Pruebas de hipofagia inducida por la sacarosa y la novedad en ratas utilizando un sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para estudiar el comportamiento anhedónico y similar a la depresión en ratas. Combina dos métodos de comportamiento bien establecidos, la preferencia de sacarosa y las pruebas de hipofagia inducidas por la novedad, con un sistema automatizado de monitoreo de ingesta de alimentos y líquidos, para investigar indirectamente el comportamiento de los roedores utilizando parámetros suplentes.

Resumen

La prevalencia y la incidencia de trastornos depresivos están aumentando en todo el mundo, afectando a unos 322 millones de individuos, subrayando la necesidad de estudios conductuales en modelos animales. En este protocolo, para estudiar el comportamiento anhedónico y similar a la depresión en ratas, la preferencia de sacarosa establecida y las pruebas de hipofagia inducidas por la novedad se combinan con un sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos y líquidos. Antes de las pruebas, en el paradigma de preferencia de sacarosa, las ratas macho se entrenan durante al menos 2 días para consumir una solución de sacarosa además del agua del grifo. Durante el examen, las ratas se exponen de nuevo al agua y a la solución de sacarosa. El sistema automatizado registra el consumo cada segundo. La relación entre sacarosa y la ingesta total de agua (relación de preferencia de sacarosa) es un parámetro suplente de la anhedonia. En la prueba de hipofagia inducida por la novedad, las ratas macho pasan por un período de entrenamiento en el que están expuestas a un aperitivo apetecible. Durante el entrenamiento, los roedores muestran una ingesta estable de refrigerios basales. El día de la prueba, los animales son transferidos de jaulas caseras a una jaula fresca y vacía que representa un nuevo entorno desconocido con acceso a la conocida tentempié apetecible. El sistema automatizado registra la ingesta total y su microestructura subyacente (por ejemplo, latencia para acercarse a la merienda), proporcionando información sobre los comportamientos anhedónicos y ansiosos. La combinación de estos paradigmas con un sistema de medición automatizado proporciona información más detallada, junto con una mayor precisión al reducir los errores de medición. Sin embargo, las pruebas utilizan parámetros suplentes y solo representan la depresión y la anhedonia de manera indirecta.

Introducción

En promedio, el 4,4% de la población mundial está afectada por la depresión. Estos representan 322 millones de personas en todo el mundo, un 18% más en comparación con hace diez años¹. Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud, la depresión será la segunda en el ranking de Años de Vida Ajustados por Discapacidad en 2020². Para abordar la creciente prevalencia de trastornos afectivos y establecer nuevas estrategias de intervención, es necesario seguir estudiando este comportamiento. Antes y además del examen en humanos, son necesarios estudios en animales.

Se han establecido varios modelos para estudiar los componentes del comportamiento depresivo (es decir, prueba de natación forzada, prueba de suspensión de cola, prueba de preferencia de sacarosa e hipofagia inducida por la novedad)^3,4. La prueba de preferencia de sacarosa (SPT) y la hipofagia inducida por la novedad (NIH) pueden detectar un comportamiento similar a la depresión en animales. Estas pruebas en sí mismas no inducen un estado de depresión en los roedores, pero representan cambios agudos en el comportamiento. Tanto el SPT como el NIH evalúan un rasgo característico de la depresión conocido como anhedonia, que es la pérdida de interés en lo siguiente: actividades gratificantes, actividades que alguna vez fueron disfrutadas por el individuo^5,y un aspecto del complejo fenómeno de procesamiento y responder a la recompensa⁶. Ambas pruebas estudian la respuesta a un estímulo gratificante en forma de alimentos agradables. El grado de consumo sirve como parámetro suplente para la anhedonia^7,8,9.

El valor de los ensayos que investigan la anhedonia depende en gran medida de la determinación precisa del consumo resultante de la medición precisa del peso de la sustancia. Convencionalmente, esta medición se realiza manualmente una vez antes y una vez después de la prueba. Sin embargo, esto es propenso a mediciones erróneas por varias razones. Primero, los roedores tienden a acumular alimentos, lo que significa que retiran los alimentos sin consumirlos inmediatamente y luego los esconden en un lugar seguro. Por lo tanto, esta pérdida de alimentos puede incluirse en el cálculo del consumo total. En segundo lugar, las ratas derraman alimentos y agua, lo que resulta en pérdida de peso sin consumo respectivo. En tercer lugar, la pérdida involuntaria de líquido se produce debido a la manipulación de las botellas mediante la inserción y remoción de las jaulas.

