie die Endotoxinkonzentration der Dias, die für die Zellkultur verwendet werden sollen. Inkubieren Sie 200 l Endotoxin-freies Reagenzwasser (Materialtabelle) in einem Brunnen jedes Dias für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration im Extrakt mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Materialtabelle).
    HINWEIS: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das Endotoxin-Assay-Kit, das in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist.
  6. Verwenden Sie für diese Arbeiten nur Wasser und Verbrauchsmaterialien (z.B. Pipettenspitzen, Mikrozentrifugenrohre und Brunnenplatten), die pyrogenfrei (d.h. endotoxinfrei) sind. Außerdem sollten alle Glaswaren, die bei der Herstellung der polymerbeschichteten Oberflächen verwendet werden, vor der Verwendung10mit trockener Wärmesterilisation (250 °C für 30 min) depyrogeniert werden. Die Messung von Endotoxin in der Extraktlösung, wie hier beschrieben, kann zu einer Unterschätzung von Endotoxin auf der Materialoberfläche11,12führen. Daher wird empfohlen, bei der Entwicklung eines Polymerbeschichtungsprotokolls die Endotoxin-Assay-Reaktion (d. h. die Schritte 2.5.4-2.5.6 für Prüfmuster [Reagenzwasser] oder Spike-Kontrollen) direkt in Brunnen durchzuführen, die die beschichtete Probe enthalten, um sicherzustellen, dass während des Beschichtungsprozesses versehentlich keine Endotoxinquellen in das System eingeführt werden.
    1. Alle Testproben (d. h. Extrakte) und Endotoxin-Assay-Reagenzien zu RT bringen. Chromogenes Reagenz im Testpuffer und Endotoxinstandard in Reagenzwasser rekonstituieren, 5 min auflösen lassen und vor der Verwendung sanft wirbeln. Bedecken Sie alle Flaschen mit Paraffinfolie, wenn sie nicht verwendet werden.
    2. Erstellen Sie eine Standardverdünnungskurve von 5 x 8 Punkten des Endotoxinstandards, die von der unteren bis zur oberen Grenze des Assays reicht, indem Sie eine serielle Verdünnung des Endotoxinstandards in Reagenzwasser durchführen.
    3. Zur Kontrolle der Verbesserung oder Hemmung des Endotoxin-Assays in Testproben, bereiten Sie eine positive Kontrolle (auch spike Control oder Spike-Probe genannt) durch Verdünnung einer bekannten Menge an Endotoxin in nicht verwendeten Testprobenlösung.
      HINWEIS: Die Konzentration der Positivkontrolle sollte die gleiche Konzentration wie bei einem Standard in der Mitte der Standardkurve sein. Liegt die wiedergewonnene Menge des Endotoxin-Spikes (d. h. die Konzentration der Positivkontrolle abzüglich der Konzentration der nicht gespickten Testprobe) innerhalb von 50 bis 200 % der Nominalkonzentration des Endotoxin-Spikes, kann davon ausgegangen werden, dass die Extraktionslösung den Test nicht wesentlich beeinträchtigt.
    4. Fügen Sie jedem Bohrwert einer 96-Well-Platte in doppelter oder dreifacher Ausführung 50 L Standards, Proben oder Spike-Steuerelemente hinzu. Verwenden Sie Reagenzwasser als Negativkontrolle.
    5. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l chromogenes Reagenz hinzu. Reagenz schnell in alle Brunnen geben. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit aufzuzeichnen, die zum Hinzufügen von Reagenz zu allen Brunnen benötigt wird. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebedichtung und brüten Sie bei 37 °C (die Inkubationszeit ist losabhängig und wird auf dem im chromogenen Reagenz-Kit enthaltenen Analysezertifikat angegeben). Alternativ können Sie die Platte während der Inkubation alle 15 min überprüfen, bis in allen Standardbrunnen ein Farbwechsel beobachtet wird.
    6. Nach der Inkubation 25 l 50 % Essigsäure in jeden Brunnen (Endkonzentration von 10 % Essigsäure pro Brunnen) hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie Essigsäure in der gleichen Reihenfolge hinzu, in der das chromogene Reagenz zugegeben wurde. Leseabsorption der Platte mit einem Plattenleser bei 405 nm. Anspirieren Flüssigkeit und Entsorgen Platte.
      HINWEIS: Essigsäure-Zugabe sollte die gleiche Zeit dauern, um zu jedem Brunnen hinzuzufügen, wie das chromogene Reagenz genommen (ca. 30 s).
  7. Ultraviolett (UV) sterilisieren die Dias 30 min vor Zellkulturexperimenten.

3. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit Polydimethylsiloxan

  1. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härtungsmittel) mischen. In einem biologischen Sicherheitsschrank, Pipette ca. 10 ml Polydimethylsiloxan Basis in ein steriles Rohr. Wiegen Sie das Rohr und fügen Sie langsam Aushärtungsmittel hinzu, bis 10% hinzugefügt wurde.
    ACHTUNG: Verwenden Sie PDMS-Reagenzien in einem gut belüfteten Bereich und vermeiden Sie Augenkontakt durch das Tragen einer Schutzbrille.
  2. Mischen Sie das Elastomer gründlich, indem Sie es mit einer sterilen serologischen Pipettenspitze rühren und nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie ca. 200 l der Lösung zu jedem Brunnen einer 48-Well-Platte hinzu. Neigen Sie die Brunnenplatte langsam, um eine vollständige Abdeckung der Brunnen mit Elastomerlösung zu gewährleisten.
  3. Die Brunnenplatte mit Elastomer in einen Vakuumofen auf 50 cmHg, 40 °C legen. Entfernen Sie den Deckel und decken Sie ihn mit einem einpolsterigen Wischabbild ab, um zu verhindern, dass andere Trümmer in die Brunnen fallen. Mindestens 48 h inkubieren lassen.
    1. Bestätigen Sie, dass die Brunnen durch Sichtprüfung vollständig beschichtet sind. Stellen Sie sicher, dass das Elastomer vollständig gehärtet ist, indem Sie es vor dem Entfernen vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze antreiben.
  4. Fügen Sie 300 l 70% Ethanol (hergestellt mit absolutem Ethanol und Endotoxin-freiem Wasser) hinzu und brüten bei RT für 1 h. Entfernen Sie das Ethanol und führen Sie Endotoxin-freie Wasserwashes durch, indem Sie jedem Brunnen 300 l Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und 1 h (dreimal), 12 h, 12 h inkubieren. und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
    1. Inkubieren Sie 200 l Endotoxinfreies Wasser in drei Brunnen jeder Platte für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration der Wasserextrakte mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Schritte 2.5.1-2.5.6).

4. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit fluoriertem Poly (Tetrafluorethylen)

