Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée

Résumé

Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.

Résumé

La contamination des enzymes avec des métaux lessiminés à partir de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) colonnes pose une préoccupation majeure pour les enzymologues, comme beaucoup de cations communes di-et trivalents utilisés dans les résines IMAC ont un effet inhibiteur sur les enzymes. Cependant, l'étendue du lessivage des métaux et l'impact de divers réactifs d'éluetation et de réduction sont mal compris en grande partie en raison de l'absence de protocoles simples et pratiques de quantification des métaux de transition qui utilisent l'équipement habituellement disponible dans laboratoires de biochimie. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un protocole pour quantifier rapidement la quantité de contamination des métaux dans les échantillons préparés à l'aide de l'IMAC comme étape de purification. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol (HNB) comme indicateur colorimétrique de la teneur en cation métallique dans une solution d'échantillon et la spectroscopie UV-Vis comme moyen de quantifier la quantité de métal présent, dans la gamme nanomolaire, basée sur le changement du spectre HNB à 647 nm. Bien que la teneur en métaux d'une solution ait toujours été déterminée à l'aide de la spectroscopie d'absorption atomique ou de techniques plasmatiques couplées inductivement, ces méthodes nécessitent un équipement spécialisé et une formation en dehors du champ d'application d'un laboratoire de biochimie typique. La méthode proposée ici fournit un moyen simple et rapide pour les biochimistes de déterminer la teneur en métaux des échantillons en utilisant l'équipement et les connaissances existants sans sacrifier la précision.

Introduction

Depuis sa création par Porath et ses collègues¹, la chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) est devenue une méthode de choix pour séparer rapidement les protéines en fonction de leur capacité à se lier avec des ions métalliques de transition tels que Zn^{2 ,}Ni^{2 ,}Cu², et Co². Ceci est le plus souvent fait par l'intermédiaire des étiquettes de poly-histidine machinées et est maintenant l'une des techniques de purification chromatographique les plus communes pour l'isolement des protéines recombinantes^2. IMAC a également trouvé des applications au-delà de la purification des protéines recombinantes comme un moyen d'isoler les quinolones, tétracyclines, aminoglycosides, macrolides, et les lactams pour l'analyse des échantillons alimentaires³ et comme une étape dans l'identification des marqueurs de protéines du sérum sanguin pour les cancers du foie et du pancréas^4,5. Sans surprise, IMAC est également devenu une méthode de choix pour l'isolement d'un certain nombre d'enzymes bioénergétiques indigènes^6,7,8,9,10. Cependant, la mise en œuvre réussie de ces méthodes de purification pour des études sur les protéines bioénergétiques enzymatiquement actives dépend de la présence de niveaux négligeables de cations métalliques lixiviées de la matrice de colonne dans l'éluate. Les cations métalliques divalentes couramment utilisées dans l'IMAC ont connu une signification biologique pathologique, même à de faibles concentrations^11,12. L'effet physiologique de ces métaux est plus prononcé dans les systèmes bioénergétiques, où ils peuvent s'avérer mortels comme inhibiteurs de la respiration cellulaire ou de la photosynthèse^13,14,15. Des problèmes similaires sont inévitables pour la majorité des classes de protéines où les métaux résiduels contaminants peuvent interférer avec les fonctions biologiques d'une protéine ou la caractérisation avec des techniques biochimiques et biophysiques.

Alors que les niveaux de contamination des métaux dans des conditions oxydantes et en utilisant l'imidazole comme éluant sont généralement faibles¹⁶, les isolements protéiques effectués en présence d'agents de réduction de la cystéine (TNT, mercaptoéthanol, etc) ou avec des chélateurs plus forts comme l'histidine^17,18 ou l'acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) se traduisent par des niveaux beaucoup plus élevés de contamination métallique^19,20. De même, puisque les ions métalliques dans les résines IMAC sont fréquemment coordonnés par des groupes carboxyliques, les élutions protéiques effectuées dans des conditions acides sont également susceptibles d'avoir des niveaux beaucoup plus élevés de contamination des métaux. La teneur en métaux dans les solutions peut être évaluée à l'aide de la spectroscopie d'absorption atomique (AAS) et de la spectrométrie de masse plasmatique couplée inductive (ICP-MS) jusqu'à une limite de détection dans la gamme ppb-ppt^21,22,23,24. Malheureusement, l'AAS et l'ICP-MS ne sont pas des moyens réalistes de détection dans un laboratoire de biochimie traditionnel, car ces méthodes nécessiteraient l'accès à de l'équipement spécialisé et à la formation.