En un enfoque para reducir estas fuentes de error, combinamos las dos pruebas comunes que evalúan la anhedonia (SPT^3,4 y NIH⁹⁾con la medición de la ingesta de alimentos y agua utilizando un sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos y líquidos. Este procedimiento permite una investigación precisa del consumo de sustancias agradables, así como proporciona información sobre la experiencia del placer en ratas como una característica de comportamiento similar a la depresión. Los errores mencionados anteriormente asociados con la medición manual se reducen mediante el uso de diferentes enfoques, que se ilustran más adelante con más detalle.

Para proporcionar información sobre la microestructura, el sistema automatizado de monitorización de la ingesta utilizado en este protocolo¹⁰ pesa los alimentos (±0,01 g) cada segundo. Por lo tanto, un peso estable se documenta como "no comer", y un peso inestable como "comer". Un "combate" se define como un cambio en el peso estable antes y después de un evento. Una comida consiste en uno o más combates y su tamaño mínimo en ratas se definió como 0.01 g. Una comida se separa de otra comida en ratas por 15 min (valor estandarizado). Por lo tanto, la ingesta de alimentos se considera una comida cuando los episodios ocurrieron dentro de 15 min y el cambio de peso es igual o mayor que 0.01 g. Los parámetros de las comidas evaluados en este protocolo incluyen la duración de la comida, el tiempo dedicado a las comidas, el tamaño de la pelea, la duración de la pelea, el tiempo dedicado a los combates, la latencia al primer combate y el número de combates.

Protocolo

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales siguieron las directrices específicas de ética institucional y fueron aprobados por la autoridad estatal para la investigación animal.

1. Funcionamiento del sistema de monitoreo automatizado

NOTA: Al utilizar el sistema de monitoreo automatizado, es crucial documentar cada acción en el cuadro de comentarios incluido en el software inmediatamente antes de la acción. La descripción se debe escribir en el cuadro de comentarios y, pulsando Guardar, se guarda con un punto de tiempo específico. Los puntos de tiempo son significativos al analizar los datos, ya que el sistema registra continuamente y el período de interés debe indicarse para el análisis.

1. Instalación, uso y mantenimiento del sistema de monitorización automatizado
   NOTA: Este protocolo utiliza ratas macho adulto Sprague Dawley que pesan entre 250 y 300 g (10 semanas). Se recomienda alojar ratas en grupos durante el período de aclimatación. Las condiciones ambientales deben controlarse con los siguientes parámetros: 12 h/12 h ciclo de luz/oscuridad con luces encendidas a las 6:00 A.M, humedad del 45% al 65% y temperatura de 21–23 oC, y acceso ad libitum al agua y a la dieta estándar de roedores. El manejo diario permite que los animales se acostumbre a los investigadores.
   1. Separe las ratas para que cada animal tenga una jaula individual. Asegúrese de que cada rata permanezca separada durante el protocolo.
   2. Llene las jaulas de la carcasa con ropa de cama regular con una capa de 1-2 cm de espesor. Esta cantidad (reducida) reduce la posibilidad de contaminación de microbalanzas y tolvas con derrames, reduciendo así los errores de medición. Agregue tubos de plástico (por ejemplo, un trozo de 20 cm de largo de un tubo de drenaje de plástico con un diámetro de 8 cm) y madera roída como enriquecimiento, mientras omite los tejidos de papel para reducir los errores de medición.
   3. Prepare las jaulas para la medición automatizada de la ingesta de alimentos sólidos y líquidos mediante la fijación de dos soportes de jaula cerrados con microbalanzas a agujeros hechos a medida en la parte frontal de las jaulas. Coloque dos tolvas vacías en los soportes de la jaula, una para la comida y otra para la botella.
      NOTA: Las microbalanzas se conectan a través de cables a un sistema de grabación conectado a un ordenador y el software respectivo está instalado en el ordenador.
   4. Para iniciar la grabación, abra"Monitor"y pulse "Iniciar",luego elija un lugar para guardar los datos.
   5. Usando la función de calibración (presione "Calibrar") del sistema automatizado de monitoreo de admisión, calibre cada balanza quitando las tolvas y colocando dos pesos calibrados diferentes en los soportes de la jaula con balanzas. Haga esto a intervalos de tiempo regulares (se recomiendasemanalmente).
   6. Llene una tolva completamente con chow (100 g) y retire las piezas de chow y los desmoronamientos que son demasiado pequeños en tamaño. Llene el agua en la botella (100 ml) y colóquela en la otra tolva.
   7. Documentar la posición de los alimentos y el agua (por ejemplo, equilibrio 1: animal alimentario 1, equilibrio 2: animal de agua 1).
   8. Coloque la rata en la jaula y abra todas las puertas de los soportes de la jaula para que pueda comer y beber ad libitum.
      NOTA: Para una medición precisa, es necesario mantener las balanzas y tolvas diariamente limpiando suavemente con un cepillo de derrames y retirando pequeñas migas de alimentos del recipiente de alimentos. Esto reducirá en gran medida la medición errónea. Cierre todas las puertas durante el mantenimiento diario.
2. Acceso a los datos después de los experimentos
   1. Busque en el cuadro de comentarios los puntos de tiempo inicial y final de un período (por ejemplo, entrenamiento, prueba) que debe analizarse.
   2. Haga clic en"Ver datos"en el software para abrir el Visor de datos.
   3. Inserte los puntos de tiempo en los cuadros debajo de"Hora de inicio"y "Hora de finalización". Pulse el cuadrado en la esquina superior izquierda que indica el saldo que registró la información.
   4. Haga clic en "Totales PSC" para acceder a los datos de microestructura. Pulse el botón "Exportar tabla PSC" para exportar los datos.
      NOTA: Para comparar la microestructura de animales individuales (por ejemplo, sin estrés frente a estresado) mediante el monitoreo automatizado, los animales individuales se pueden seleccionar en el"Visor de datos" presionando el cuadrado apropiado en la esquina superior izquierda. Los totales de PSC muestran sólo la microestructura para el animal seleccionado. El análisis estadístico no se puede realizar con el sistema. Los datos deben extraerse en un programa de hoja de cálculo/software de análisis.

2. Implementación de la prueba de preferencias de sacarosa

1. Realización del período de formación
   NOTA: Antes de la prueba, los animales deben estar acostumbrados a la disponibilidad de dos botellas para líquidos en tolvas a través de las puertas, mientras que los alimentos deben proporcionarse desde la parte superior de las jaulas (la configuración se muestra en la Figura 1). Este período de entrenamiento debe durar al menos 2 días. Se realiza en las jaulas de casa en la habitación donde se encuentran los animales.
   1. Cierra todas las puertas. Retire la botella de agua y el recipiente de alimentos de las microbalanzas.
   2. Coloque los alimentos prepesados (50 g) en la parte superior de la jaula y documente su peso diariamente usando un equilibrio regular para evaluar el consumo diario de alimentos. Rellene, si es necesario.
   3. Limpie una botella con agua clara y rellene con alrededor de 100 ml de agua. Colóquelo de nuevo en la tolva.
   4. Llene una segunda botella limpia con 100 ml de solución de sacarosa 1% recién hecha. Colóquelo en la tolva.
      NOTA: Marque las botellas cuidadosamente y documente sus ubicaciones (por ejemplo, equilibrio 1: animal de agua 1, equilibrio 2: solución de sacarosa animal 1).
   5. Abran todas las puertas. Documentar el inicio de la formación en el sistema de monitoreo. Deje las puertas abiertas durante 24 h, lo que resulta en acceso ad libitum a ambas botellas. Después de las 24 h, cierra las puertas y documenta el final del entrenamiento. Los datos del intervalo de 24 h se pueden evaluar utilizando el sistema de monitoreo automatizado insertando la"hora de inicio"y "hora de finalización". Los procedimientos son los mismos cuando se evalúa un intervalo de prueba de 1 h.
   6. Limpie y rellene las botellas cada 24 h. Preparar una solución fresca de sacarosa al 1% todos los días. Cambie la posición de la botella de solución de agua y sacarosa diariamente para evitar efectos de habituación.
      NOTA: Llevar a cabo el entrenamiento en todos los animales al menos 48 h hasta que las relaciones de preferencia alcancen el 1. La relación de preferencias de sacarosa se evalúa directamente después del entrenamiento utilizando el"Visor de datos". Se calcula como la relación entre la ingesta de sacarosa y la ingesta general (agua más ingesta de sacarosa).
   7. 24 horas antes de la prueba, retire el frasco con la solución de sacarosa para que la rata tenga acceso a la comida estándar y al agua solamente.
   8. Preparar una botella fresca llena de agua del grifo y otra llena con una solución de sacarosa al 1%, ambas con 100 ml.
   9. Antes de las pruebas, cierre todas las puertas.
   10. Retire la botella llena de agua del grifo de la tolva y coloque las dos botellas frescas, una llena de agua del grifo y otra llena con una solución de sacarosa al 1%, en la tolva.
   11. Abran todas las puertas, documenten el inicio de la prueba en el sistema de monitoreo. Deje las puertas abiertas durante 60 min. Cierre las puertas después de 60 min y documente el final de la prueba.
   12. Evaluar los datos (por ejemplo, la relación entre sacarosa y ingesta total de líquidos).
       NOTA: La prueba se puede repetir varias veces con intervalos de entrenamiento (al menos 2 días) en el medio.

3. Implementación de la prueba de hipofagia inducida por la novedad

1. Realización del período de formación
   NOTA: Antes de las pruebas, se recomienda un período de entrenamiento diario de 30 minutos de 5 días (la configuración se muestra en la Figura 2). El objetivo es lograr una línea de base estable de la ingesta de refrigerios agradables antes del experimento. Se realiza en las jaulas de casa en la habitación donde se encuentran los animales.
   1. Cierre todas las puertas y retire la tolva con comida estándar.
   2. Llene una tolva fresca con el aperitivo apetecible (50 g). Inserte las galletas cuidadosamente en la tolva para evitar el desmoronamiento. Coloque la tolva en el soporte de la jaula en la parte superior de la microbalanza.
   3. Abra las puertas durante 30 minutos para que la rata tenga acceso ad libitum a la merienda y agua. Documentar el inicio de la formación en el sistema de monitoreo.
      NOTA: La rata no debe tener acceso a la comida estándar durante el período de entrenamiento.
   4. Cierre las puertas después de 30 minutos y documente el final del entrenamiento en el sistema de monitoreo. Sustituya la merienda por la comida estándar.
   5. Repita esto diariamente hasta que se logre una ingesta estable de refrigerios estables (por ejemplo, 1,5–2,0 g/30 min) y 2) la ingesta no difiere estadísticamente entre los días de entrenamiento.
2. Realización de la prueba de hipofagia inducida por la novedad
   1. Prepare una jaula vacía y recién limpiada sin ropa de cama ni enriquecimiento conectado al sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos. Coloque una tolva con una botella de agua del grifo y una tolva con un aperitivo agradable en los soportes de la jaula.
      NOTA: La jaula novedosa debe colocarse en la misma habitación donde se llevan a cabo las ratas y se lleva a cabo el entrenamiento. Mantén las puertas cerradas.
   2. Retire la rata de la jaula de casa y colóquela en la jaula novedosa.
   3. Abra todas las puertas durante 30 min. Documente el comienzo de las pruebas en el sistema de monitoreo.
      NOTA: Durante los 30 minutos de acceso a la merienda, el tamaño de la ingesta de refrigerios y los parámetros subyacentes de la microestructura (por ejemplo, latencia a la primera comida) se registran utilizando el sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos.
   4. Cierre las puertas después de 30 minutos y documente el final de las pruebas. Coloque la rata de nuevo en la jaula de casa.
      NOTA: La prueba se puede repetir varias veces con intervalos de entrenamiento (al menos 5 días) en el medio.

Resultados

Para probar la distribución de datos, se utilizó la prueba Kolmogorov-Smirnov. Se utilizaron pruebas T cuando los datos se distribuyeron normalmente y se utilizó la prueba Mann-Whitney-U, si no. ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey se utilizó para la comparación de varios grupos normalmente distribuida. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunn se utilizó en casos de distribución no normal. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas cuando <...

Discusión

La preferencia de sacarosa y las pruebas de hipofagia inducidas por la novedad son dos técnicas establecidas para evaluar la anhedonia en ratas. Su combinación con el sistema automatizado de monitoreo de la ingesta de alimentos permite un análisis más detallado en ratas sin perturbaciones y reduce la medición errónea.

La incidencia de errores se ve reducida por diferentes enfoques. En primer lugar, para solucionar el error que se produce debido a derrames, el espacio entre la tolva de al...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT