Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Резюме

В этой статье описывается метод установки хрупких эмбрионов зебры для длительного замедленного конфокальной микроскопии. Этот недорогой метод легко выполнять с помощью обычной стеклянной нижней микроскопии блюда для визуализации на любой перевернутый микроскоп. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях.

Аннотация

Динамика развития может сопровождаться конфокальной замедленной микроскопией живых трансгенных эмбрионов зебры, выражающих флуоресценцию в конкретных тканях или клетках. Трудность с визуализацией всего эмбриона заключается в том, что эмбрионы зебры существенно растут в длину. При установке, как это регулярно делается в 0,3-1% низкорасплавленного агарозы, агароз налагает ограничение роста, что приводит к искажениям в мягком организме эмбриона. Тем не менее, для выполнения конфокальной замедленной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают подвижность эмбрионов, позволяя неограниченный рост. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб в течение 55 часов подряд. Этот метод монтажа может быть использован для легкой, недорогой визуализации целых эмбрионов зебры с помощью перевернутых микроскопов без требований плесени или специального оборудования.

Введение

Зебрафиш уже давно является образцовым организмом для биологии развития, а микроскопия является основным методом визуализации эмбрионального развития. Преимущества использования эмбрионов зебры для исследований в области развития включают небольшой размер, оптическую ясность, быстрое развитие и высокую плодовитость взрослых рыб. Поколение трансгенных линий зебры, выражающих флуоресценцию в определенных тканях или клетках, позволило напрямую визуализировать развитие тканей способами, которые невозможны с более крупными позвоночными животными. В сочетании с замедленной микроскопией можно легко изучить детали и динамику развития тканей.

Трудность с развитием изображения зебры заключается в том, что эмбрионы существенно растут в длину; эмбрион продлевает свою длину четыре раза в течение первых 3 дней жизни¹. Кроме того, тело раннего эмбриона мягкое, и легко становится искаженным, если рост ограничен. Тем не менее, для выполнения конфокальной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. Чтобы сохранить эмбрионы в фиксированном положении для конфокальной визуализации покадровой, они регулярно обезопасиваются и устанавливаются в 0,3-1% низкорасплавленной агарозы. Это имеет то преимущество, что позволяет для некоторого роста во время визуализации в течение определенного периода времени, ограничивая движения эмбриона. Части эмбриона можно эффективно отобразить вот так. Однако при использовании этого метода для визуализации всего эмбриона в течение длительных периодов времени наблюдаются искажения из-за ограниченного роста, вызванного агарозой. Таким образом, требуются другие методы монтажа. Кауфманн и его коллеги описали альтернативное монтаж эмбрионов зебры для микроскопии светового листа, таких как селективная микроскопия освещения самолета (SPIM), путем установки эмбрионов в флюиринированный этилен пропилен (FEP) трубки, содержащие низкие концентрации агарозы или метилцеллюлозы². Этот метод производит превосходную визуализацию эмбриогенеза с течением времени. Шмид и др. описывают монтаж до шести эмбрионов в агарозе в трубках FEB для светолистой микроскопии^3, обеспечивающей визуализацию нескольких эмбрионов за один сеанс визуализации. Формы были использованы для создания эмбрионов массивов для эффективного монтажа большего числа эмбрионов⁴. Masselkink и др. построили 3D печатных пластиковых форм, которые могут быть использованы для кремния слепки, что эмбрионы зебры на разных стадиях могут быть помещены в, что позволяет монтаж в постоянном положении для визуализации, в том числе confocal изображений⁵. 3D печать также была использована для изготовления форм для последовательного позиционирования эмбрионов зебры в 96-хорошем формате^6. Некоторые формы настроены для определенных этапов и не может позволить неограниченный рост в течение длительных периодов времени, в то время как другие формы являются более гибкими. Недавно, Weijts et al. опубликовалдизайн дизайн и изготовление блюда из четырех колодцев для живой визуализации эмбрионов зебры⁷. В этом блюде хвост и ствол обезеченных эмбрионов рыб помещаются вручную под прозрачую силиконовую крышу, прикрепленную чуть выше крышки стекла, чтобы сформировать карман. Эмбрион затем фиксируется в этом положении путем добавления 0,4% агарозы. Это крепление позволяет для изображения около 2 мм длинной задней части (ствол и хвост) эмбриона, и, как до 12 эмбрионов могут быть установлены на скважину, метод позволяет для изображения нескольких образцов. Аналогичным образом, Хирсингер и Стивентон недавно представили метод, где голова рыбы установлена в агарозе, в то время как хвост может свободно расти, и этот метод также эффективно облегчает визуализацию ствола и хвоста области эмбриона⁸.