Les travaux antérieurs de Brittain^25,26 ont étudié l'utilisation du bleu hydroxynaphthol (HNB) comme un moyen d'identifier la présence de métaux de transition dans la solution. Cependant, il y avait plusieurs contradictions internes dans les données²⁰ et ces travaux n'offrait pas un protocole adéquat. Des études de Temel et coll.²⁷ et Ferreira et^{coll. 28} ont porté sur le travail de Brittain avec HNB en tant qu'indicateur métallique potentiel. Cependant, Temel a développé un protocole qui utilise aAS pour l'analyse de l'échantillon, en utilisant HNB seulement comme un agent de chélage. L'étude de Ferreira a utilisé le changement des spectres d'absorption de HNB à 563 nm, une région des spectres HNB à colorant libre qui chevauche fortement les spectres des complexes hNB-métal au pH 5.7, ce qui rend la sensibilité d'analyse assez faible et a entraîné une affinité de liaison métallique relativement faible²⁰. Pour résoudre les problèmes dans notre propre laboratoire avec Ni 2 'lixiviation de l'IMAC, nous avons élargi le travail effectué par Brittain^{25, 26} et Ferreria²⁸ pour développer un test facile capable de détecter les niveaux de nanomolar de plusieurs métaux de transition. Nous avons montré que HNB lie le nickel et d'autres métaux communs pour IMAC avec des affinités de liaison sous-nanomolaires et la forme 1:1 complexe sur un large éventail de valeurs de pH²⁰. L'analyse rapportée ici est basée sur ces résultats et utilise des changements d'absorption dans le spectre HNB à 647 nm pour la quantification des métaux. L'analyse peut être effectuée dans la plage de pH physiologique à l'aide de tampons et d'instruments communs trouvés dans un laboratoire de biochimie typique en utilisant la détection colorimétrique et la quantification des complexes de teinture métallique et le changement associé dans l'absorption du colorant libre lorsqu'il se lie au métal.

Protocole

1. Préparation des composants d'essai

1. Déterminer les fractions de chromatographie à déterminer à l'aide de l'absorption optique à 280 nm ou d'autres méthodes de quantification des protéines pour identifier les fractions enrichies en protéines.
   REMARQUE : Pour ce travail, nous avons utilisé un spectrophotomètre UV-Vis de tableau de diode. Pour augmenter le débit, un lecteur de plaque capable de mesurer l'absorption UV-Vis peut être utilisé.
2. Préparation des composants d'essai nécessaires
   1. Préparer ou obtenir un tampon de 10 à 100 mm (« tampon d'échantillon ») avec un pH entre 7 et 12.
      REMARQUE : Les tampons biochimiques courants tels que Tris, HEPES, MOPS et phosphate au pH neutre ou de base sont tous acceptables pour l'analyse. Tricine et histidine peuvent être utilisés, mais il faudra des courbes d'étalonnage car ils ont tous deux essentiellement chélate ions métalliques. Un exemple d'étalonnage de l'histidine est montré en référence²⁰.
   2. Préparer une solution de 12 % w/v (20 fois concentrée) de dispersion du bleu hydroxynaphthol (HNB) dans le tampon d'échantillon à l'aide de 120 mg de réactif HNB pour chaque millilitre de solution de stock préparée.
      CAUTION: L'exposition de HNB à l'œil peut causer de graves dommages et une irritation. La protection oculaire doit être utilisée lors de la manipulation hNB et les mains doivent être lavées à fond après la manipulation.
      REMARQUE: HNB est vendu comme une dispersion sur KCl par les principaux fournisseurs de réactifs scientifiques. En tant que tel, la concentration réelle dans la solution variera de différents fabricants, lots, et où dans la bouteille la dispersion HNB est prise à partir. Idéalement, une absorption comprise entre 0,5 et 0,8 à 647 nm après une dilution de 20 fois du stock devrait être atteinte.

2. Préparation et mesure de l'échantillon

1. Préparation du spectrophotomètre pour la collecte de données
   1. Allumez et réchauffez le spectrophotomètre UV-Vis. Définir le spectrophotomètre pour recueillir des données à 647 nm.
      REMARQUE : Si le spectrophotomètre le permet, recueillir en outre des données à 850 nm, ou une autre longueur d'onde sans changements significatifs liés aux spectres de teinture-métal et de colorant, pour être utilisé pour une correction de base.
   2. Videz le spectrophotomètre à l'aide du tampon d'échantillon.
      REMARQUE : Des cuvettes en plastique de quartz ou jetables peuvent être employées. Les cuvettes de quartz sont préférées pour l'analyse quantitative car elles permettront une précision et une précision plus élevées au-dessus des cuvettes en plastique jetables. Cependant, les cuvettes en plastique bloquent la lumière UV, qui peut être présente dans les faisceaux de mesure de certains spectrophotomètres à diodes. L'exposition de HNB à la lumière UV intense entraîne une dégradation notable des colorants et une diminution non désirée de l'absorption lente qui peut être confondue avec une liaison métallique lente (par exemple, voir la figure 1 dans l'information à l'appui de la référence 20).
2. Préparation et absorption de la mesure du contrôle
   1. Préparer une solution de contrôle contenant 50 L de stock HNB par millilitre de volume total d'assay. Pour assurer un bon mélange de tous les échantillons, pipette les petits volumes d'abord puis ajouter le tampon d'échantillon suivi par le mélange par pipetting. La solution HNB diluée doit être préparée fraîche, mais les stocks de HNB peuvent être stockés à 4 oC et protégés de la lumière pendant des semaines sans dégradation significative.
   2. Laisser le contrôle incuber pendant au moins 3 min à température ambiante.
      REMARQUE : Un temps d'incubation plus long peut être nécessaire pour les échantillons au pH alcalin ou en présence de phosphate en raison de la formation de complexes métalliques mal solubles entraînant un équilibre plus lent.
   3. Mesurer et enregistrer l'absorption à 647 nm pour l'échantillon témoin.
3. Mesure de préparation et d'absorption des échantillons
   1. Préparer les échantillons d'analyse en mélangeant 50 oL de bouillon de HNB avec 950 l de fractions de protéines correctement diluées avec le tampon d'échantillon.
      REMARQUE : Étant donné que les niveaux de contamination des métaux signalés dans la littérature varient d'un facteur de plus de 1 000 selon les conditions d'élution^16,20, il peut être nécessaire d'essayer quelques dilutions des fractions de protéines assayed avec le tampon d'échantillon (voir l'étape 1.2.1 ci-dessus) pour réaliser des changements d'absorption dans la plage dynamique de l'essai.
      CAUTION: Le nickel et d'autres métaux utilisés dans IMAC sont connus irritant sa peau, soupçonné d'être cancérogène, et sont capables d'endommager les reins et le sang après une exposition prolongée. Les gants et la protection oculaire doivent être utilisés lors de la manipulation d'échantillons de protéines préparés avec IMAC.
   2. Laisser l'échantillon incuber pendant au moins 3 min à température ambiante et mesurer les absorptions à 647 nm.
      REMARQUE : L'étape limitante de l'épreuve en termes de temps investi est l'étape d'incubation. Les données de cet article ont été recueillies à l'aide d'une cuvette à quartz unique qui a été soigneusement lavée entre chaque échantillon. Même avec le temps de lavage supplémentaire et la préparation du stock HNB, la collecte de données pour 14 échantillons et le contrôle a pris environ une heure et demie et en tant que tel, le protocole peut être facilement complété sans la nécessité d'interruption.
   3. Répétez les étapes 2.3.1 et 2.3.2 pour chaque fraction qui sera mesurée.
      REMARQUE : Si plusieurs cuvettes seront utilisées pour plusieurs échantillons, les échantillons doivent être préparés d'une manière qui permet te donne un temps d'incubation et une exposition comparables à la lumière ambiante.

3. Quantification des métaux

1. Détermination de la concentration de métal dans chaque échantillon
   1. Trouvez la différence de chaque absorption d'échantillon à 647 nm du contrôle HNB.
   2. Déterminer la concentration de métal (en M) à l'aide de la formule ci-dessous :
      
      
      
      où le DF est le facteur de dilution pour la fraction d'analyse, les Abs₆₄₇ est le changement d'absorption à 647 nm, 3,65x10^-2 représente le coefficient d'extinction de HNB (36,5 mM^-1cm^-1 voir Référence²⁰ pour plus de détails) et l'est la trajectoire optique de cuvette en cm.

Résultats

Le spectre de HNB libre au pH neutre (ligne noire) et les spectres représentatifs des fractions indiquées pour Ni^{2 '} de l'isolement de MSP1E3D1²⁹ sont indiqués dans la figure 2. Une série d'exemples réussies devrait démontrer une diminution de l'absorption à 647 nm par rapport au contrôle HNB, ce qui correspond à la formation de complexes HNB en présence d'un métal de transition. Un échec serait indiqué par une augmentation de l'absorption à 6...

Discussion

La détection colorimétrique des métaux à l'aide de HNB fournit un moyen simple de quantifier le degré de contamination des protéines par les ions métalliques de transition provenant des résines IMAC. Comme nous l'avons établi dans l'arbitre 20, Ni^{2 s'associe} à HNB avec 1:1 stoichiométrie et la constante de dissociation pour le complexe Ni-HNB change avec le pH. Cependant, le complexe K_d est dans la gamme sous-nM pour toutes les valeurs recommandées (7-12) pH. Concrètement, cela signifie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500