  1. Machen Sie eine 1 mg/ml Lösung aus fluoriertem Poly (Tetrafluorethylen) (fPTFE) (z. B. 10 mg fPTFE zu 10 ml fluoriertem Lösungsmittel [Materialtabelle]) in einer 20 ml Glasszintillationsdurchstechflasche hinzufügen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Durchstechflasche und lassen Sie sie mindestens 24 h rühren, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben.
  2. Fügen Sie ca. 150 l der Polymerlösung zu jedem Brunnen einer Polystyrol-48-Well-Platte hinzu (d. h. nicht gewebekultur behandelt). Neigen Sie die Wellplatte langsam, um eine vollständige Abdeckung aller Brunnen mit Polymerlösung zu gewährleisten. Deckel ersetzen.
    1. Um eine effektive fPTFE-Beschichtung von Brunnen zu gewährleisten, sollten Glasabdeckungen in fPTFE beschichtet und für die Wasserkontaktwinkelmessung verwendet werden (Schritt 4.3.1). Legen Sie Deckellippen in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Fügen Sie ca. 400 l der Polymerlösung zu jedem Brunnen hinzu, der einen Abdeckschlupf enthält. Drücken Sie die Abdeckungen mit sterilen Zangen nach unten, um sicherzustellen, dass sie vollständig mit Polymerlösung bedeckt sind, und bedecken Sie die Wellplatte mit einem Deckel.
  3. Die Wellplatte mit Polymerlösung und/oder Decklippen in einen Vakuumofen auf 50 cmHg, 40 °C legen. Entfernen Sie den Deckel und decken Sie ihn mit einem einpolsterigen Wischabbild ab, um zu verhindern, dass andere Trümmer in die Brunnen fallen. Mindestens 48 h inkubieren lassen.
    1. Messen Sie den Wasserkontaktwinkel von fPTFE-beschichteten Abdeckungen mit einem Goniometer, um eine effektive Beschichtung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für Wasserkontaktwinkelmessungen sollte nur Wasser mit höchster Reinheit (z.B. Glas dreifach destilliert) verwendet werden.
  4. Fügen Sie 300 l 70% Ethanol (hergestellt mit absolutem Ethanol und Endotoxin-freiem Wasser) hinzu und brüten bei RT für 1 h. Entfernen Sie das Ethanol und führen Sie Endotoxin-freie Wasserwashes durch, indem Sie jedem Brunnen 300 l Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und 1 h (dreimal), 12 h, 12 h inkubieren. und 24 h vor der Verwendung, um alle verbleibenden Lösungsmittel zu entfernen.
    1. Inkubieren Sie 200 l Endotoxinfreies Wasser in drei Brunnen jeder Platte für 1 h. Messen Sie die Endotoxinkonzentration von Wasserextrakten mit einem Endpunkt chromogenen Endotoxin-Assay (Schritte 2.5.1-2.5.6).
  5. UV sterilisieren die Brunnenplatten für 30 min vor Zellkulturexperimenten.

5. Lysat aus 3T3-Zellen herstellen

  1. Wachsen Sie 3T3-Zellen in mehreren T150-Flaschen zu 70% Zusammenfluss. Um Zellen zu lösen, aspirieren Sie Medien, waschen Sie die Oberfläche mit 5 ml PBS und aspirieren PBS. 5 ml tierursprungsfreies, rekombinantes Zelldissoziationsenzym (Materialtabelle) hinzufügen und bei 37 °C für 3 x 5 min inkubieren.
  2. Lösen Sie Zellen, indem Sie den Kolben sanft hin und her kippen. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, um das rekombinante Enzym zu neutralisieren, das für die Zelldissoziation verwendet wird. Die abgetrennten Zellen aus den Kolben in ein Zentrifugenrohr übertragen und über Pipettieren mischen. Führen Sie eine Live-Zellzahl mit einem Hämozytometer und zelllebensfähigkeitsfärben.
    HINWEIS: Ein Zelldissoziationsenzym, das durch Verdünnung in PBS neutralisiert werden kann, wurde ausgewählt, um die Einführung von serumbasierten Proteinen in die Lysatzubereitung zu vermeiden. Wenn Trypsin verwendet wird, um Zellen zu dissoziieren, sollte es mit einer serumhaltigen Lösung neutralisiert werden, und eine zusätzliche PBS-Wäsche sollte durchgeführt werden, um die Menge an Serumproteinen zu reduzieren, die in die Lysatzubereitung übertragen werden.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im ursprünglichen Volumen (d. h. 10 ml x Anzahl der Kolben) von PBS ab, um alle verbleibenden Medien abzuwaschen. Wiederholen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min wieder bei 200 x g und aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie das Volumen von PBS hinzu, das erforderlich ist, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Legen Sie die Zelllösung in einen -80 °C-Gefrierschrank, bis die Probe vollständig eingefroren ist (mindestens 2 h).
  5. Zelllösung in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Nach dem vollständigen Auftauen die Lösung wieder in den -80 °C-Gefrierschrank geben, bis sie vollständig gefroren ist. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Gefrier-Tau-Zyklen.
  6. Führen Sie einen Mikro-Bicinchoninsäure-Assay (BCA) auf die Zelle Lysat bei einer Vielzahl von Verdünnungen (z. B. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Das Zelllysat auf eine Proteinkonzentration von 468,75 g/ml, aliquot verdünnen und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
    HINWEIS: Die endgültige Proteinkonzentration in einer 48-Well-Platte beträgt 125 g/cm2 (basierend auf der Oberfläche eines Brunnens, 0,75 cm2).
  7. Führen Sie einen Western-Blot durch, um das Vorhandensein von DAMPs in Lysat (z. B. Hitzeschockprotein 60 [HSP60], Gruppe mit hoher Mobilität 1 [HMGB1]) zu bewerten, indem Sie 40 bis 60 g Lysatprotein im Ladepuffer auf ein 1,5 mm dickes 10% Polyacrylamid-Gel laden und dem Standard-Western-Blot folgen. Verfahren.