В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают движения эмбрионов, обеспечивая при этом неограниченный рост. Преимущества этого монтажного метода в том, что это недорогой, быстрый и простой метод установки эмбрионов различных стадий для визуализации с помощью любого перевернутого микроскопа. Монтаж позволяет проводить долгосрочную визуализацию всего тела (головы, туловища и хвоста) во время развития эмбриона. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб. Два эмбриона за сеанс, на двух длинах волн в 3D были изображены замедленной микроскопией в течение 55 часов подряд, чтобы сделать фильмы развития тканей.

протокол

Представленная здесь работа по уходу за животными была одобрена институциональными комитетами по уходу за животными и использованию (IACUCs) Университета Хьюстона и Университета Индианы.

1. Рыбное животноводство

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с моделями позвоночных требует протокола, одобренного IACUC. Она должна проводиться в соответствии с соответствующими национальными и международными руководящими принципами.

1. Поддержание взрослых зебры, как описано в ранее опубликованной литературе⁹.
2. Во второй половине дня, место взрослых зебры в разведении танков. Порода мужчин к самкам в соотношении 1:2.

2. Подготовка решений

1. Сделать запас решение 1% низким расплава агарозы в эмбрионе сми (E3: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мм CaCl₂, 0,33 мМ MgSO₄, скорректированы на рН 7,0). Aliquot стокового раствора в 1,5 мл труб и хранить их при 4 градусах Цельсия.
2. Сделать запас решение 4% (w/v) tricaine (MS-222) в дистиллированной воде. Храните при 4 градусах по Цельсию в темной бутылке.
   ВНИМАНИЕ: Трикаин токсичен и должен быть взвешен и растворен в дымящей капюшон.
3. Сделать запас раствор 20 мм N-фенилтиуреа (PTU) в дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию.

3. Подготовка эмбрионов

1. После спаривания, урожай эмбрионов в E3 в чашке Петри и инкубировать их на 26,5 градусов по Цельсию в течение 28 ч до монтажа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это замедляет развитие эмбрионов, так что эмбрионы примерно на 30 стадии сомита в начале визуализации.
2. Анестезия эмбрионов в 0,016-0,020% трикаин в E3. Чтобы ингибировать пигментацию, добавьте ПТУ к концентрации 200 мкм.
3. Дехорионат эмбрионы с помощью щипков под рассекающим микроскопом. Используя две щипца, сцепление и осторожно тянуть хорион друг от друга, чтобы освободить эмбриона.

4. Монтаж в агарозе

ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанный метод монтажа требует двух различных концентраций низкорасплавленной агарозы в E3 с 0,02% трикаин и ПТУ по мере необходимости. Первый агарозный раствор содержит оптимальную концентрацию агарозы, при которой искажения и подвижность находятся на минимальном уровне. Оптимизация описана в шаге 5 ниже.

1. Нагрейте растворы агарозы для двух слоев (концентрация определена в шаге 5 ниже и 1%) до 65 градусов по Цельсию. Дайте агарозе остыть примерно до 30 градусов по Цельсию непосредственно перед монтажом, чтобы эмбрион не пострадал от жары. Для монтажа используйте 35-мм стеклянную посуду со стеклянным дном No 0. Крышка стекла прилагается к нижней части блюда создает 10 мм мелкой (около 1,2 мм глубиной) хорошо, в котором эмбрион должен быть помещен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае концентрация с наименьшей подвижностью и искажениями составила от 0,025 до 0,040% агарозы.
2. Аккуратно поместите дехорионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда с помощью стеклянной пипетки или микропипетты. При использовании микропайпета, вырезать внешнюю часть кончика, чтобы увеличить размер отверстия, чтобы соответствовать эмбриона(Рисунок 1A). Аккуратно удалите оставшиеся E3 с помощью микропипетта.
3. Добавьте первый раствор агарозы в небольшой колодец, созданный крышкой стекла, прикрепленного к нижней части блюда, чтобы покрыть эмбрион (Слой 1) (Рисунок 1B). Убедитесь, что агароза покрывает небольшой колодец, но не будет переполнять его.
4. Обложка небольшой колодец с крышкой стекла (22 мм х 22 мм) (Рисунок 1С), чтобы создать узкий агароуз заполнены пространство с эмбрионом между двумя очками крышки.
5. Поместите слой 1% раствора агарозы поверх крышки стекла по всей нижней части блюда (слой 2) (Рисунок 1D). По мере того как этот слой затвердевает, он держит стекло крышки в месте.
6. Заполните оставшуюся часть блюда с E3, содержащий 0,02% трикаин держать систему гидратированных (слой 3) (Рисунок 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой установке, крышка стекла и 1% агарозы защитить нижний слой от получения разбавленной.

5. Оптимизация раствора агарозы для слоя 1

1. Чтобы определить оптимальную концентрацию агарозы для слоя 1, используйте многомасштабный подход к поиску сетки. Монт эмбрионов в увеличении концентрации агарозы в диапазоне от 0,01% до 1% с последующим замедленной визуализации ограничения роста эмбриона и подвижности в поле зрения. Определите концентрации, в которых как искажение, так и подвижность находятся на минимальном уровне.
2. Для оптимизации концентрации агарозы дальше, монтировать эмбрионы с использованием более тонкого диапазона концентраций агарозы (например, между 0,025 и 0,040% агарозы) в зависимости от концентрации оказались лучшими в шаге 5.1 (например, 0.025%, 0.028%, 0.031%, и т.д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории оптимальная концентрация агарозы составляла около 0,03%.

6. Визуализация замедленного времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот монтажный метод работает для любого перевернутого микроскопа с функцией замедленного действия для флуоресценции и яркой визуализации поля.

1. Выполняйте замедленное изображение для всего эмбриона или его частей на срок до 55 ч. Для визуализации нескольких эмбрионов используйте адаптер сцены, который содержит несколько блюд с одним эмбрионом, установленным на блюдо. Поверните блюда один за 1, так что эмбрионы примерно горизонтально расположены, как определяется глазом. Для оптимального роста и развития эмбриона используйте сцену микроскопа с инкубатором, установленным при 28,5 градусах Цельсия.
2. Выберите цель с низким увеличением в программном обеспечении микроскопа. Под глазом, найти и мелко выровнять эмбрионы горизонтально, вращая блюда с помощью яркого освещения поля и записывать их местоположение в программном обеспечении. Создайте имя файла для автоматической экономии данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для записи местонахождения эмбрионов использовались цель плана apo 4x 0.2 NA и вкладка XY в окне приобретения ND. Данные были сохранены в формате .nd2. Цель была выбрана, нажав на его значки во вкладке Ti Pad.
3. Установите размер пинхола, скорость сканирования, размер изображения и масштабирование. Затем выберите более высокую цель увеличения для захвата изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для визуализации целых эмбрионов использовалась цель плана-апо 10х 0,45 NA, а для получения изображений высших частей эмбриона использовался суперфлюор 20x 0,75 NA. Пинхол был установлен на 1,2 а.е. (19,2 мкм для объектива 10x), скорость сканирования была установлена для пиксельного времени проложек 2,4 м,а размер изображения был установлен до 1024 х 1024 пикселей с сканированием зум одного, давая пиксель размер 1,24 мкм для 10x и объектива 0,62 мкм для объектива 20x.
4. Выберите каналы для изображения флуоресценции. Отрегулируйте настройки захвата изображения по одному каналу. Для каждого канала флуоресценции настроить лазерную мощность и детектор высокого напряжения, убедившись, что для сбора наилучшего динамического диапазона возможно, избегая насыщения и ограничения фотоотбеления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, GFP был изображен с 488 зеленый канал, (488 нм лазера и выбросов между 500 и 550 нм), и RFP с 561 красный канал (561 нм лазера ивыбросов между 570 и 600 нм), и передача изображения была собрана с помощью 561 нм лазера и передаваемого детектора света (T канал).
5. Чтобы изобразить весь эмбрион с целью 10x, изображение нескольких полей зрения с перекрытием и сшить их вместе с помощью программного обеспечения микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как эмбрионы будут расти существенно в размерах во время изображения, убедитесь, что есть пространство в поле зрения передней и задней к эмбриону. Используйте вкладку Scan Large Image окна приобретения ND и выберите шаблон 4 x 1 с перекрытием 10% для захвата четырех смежных полей зрения.
6. Настроили настройки для захвата стеков с помощью программного обеспечения микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эмбрион установлен близко к нижней части стеклянной тарелки, его центр будет отходить от дна, как он растет. Используйте вкладку в окне приобретения ND и выберите асимметричный относительный диапазон. С помощью этого метода текущая плоскость фокусировки используется в качестве референтной плоскости, а остальные плоскости асимметрично распределены выше и ниже, чтобы включить весь эмбрион в объеме стека, с достаточным пространством для учета роста образца. Во всех экспериментах интервал был установлен до 11 мкм, а общая дальность - около 45 плоскостей.
7. Для того, чтобы сохранить фокус нескольких эмбрионов во время долгосрочной визуализации промежуток времени, используйте автоматизированный фокус. При визуализации нескольких эмбрионов, отрегулируйте индивидуальные уровни смещения для каждого эмбриона, чтобы сосредоточиться на справочной плоскости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте была использована лазерная система стабилизации фокусировки.
8. Настройка параметров замедленного действия в программном обеспечении и изображении микроскопа в течение 55 ч с интервалом около 1 ч. На каждом цикле захватываетдва два набора данных эмбрионов последовательно и автоматически сохраняете данные после каждого цикла.
9. Обработка изображений с помощью он-лайн или офф-лайн версии программного обеспечения микроскопа. Если было изображено более одного эмбриона, создайте независимые файлы для каждого эмбриона путем разделения набора данных на основе расположения изображений. Используйте проекции максимальной интенсивности или аналогичный инструмент для преобразования наборов данных 3D-времени в наборы данных 2D-времени. Создавайте файлы фильмов, используя опцию «Сохранить» в качестве меню, выбрав .avi в качестве формата файла. Выберите опцию «Нет сжатия» с интервалами 200 мс для скорости воспроизведения 5 кадров/с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный набор данных двух эмбрионов в этом эксперименте был разделен с помощью функции сплит амплоположения в программном обеспечении(Файл Импорт/Экспорт Сплит Multipoints). 3D-наборы данных времени были преобразованы в наборы данных 2D-времени с использованием функции проекции максимальной интенсивности (изображение Nd Обработка Создайте максимальное изображение проекции интенсивности в no).

Результаты

Разработка метода монтажа
Основной целью этой работы было разработка недорогой техники монтажа для замедленного получения изображений зебры в течение длительных периодов времени. Метод многослойного монтажа был разработан для обеспечения полного роста хрупкого тела эмбр...

Обсуждение

Здесь описан монтажный метод для длительного замедленного конфокальной микроскопии целых эмбрионов зебры. Наиболее важным шагом для монтажного метода является определение оптимальной концентрации агарозы, которая позволит неограниченному росту эмбрионов зебры, и в то же время держ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software