Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Résumé

Ici, nous présentons un outil qui peut être employé pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires en utilisant un système inductible d’expression couplé à une technique d’électroporation de pipette.

Résumé

L’étude de la réglementation posttranscriptionnelle est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARN messager donné (ARNM) et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. En effet, les fluctuations de l’expression de transcription pourraient modifier l’efficacité de la traduction et, en fin de compte, l’activité cellulaire d’une transcription. Plusieurs approches expérimentales ont été développées pour étudier la demi-vie de l’ARNm bien que certaines de ces méthodes aient des limites qui empêchent l’étude appropriée de la modulation posttranscriptionale. Un système d’induction promoteur peut exprimer un gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline.regulated. Cette méthode permet l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale sans troubler l’homéostasie cellulaire. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité de transfecter les cellules, ce qui limite l’utilisation de cette technique dans les cellules primaires isolées qui sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Les caractéristiques uniques et le phénotype des cellules alvéolaires primaires font qu’il est essentiel d’étudier les modulations posttranscriptionnelles des gènes d’intérêt dans ces cellules. Par conséquent, notre objectif était de développer un nouvel outil pour étudier les modulations posttranscriptionnelles des ARNm d’intérêt pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire. Nous avons conçu un protocole transitoire rapide et efficace de transfection pour insérer un système d’expression plasmide contrôlé par transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires. Cette stratégie de clonage, utilisant une épitope virale pour marquer la construction, permet la discrimination facile de l’expression de construction de celle des ARNm endogènes. À l’aide d’une méthode modifiée du cycle de quantification (Cq), l’expression de la transcription peut ensuite être quantifiée à différents intervalles de temps pour mesurer sa demi-vie. Nos données démontrent l’efficacité de cette nouvelle approche en étudiant la régulation posttranscriptionnelle dans diverses conditions pathophysiologiques dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.

Introduction

Plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. La technique de désintégration de la chasse au pouls, qui utilise des ARNm étiquetés, permet l’évaluation simultanée d’un grand bassin d’ARNm avec une perturbation cellulaire minimale. Cependant, cette approche ne permet pas une estimation directe de la demi-vie d’une transcription génétique unique et ne peut pas être mise en œuvre pour étudier la modulation posttranscriptionnelle d’un ARNm suivant la stimulation avec des facteurs de croissance, ROS, alarmines, ou inflammation¹.

L’utilisation d’inhibiteurs de transcription, tels que l’actinomycine D et l’amanitine, est une méthode relativement simple pour mesurer la cinétique de dégradation de l’ARNm au fil du temps. L’un des principaux avantages de cette approche par rapport à celui des techniques précédentes (c.-à-d. la chasse au pouls) repose sur la capacité d’estimer directement la demi-vie d’une transcription donnée et de comparer comment différents traitements pourraient affecter sa cinétique de dégradation. Cependant, l’impact délétère significatif des inhibiteurs de transcription sur la physiologie cellulaire représente un inconvénient majeur de l’approche². En effet, l’inhibition de l’ensemble du transcriptome cellulaire avec ces médicaments a l’effet secondaire négatif de perturbing la synthèse des éléments clés impliqués dans la stabilité de l’ARNm, tels que les microARN (miRNAs), ainsi que l’expression et la synthèse des protéines liant l’ARN, qui sont importants pour la dégradation et la stabilité de l’ARNm. La perturbation sévère de la transcription de gène par ces drogues pourrait donc modifier artefactually les courbes de dégradation des transcriptions.

Le système d’induction du promoteur représente une troisième approche pour mesurer la demi-vie d’un ARNm spécifique. Cette méthode mesure la dégradation d’un ARNm spécifique de la même manière que les méthodes qui utilisent des inhibiteurs de transcription. Deux types de systèmes d’induction sont fréquemment utilisés : le promoteur c-fos induit par le sérum³ et le système inductible Tet-Off⁴. Avec le système c-fos, l’utilisation d’inhibiteurs de transcription qui peuvent être toxiques pour la cellule n’est pas nécessaire. Cependant, cette méthode nécessite la synchronisation du cycle cellulaire, ce qui empêche l’évaluation de la stabilité réelle d’une transcription pendant l’interphase⁵. En revanche, le système Tet-Off permet l’expression forte du gène d’intérêt (GOI) sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline réglementé. Ce système nécessite la présence de deux éléments qui doivent être cotransfectés dans la cellule pour être fonctionnel. Le premier plasmide (pTet-Off) exprime la protéine réglementaire tTA-Adv, un facteur hybride de transcription synthétique composé du répresseur procaryotique TetR (d’Escherichia coli) fusionné à trois domaines de transactivation de transcription de la protéine virale HSV VP16. Le GOI est cloné dans le plasmide pTRE-Tight sous le contrôle d’un promoteur synthétique (P_Tight), comprenant la séquence minimale du promoteur de cytomégalovirus (CMV) fusionné à sept répétitions de la séquence de l’opérateur tetO. La transcription du gène en aval de P_Tight dépend de l’interaction de TetR avec le tetO. En présence de tétracycline ou de son dérivé, doxycycline, le répresseur TetR perd son affinité pour l’opérateur tetO, conduisant à une cessation de la transcription⁴. Les caractéristiques du système Tet-Off en font un modèle idéal pour l’étude de l’expression spécifique de l’ARNm dans les cellules eucaryotes tout en évitant les effets pléiotropic potentiels qui sont secondaires à l’absence de séquences réglementaires procaryotes dans la cellule eucaryote⁶. Habituellement, les lignes cellulaires Tet-Off doublement stables (HEK 293, HeLa et PC12) sont utilisées avec ce système pour intégrer des copies des plasmides de régulateur et de réponse pour un accès pratique à l’expression génique contrôlable^7,8,9.

Plusieurs modèles de cellules épithéliales alvéolaires en culture ont été utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Pendant des années, les chercheurs ont largement utilisé les cellules primaires humaines ou rongrices^10,11 ainsi que des lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules humaines A549 ou rat RLE-6TN^12,13. Bien qu’elles soient généralement moins prolifératives et plus difficiles à culture et à transfecter, les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire demeurent l’étalon-or pour l’étude de la fonction et du dysfonctionnement de l’épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques et pathologiques. En effet, les lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules A549 ne présentent pas les caractéristiques complexes et les phénotypes des cellules primaires, tandis que les cellules épithéliales alvéolaires de la culture primaire récapitulent les principales propriétés de l’épithélium alvéolaire, en particulier la capacité de former une barrière polarisée et serrée^14,15. Malheureusement, ces cellules sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles, telles que celles utilisant des liposomes, ce qui rend très difficile l’utilisation d’un système induit par un promoteur comme le Tet-Off.

La modulation posttranscriptionnelle des ARNm est l’une des méthodes les plus efficaces pour moduler rapidement l’expression génique d’une transcription¹⁶. La région non traduite de l’ARNM 3 (3' UTR) joue un rôle important dans ce mécanisme. Il a été démontré que, contrairement à l’UTR de 5', il existe une corrélation exponentielle entre la longueur de l’UTR de 3' et les complexités cellulaires et morphologiques d’un organisme. Cette corrélation suggère que l’UTR 3', comme les régions de codage de l’ARNm, a été soumis à la sélection naturelle pour permettre une modulation posttranscriptionnelle de plus en plus complexe tout au long de l’évolution¹⁷. L’UTR 3' contient plusieurs sites de liaison pour les protéines et les miARN qui affectent la stabilité et la traduction de la transcription.

Dans le présent travail, nous avons développé un outil pour étudier le rôle des domaines hautement conservés dans les 3' UTR d’un GOI pour le contrôle de la stabilité des transcriptions. Nous nous sommes concentrés sur le canal épithélial de sodium, sous-unité alpha (ENaC), qui joue un rôle clé dans la physiologie épithéliale alvéolaire¹⁸. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été avec succès transitoirement transagères avec les deux composants du système Tet-Off, qui permet l’étude du rôle de l’UTR 3' dans la stabilité de l’ARNm avec un système qui affecte de façon minimale la physiologie cellulaire et le métabolisme par rapport à l’utilisation des inhibiteurs de transcription avec d’autres protocoles. Une stratégie de clonage a été développée pour différencier l’expression du GOI de celle du gène endogène à l’aide d’une épitope non endogènement exprimée (V5). La réponse et les plasmides régulateurs ont ensuite été transférés dans les cellules épithéliales alvéolaires utilisant une technique d’électroporation de pipette. Par la suite, l’expression de la transcription a été mesurée en incuber les cellules avec la doxycycline à différents intervalles de temps. La demi-vie de la transcription a été évaluée par RT-qPCR avec une méthode modifiée de Cq utilisant le produit transfected de tTA-Ad mRNA pour la normalisation. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique d’étudier plus en détail la modulation posttranscriptionnelle d’une transcription dans différentes conditions et de définir plus en détail l’implication des régions non traduites.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux du Centre de recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM).

1. Conception et génération du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI)

1. Utilisez un vecteur inductible de tétracycline, comme pTRE-Tight.
2. Analyser la séquence du GOI et le site de clonage multiple (MCS) du vecteur afin d’identifier les sites de restriction dans le MCS qui ne sont pas présents en interne dans le GOI.
3. Isoler les cellules épithéliales alvéolaires primaires des poumons mâles de rat Sprague-Dawley comme décrit précédemment^19,20.
4. Purifier l’ARN total des cellules épithéliales alvéolaires par extraction d’ARN à l’aide d’une méthode standard, comme l’extraction du phénol/chloroforme ou l’utilisation de colonnes de spin à base de silice.
5. Rétro-transcrire l’ARNm en ADN complémentaire (CDNA) à l’aide d’oligo(dT) et de transcriptase inversée haute fidélité.
6. Utilisez la polymérase Taq haute fidélité et les techniques PCR de chevauchement standard pour accompagner le GOI avec deux sites sélectionnés de reconnaissance d’enzymes de restriction à l’aide d’amorces conçues.
   1. Demandez à l’apprêt avant de contenir un site de liaison ribosome de consensus Kozak²¹ pour améliorer les niveaux d’expression pour étudier l’expression des protéines en parallèle avec la stabilité de l’ARNm. Une séquence codant l’épitope V5 en amont du GOI doit être incluse pour distinguer l’expression du GOI transfected de l’expression endogène(tableau 1).
   2. Demandez à l’amorce inverse de contenir un signal de polyadenylation après le codon d’arrêt.
7. Les mutants peuvent être générés par la suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes régions UTR de 3' sur la stabilité de l’ARN de l’IERn à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement la fin 3' de l’UTR GOI 3 (figure 6). Alternativement, la mutanèse dirigée par PCR peut être utilisée pour cibler une région d’intérêt spécifique dans l’UTR²²de 3' .
8. Digest le vecteur inductible et l’insert avec les enzymes de restriction précédemment choisies à la température d’incubation appropriée pendant 1 h, suivie d’un traitement avec phosphatase pendant la réaction vectorielle pendant 30 min pour éviter l’auto-ligation.
9. Séparez le vecteur digéré et insérez des segments par électrophoresis dans un gel agarose de 1 à 1,5 % (concentration selon la taille de l’insert).
10. À l’aide d’une lame et d’une lumière UV, recueillir les fragments d’ADN contenant l’insert et le vecteur désiré pour être ligated.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
11. Purifier les segments collectés à partir du gel agarose à l’aide d’un kit de purification PCR à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm.
12. Ligate le GOI et le vecteur inductible avec la ligase d’ADN T4 utilisant un rapport vectoriel : insérer le rapport molaire de 1:3 pour augmenter la probabilité de ligature. Incuber la réaction à température ambiante (RT) pendant 3 h.
13. Transformez la réaction de ligature en E. coli compétent (DH5).
    1. Ajouter 1-10 ng de vecteur et de gène à un tube contenant 100 ll de cellules compétentes. Incuber les cellules sur la glace pendant 30 min, puis les cellules à choc thermique à 42 oC pour 45 s. Placer le tube sur la glace pendant 2 min et ajouter 900 l 'L de RT LB moyen. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 oC avec secousses à 225 tr/min.
    2. Étendre 100 l de la réaction sur une plaque d’agar LB avec un antibiotique approprié (par exemple, 100 g/mL ampicilline pour le vecteur pTRE-Tight) pour sélectionner les bactéries transformées. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 oC.
    3. Sélectionnez les colonies individuelles à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’une pointe de 20 L et incuber toute la nuit dans un milieu de 5 ml de LB contenant l’antibiotique approprié à 37 oC avec secousses. Les bactéries transformées peuvent être stockées dans des stocks de glycérol à -80 oC à un rapport de 400:600 de LB moyen à glycérol.
14. Extraire l’ADN plasmide à l’aide de colonnes plasmides à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm. Confirmer l’insertion du GOI par l’analyse de restriction et son orientation et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant RT-PCR par séquençage.

2. Transfection du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI) dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

1. Isoler les cellules épithéliales alvéolaires de type II des poumons de rat.
2. Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 10⁶ cellules/cm² en 100 mm Petri plats avec le milieu essentiel minimum complet (MEM complet). Le MEM complet est MEM complété par 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim et 17 g/mL sulfamethoxazole), 0,2% NaHCO₃, 0,01 M HEPES (pH - 7,3), et 2 m glutM-Lamine. Culture des cellules pendant 24 h à 37 oC en 5% de CO₂ dans un incubateur humidifié.
3. Le lendemain, placez 500 l de MEM complet sans antibiotique dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et avant la mise à l’avant-garde de la plaque à 37 oC pendant 30 min. Pendant cette étape, il est important d’utiliser du sérum bovin fœtal exempt de contamination des tétracyclines ou d’un niveau trop bas pour interférer avec l’inductibilité.
4. Préparer des tubes de 1,5 mL contenant le plasmide avec le GOI inductible (GOI plasmide) et le vecteur réglementaire (p.pTet-Off) en ajoutant 1 g de plasmide GOI et 1 g de vecteur réglementaire par puits à RT. Pour les expériences de coexpression avec des protéines liant l’ARN (RBP), 1 g d’un vecteur constitutif (p. ex., pcDNA3) exprimant le RPB d’intérêt est ajouté au mélange d’ADN(figure 7).
5. Aspirer le milieu et rincer doucement les cellules avec PBS (sans calcium et magnésium) pré-émaillée à 37 oC.
6. Ajouter 5 ml de trypsine de 0,05 % préenchassa à 37 oC et incuber les cellules jusqu’à ce que les cellules soient détachées (2-4 min). Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de MEM complet sans antibiotique.
7. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, laver le plat Petri avec 4 ml de milieu pour recueillir autant de cellules restantes que possible, puis centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
8. Aspirez et jetez doucement le supernatant et réutilisez la pastille dans 1 ml de PBS. Comptez et calculez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
9. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer doucement le supernatant et réanimer la granule dans un tampon de résuspension à une concentration de 4 x 10⁷ cellules/mL. Ajouter les cellules du tube de 1,5 mL préparé à l’étape 2.4 à une concentration de 400 000 cellules par puits et les mélanger doucement en les canalisation de haut en bas.
10. Placer le tube dans le dispositif d’électroporation et le remplir de 3,5 ml de tampon électrolytique.
11. Insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette en appuyant complètement sur le piston. Mélanger délicatement le contenu du tube de 1,5 mL et aspirer soigneusement les cellules avec la pipette. Veillez à empêcher les bulles d’air d’entrer dans la pointe, car cela provoquera l’arc électrique pendant l’électroporation et entraînera une diminution de l’efficacité de la transfection.
12. Insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’il y ait un bruit de clic.
13. Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires, correspondant à une tension d’impulsion de 1 450 V et 2 impulsions d’une largeur de 20 ms, et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.
14. Immédiatement après la transfection, retirez la pipette et transférez les cellules à un puits préalablement rempli de MEM complet sans antibiotique qui a été préenchillé à 37 oC.
15. Répéter les étapes 2.11-2.14 pour les échantillons restants.
16. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules sur la surface du puits. Incuber les cellules à 37 oC en 5% de CO₂ dans un incubateur humidifié. Après 2 jours, remplacer le milieu par meM complet avec des antibiotiques.
17. Confirmer le succès de la transfection en observant l’expression de l’EGFP sous un microscope à fluorescence ou par cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle(figure 1).
    REMARQUE : Cette étape est facultative et nécessite une étape transfection supplémentaire à l’aide d’un plasmide différent exprimant eGFP, comme pcDNA3-EGFP.