6. Bewertung der Wirkung von adsorbierten Proteinschichten und gebührenähnlichen Rezeptoren auf die NF-B-Aktivität von Makrophagen

HINWEIS: Einen Schaltplan des experimentellen Workflows und des Plattenlayouts finden Sie in Abbildung 1A bzw. In Ergänzungsabbildung 1.

  1. Wachsen Sie Reporter-Makrophagen in einem entsprechend großen Kolben zu 70% Zusammenfluss. Aspirate-Medien, Waschfläche mit PBS und Aspirieren PBS. Fügen Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym hinzu und brüten Bei 37 °C für 8 min.
  2. Lösen Sie Zellen, indem Sie fest auf die Seiten des Kolbens tippen. Inaktivieren Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym, indem Sie ein gleiches Volumen an Wachstumsmedien (mit 10% FBS) hinzufügen. Führen Sie eine Live-Zellzahl mit einem Hämozytometer und zelllebensfähigkeitsfärben.
    HINWEIS: Die erwartete Lebensfähigkeit des Reporters Makrophagen nach einer 8 min Inkubation im Zelldissoziationsenzym beträgt 90%.
  3. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Überstand und resuspendieren im ursprünglichen Volumen von PBS, um Zellen zu waschen. Zentrifugieren und wieder zusetzen Zellen bei 7,3 x 105 Zellen/ml in Assay-Medien (mit wärmeinaktiviertem FBS).
  4. Separate Zellsuspension in 3 verschiedene Röhren: TLR4-Hemmer, Anti-TLR2, und unbehandelt. Inkubationszellen mit 1 g/ml TLR4-Inhibitor für 60 min bei RT oder mit 50 g/ml Anti-TLR2 für 30 min bei RT.
  5. Fügen Sie 200 l Lysat, 10% FBS, 10% kommerzielles Mausplasma(Materialtabelle) oder eine Mischung der Proteinlösungen zu einer 48-Well-Platte (oder gleichwertig) hinzu und lassen Protein emittieren bei 37 °C für die gewünschte Zeit (d. h. 30 min, 60 min oder 24 h). Saugen Sie Proteinlösungen aus Brunnen, mit einer frischen Pasteur Pipette für jede Proteinlösung, und waschen Sie Oberflächen mit 250 l PBS für 5 min. Aspirate PBS. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wähbe.
    HINWEIS: Dieser Schritt muss möglicherweise früher im Protokoll gestartet werden, abhängig von der gewünschten Adsorptionszeit. Passen Sie das Protokoll entsprechend an.
  6. Nach der Inkubationszeit mit dem TLR4-Inhibitor oder Anti-TLR2, Pipettenzellen wieder aussetzen. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L Zelllösung hinzu.
  7. Fügen Sie für die TLR2-Positivkontrollbedingung Pam3CSK4 zu einer Endkonzentration von 150 ng/ml hinzu. Für TLR4-Positivkontrollzustand lipopolysaccharid (LPS) zu einer Endkonzentration von 1,5 g/ml hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 20 h.
  8. Probe 20 l Überstand aus jedem Brunnen und Platte in Duplikat in eine 96-Well-Platte. Schließen Sie drei Bohrungen von 20 L Assay-Medien als Hintergrundsteuerung ein. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L SEAP-Reporter-Assay-Reagenz hinzu. Die Platte mit einer Klebedichtung bedecken und 2,5 h bei 37 °C bebrüten.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Versuchsbedingungen variieren und sollte für einen starken Unterschied in der Absorption zwischen positiven und negativen Kontrollbrunnen optimiert werden.
    1. Übertragen Sie den Rest des Überstandes auf ein 1,5 ml Rohr (pro Brunnen). Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min, um Schmutz zu pellet. Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr übertragen und bei -80 °C lagern. Analysieren Sie Überstand auf das Vorhandensein von proinflammatorischen Zytokinen (z. B. TNF-, Interleukin 6) über enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA).
  9. Entfernen Sie die Klebeplattendichtung. Leseabsorption der Platte mit einem Plattenleser bei 635 nm. Anspirieren Flüssigkeit und Entsorgen Platte.

Ergebnisse

Die Reinigungsverfahren für die polymerbeschichteten Oberflächen wurden getestet, um sicherzustellen, dass es keine Unterbrechung der Beschichtung gibt, was als Änderung des Wasserkontaktwinkels zu einem unbeschichteten Glasdeckel angesehen werden würde (Abbildung 2). Einweichende PMMA-beschichtete Mikroskopschlitten in 70% Ethanol für 1 h wurden gefunden, um die PMMA-Beschichtung zu entfernen(Abbildung 2, linke s)), wahrscheinlich aufgrund der Löslichkeit...

Diskussion

Ein Schwerpunkt unseres Labors ist die Wirtsreaktion auf Feststoff-Weichteilimplantate und insbesondere, wie sich die zellulären Schäden, die während des Implantationsverfahrens entstehen, auf die Wirtsreaktion auswirken. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt vorläufige Experimente mit einer Reporter-Makrophagen-Zelllinie und in vitro-generiertem DAMP-haltigem Zelllysat, um den Einfluss von Molekülen zu untersuchen, die während zellulärer Schäden (d. h. aus der Implantatchirurgie) auf Makrophagenreaktionen auf ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die operative Finanzierung durch das Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), das Queen es University Senate Advisory Research Committee und die Infrastrukturunterstützung durch den Leadership Fund der Canadian Foundation for Innovation John Evan (Projekt 34137) und den Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Projekt 34137). L.A.M. wurde von einem Queen es University R. Samuel McLaughlin Fellowship, einem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Canadian Graduate Scholarship Master es Award und einem Ontario Graduate Scholarship unterstützt. Die Autoren danken Dr. Myron Szewczuk für sein großzügiges Geschenk der NF-B/AP-1 Reporter Makrophagenzelllinie und Drs. Michael Blennerhassett und Sandra Lourenssen für den Einsatz ihres Gel-Bildgebungssystems und Plattenlesers.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US originInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlMouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Fisher Scientific14190250No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research gradeWisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblastsATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsSynthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycinSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinInvivogenANT-MPPMycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cellsInvivogenraw-spNF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
TrypLE express enzyme (1X)Fisher Scientific12604021animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6BiolegendB213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-αBiolegendB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)Associates of Cape Cope Inc.E0005-5Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mLAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assayFisher ScientificPI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kitAssociates of Cape Cope Inc.C1500-5Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection mediumInvivogenrep-qb2Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrousSigma Aldrich288306-1L
Ethyl alcohol anhydrousCommercial AlcoholsP006EAANSigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forcepsFisher Scientific16-100-113
Fluorinert FC-40 solventSigma AldrichF9755-100MLFluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)Fisher ScientificSH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 elastomer kitFisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate sealsFisher ScientificAB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mLFisher Scientific14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene capsFisher Scientific03-337-4
Clear PS 48-well plateFisher Scientific08-772-52
Clear TCPS 96-well plateFisher Scientific08-772-2C
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Falcon tissue culture treated flasks, T25Fisher Scientific10-126-10
sticky-Slide 8 WellIbidi80828
Superfrost microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150Fisher Scientific08-772-48

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