3. Induction de l’inhibition de la transcription du GOI

REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées à l’avance avec les traitements souhaités avant l’induction de doxycycline afin d’évaluer leur impact sur la stabilité de l’ARNm(figure 5).

1. Préparer une solution de stock de doxycycline de 1 mg/mL dans de l’eau déionisée. Conservez la solution de stock à -20 oC protégée de la lumière. La doxycycline, un dérivé de la tétracycline, est utilisée au lieu de la tétracycline parce qu’elle a une demi-vie plus longue (2x) que la tétracycline. En outre, une concentration plus faible de doxycycline est nécessaire pour l’inactivation complète de l’opéon du tet ²³.
   REMARQUE : La doxycycline pourrait affecter l’expression d’ARNm du GOI endogène. Pour vérifier cela, l’effet d’un traitement de 24 h avec de la doxycycline sur les cellules alvéolaires devrait être testé pour confirmer l’absence de tout changement dans l’expression du goI(figure 2).
2. Préparer une solution de doxycycline fraîche de 1 g/mL en posttransfection COMPLÈTE MEM 72 h et la réchauffer à 37 oC.
3. Remplacer le milieu par 1 ml de MEM complet contenant 1 g/mL doxycycline par puits pour inhiber la transcription du GOI.
4. Incuber plusieurs puits à 37 oC en CO₂ à 5% pour différentes quantités de temps de 15 min-6 h pour évaluer la demi-vie de l’ARNm.
5. À la fin du traitement, laver les cellules avec PBS glacé et les lyse avec un kit d’extraction d’ARN phénol-chloroforme disponible dans le commerce en ajoutant 500 lil de tampon par puits et en secouant la plaque pour homogénéiser les cellules.
6. Isolez l’ARN selon le protocole du fabricant. Déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nm. Les échantillons d’ARN avec des ratios d’ARN de 260:230 et 260:280 de 1,8 et 2,0, respectivement, sont considérés comme purs.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Déterminer la stabilité de l’ARNm du GOI

1. Traiter 1 g d’ARN total avec DNAse I (qualité d’amplification) sans ARN pour enlever toute trace d’ADN plasmide qui pourrait interférer avec l’amplification ultérieure de l’ADN.
   1. Dans un tube PCR de 0,2 mL, combinez 1 g d’ARN total, 1 ll de tampon de réaction DNase I de 10x, 1 L de DNAse I (1 U/L) et eau sans ARN pour obtenir un volume total de 10 L.
   2. Incuber la réaction à RT pendant 20 min.
   3. Désactiver DNAse I en ajoutant 1 lL de 25 mM EDTA au mélange de réaction de 10 L et en incuber la réaction à 70 oC pendant 10 min.
2. Inverser-transcribe l’ARN total appauvri par l’ADN dans l’ADN cDNA à l’aide d’un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorces d’olig(dT) et d’héxamer aléatoire pour améliorer l’efficacité de la transcription inverse.
   1. En bref, ajoutez 4 L de mélange de réaction 5x, 1 l de transcriptase inverse et 4 L d’eau sans ARN à 11 lil du mélange total d’ARN appauvri par l’ADN pour obtenir un volume de réaction total de 20 L. Mélanger la réaction bien en la canalisation de haut en bas.
   2. Incuber la réaction pendant 5 min à 25 oC, suivie de 20 min à 46 oC, puis inactiver la réaction en l’incubant à 95 oC pendant 1 min. Chaque réaction produira 50 ng/L de produit d’ADN.
   3. Diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de 5 ng/L en ajoutant 180 l 'L d’eau de biologie moléculaire-grade au mélange de réaction de 20 L. Entreposez les produits cDNA à -80 oC ou procédez immédiatement à l’exécution du PCR quantitatif en temps réel (QPCR).
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Concevez des amorces qPCR avant et inversées spécifiques au GOI.
   1. En raison de l’expression endogène du GOI dans les cellules, les amorces doivent être conçues pour amplifier un amplicon de 100-150 bp de l’épitope V5 couplé au GOI (tableau 1).
   2. Les amorceurs de gènes de référence interne doivent également être utilisées comme témoins de normalisation. Habituellement, les gènes d’entretien ménager, tels que les gènes bêta-actin et hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, sont utilisés comme gènes de référence. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas être utilisés avec ce système d’induction en raison de la variation de l’efficacité transfection. Au lieu de cela, l’expression de la transcription tTA-Ad est évaluée aux fins de la normalisation, parce que son expression est constitutive dans les cellules en raison de l’activité du promoteur de cytomégalovirus. Toute variation de son expression mesurée par qPCR sera représentative de l’efficacité transfection (amorce : avant 5'-GCC TGA CGA CAGA GGA AAC TC-3' et inverser 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) et permettra la normalisation de l’expression des clones transfectés(figure 3).
4. Préparer chaque réaction qPCR en triplicate à l’aide d’un mélange de maître de teinture SYBR Green.
   1. Diluer le mélange d’ADNC de 5 ng/L à une concentration de 1,25 ng/L à l’aide d’eau de qualité biologique moléculaire.
   2. Combinez 5 L de SYBR Green dye master mix (2x), 0.1 'L d’eau de biologie moléculaire de qualité, 0,45 L d’apprêt avant de 7,5 M, 0,45 ll de l’amorce inversée de 7,5 M et 4 L de 1,25 ng/L cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 L. Mix bien par pipe de haut en bas dans une plaque de 96 puits PCR. Utilisez un film adhésif optique pour vous assurer que le couvercle de la plaque est scellé et pour prévenir la contamination et l’évaporation.
   3. Tournez brièvement le mélange de réaction par centrifugation et placez la plaque dans un thermocycler qPCR.
5. Amplifier les amplicons GOI et tTA-Ad étiquetés V5 en utilisant les conditions qPCR suivantes : 95 oC pendant 10 min comme étape de dénaturation, suivie de 40 cycles de 95 oC pour 10 s, 58 oC pour 15 s et 72 oC pour 20 s. Une courbe de fonte haute résolution doit être générée après l’exécution des cycles d’amplification afin d’évaluer les températures de fonte spécifiques des amplicons désirés et d’assurer l’absence de pics d’amplicone sonore.
   1. Inclure des contrôles négatifs pour le QRT-PCR en effectuant qPCR avec l’ARN comme un modèle sans transcriptase inverse pour servir de contrôle pour la contamination potentielle de l’ADN plasmide et qPCR sans cDNA ajouté au mélange qPCR pour assurer le manque de dimers apprêt ou Contaminants.
   2. La concentration optimale d’ADNC, l’efficacité et la concentration d’apprêt doivent être optimisées selon le GOI par un essai standard de courbe. Pour ce faire, effectuer une dilution en série à l’aide de l’ADP à partir de cellules non traitées (cultivée sans doxycycline). La courbe standard est générée par tracer les valeurs Cq par rapport au journal du facteur de dilution de l’ADN, et l’efficacité d’amplification (E) est calculée en fonction de la pente de la courbe standard à l’aide de la formule suivante :
      E 10^-1/pente
      REMARQUE : L’efficacité de l’amplification devrait être d’environ 0,9 à 1,05. Sinon, les amorces doivent être redessinées.
6. Analyser les données qPCR à l’aide de la méthode comparative Cq en normalisant les valeurs d’expression du GOI à l’expression de tTA-Ad pour obtenir les niveaux d’expression relatifs de l’IER et pour signaler son expression en pourcentage de l’expression de l’ARN dans les cellules du même animal au point de départ (t - 0) (figure 4).
7. La demi-vie est déterminée à partir de la constante de taux (K) de la courbe de dégradation de l’ARNm GOI en utilisant l’équation suivante :
   t_1/2 ln 2/K.

Résultats

Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer un système d’expression plasmide transcriptionnellement contrôlé Tet-Off pour évaluer l’importance de différentes parties de l’UTR de l’ENaC 3 dans la modulation de la stabilité de transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.

La première étape de la mise en œuvre de ce système a été d’établir une technique de transfection r...

Discussion

Le faible taux de transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire a été une limitation sérieuse pour l’utilisation du système Tet-Off pour évaluer la stabilité de l’ARNm dans ces cellules. Cependant, cette limitation a été surmontée par l’électroporation de pipette, permettant une efficacité de transfection de 25-30%(figure 1 et figure 3)²⁶.

La mesure de la stabil...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	-
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL