Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per la produzione di fette di fegato tagliate di precisione dai topi. I campioni di tessuto ex vivo possono essere mantenuti in condizioni di coltura dei tessuti di laboratorio per più giorni, fornendo un modello flessibile per esaminare la patobiologia epatica.

Abstract

Comprendere i meccanismi di lesioni epatiche, fibrosi epatica e cirrosi che sono alla base di malattie epatiche croniche (cioè epatite virale, malattia epatica grassa non alcolica, malattia metabolica del fegato e cancro al fegato) richiede la manipolazione sperimentale di modelli animali e colture in vitro cellulari. Entrambe le tecniche hanno limitazioni, come il requisito di un gran numero di animali per la manipolazione in vivo. Tuttavia, le colture cellulari in vitro non riproducono la struttura e la funzione dell'ambiente epatico multicellulare. L'uso di fette di fegato tagliate con precisione è una tecnica in cui fette uniformi di fegato di topo vitale vengono mantenute nella coltura dei tessuti di laboratorio per la manipolazione sperimentale. Questa tecnica occupa una nicchia sperimentale che esiste tra gli studi sugli animali e i metodi di coltura delle cellule in vitro. Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per isolare e coltura le fette di fegato tagliate con precisione dai topi. Come applicazione di questa tecnica, le fette di fegato ex vivo vengono trattate con acidi biliari per simulare lesioni epatiche colestatiche e, infine, valutare i meccanismi della fibrogenesi epatica.

Introduzione

La patogenesi della maggior parte delle malattie epatiche croniche (cioè l'epatite virale, la steatoepatite analcolica, la lesione epatica colestatica e il cancro al fegato) comporta complesse interazioni tra più diversi tipi di cellule epatiche che guidano infiammazione, fibrogenesi e sviluppo del cancro^1,2. Per comprendere i meccanismi molecolari alla base di queste malattie croniche a base di fegato, è necessario studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Mentre più linee cellulari epatiche (e più recentemente, organoidi) possono essere coltivate in vitro, questi modelli non emulano con precisione la struttura complessa, la funzione e la diversità cellulare del microambiente epatico³. Inoltre, le cellule epatiche coltivate (in particolare, linee cellulari trasformate) possono discostarsi dalla loro biologia originale. I modelli animali vengono utilizzati sperimentalmente per studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Tuttavia, possono diventare significativamente ridotti nel margine di manipolazione sperimentale, a causa di significativi effetti fuori bersaglio negli organi extraepatici (ad esempio, durante il test di potenziali terapie).

L'uso di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) nella coltura tissutale è una tecnica sperimentale utilizzata per la prima volta negli studi di metabolismo e tossicità dei farmaci, e comporta il taglio di fette di fegato vitali e ultrasottili (circa 100-250 m di spessore). Questo permette la manipolazione sperimentale diretta del tessuto epatico ex vivo⁴. La tecnica colma un divario sperimentale tra gli studi sugli animali in vivo e i metodi di coltura delle cellule in vitro, superando molti inconvenienti di entrambi i metodi (cioè limiti pratici sulla gamma di esperimenti che possono essere eseguiti in animali interi, nonché la perdita di struttura/funzione e diversità cellulare con metodi di coltura in vitro cell).

Inoltre, il PCLS aumenta notevolmente la capacità sperimentale rispetto agli studi sugli animali interi. Come un topo può produrre più di 48 fette di fegato, questo facilita anche l'uso di entrambi i gruppi di controllo e di trattamento dallo stesso fegato. Inoltre, la tecnica separa fisicamente il tessuto epatico da altri sistemi di organi; pertanto, rimuove i potenziali effetti fuori bersaglio che possono verificarsi in animali interi durante il test degli effetti degli stimoli esogeni.

In questo protocollo, PCLS vengono generati utilizzando un vibratome con una lama vibrante lateralmente. Altri studi hanno usato con successo un affettatrice di tessuto Krumdieck, come descritto in Olinga e Schuppan⁵. Nel vibratome, la vibrazione laterale della lama impedisce lo strappo del tessuto ultrasottile causato dallo stress di taglio, poiché la lama viene spinta nel tessuto. Sia il vibratome che l'affettatrice di tessuto Krumdieck funzionano in modo efficace senza l'incorporamento strutturale del tessuto epatico, che semplifica la procedura di affettatura. Questa tecnica può essere utilizzata anche per creare PCLS da fegati malati, compresi quelli da modelli murini di fibrosi/cirrosi⁶ e steatosi epatica⁷.

Oltre a dimostrare le tecniche necessarie per la preparazione e la coltura tissutale di PCLS, questo rapporto esamina anche la fattibilità di questi tessuti ex vivo misurando i livelli di triposfato di adenosina (ATP) ed esaminando l'istologia dei tessuti per valutare la necrosi e la fibrosi. Come procedura sperimentale rappresentativa, pcLS sono trattati con concentrazioni patofisiologiche di tre diversi acidi biliari (glicocolilici, taurocolilici e colici) per simulare lesioni epatiche colestatiche. Nel contesto della lesione epatica colestatica, l'acido taurocholico in particolare ha dimostrato di essere significativamente aumentato sia nel siero che nella bile dei bambini con malattia epatica associata alla fibrosi cistica⁸.

Le cellule progenitrici del fegato sono state trattate anche in vitro con acido taurocolilico per simulare i livelli elevati di acido taurocolilico osservati nei pazienti, e questo trattamento ha causato una maggiore proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici epatiche verso un fenotipo biliare (cholangiocyte)⁹. Successivamente, PCLS sono stati trattati ex vivo con elevati livelli di acido taurocolilico, e sono stati osservati marcatori di colgaliociti aumentati. Ciò supporta l'osservazione in vitro che l'acido taurocholico guida la proliferazione biliare e/o la differenziazione nel contesto della malattia epatica associata alla fibrosi cistica pediatrica⁹.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici presso il QIMR Berghofer Medical Research Institute con l'approvazione del comitato per l'etica animale dell'istituto. I topi maschi C57BL/6 (15-20 settimane) furono ottenuti dall'Animal Resources Centre, WA, Australia.

NOTA: tutte le soluzioni, i supporti, gli strumenti, l'hardware e i tubi che contattano i campioni devono essere sterilizzati o accuratamente disinfettati con una soluzione di etanolo del 70% e gestiti utilizzando tecniche sterili per ridurre al minimo il rischio di contaminazione della coltura.

1. Configurazione del vibratome

1. Preparare sterile Krebs-Henseleit soluzione tampone con 2 g/L di glucosio (). Verificare che il pH del buffer sia 7.4. Se il pH è più alto, saturare il buffer con carbogen (95% O₂ , 5% CO₂) o incubare all'interno di un incubatore di coltura di tessuto CO₂ 5% per correggere il sistema di buffering del bicarbonato. Conservare in frigorifero la soluzione di tampone sterile sigillata a 4 gradi centigradi.
2. Inserire la lama vibratoma nel braccio di taglio. Assicurarsi che la lama sia strettamente fissata al braccio di taglio, poiché le vibrazioni possono causare l'allentarsi della lama.
3. Disinfettare la lama e tagliare il braccio con una soluzione di etanolo del 70%.
   AVVISO: Evitare il contatto con la lama.
4. Disinfettare il vassoio tampone con una soluzione di etanolo del 70% e pulirlo con un tessuto sterile.
5. Inserire il vassoio del buffer nel vibratoma e stringere il meccanismo di montaggio.
6. Impostare il braccio di taglio all'altezza massima disponibile.
7. Impostare l'angolo della lama a 10 gradi sotto l'orizzontale, inclinandosi verso il basso rispetto al campione. Assicurarsi che l'angolo della lama sia ben fissato.
   NOTA: L'angolo ottimale della lama può variare a seconda del modello vibratoma e delle caratteristiche dei tessuti.
8. Disinfettare il supporto del campione con una soluzione di etanolo del 70%.
9. Collegare l'acqua di raffreddamento per il dispositivo di raffreddamento termoelettrico Peltier situato sotto il vassoio tampone.
   NOTA: Alcuni modelli di vibratomi utilizzano invece un bagno di ghiaccio per il raffreddamento.
10. Fissare il tubo di uscita dell'acqua per uno scarico e accendere l'acqua. Impostare il dispositivo di raffreddamento a 4 gradi centigradi. Eseguire l'acqua di raffreddamento ad una velocità di >400 mL/min.
11. Riempire il vassoio del tampone quasi verso l'alto con sterile tampone Krebs-Henseleit ghiacciato (con 2 g/L di glucosio). Lasciare su ghiaccio un'ulteriore soluzione tampone Krebs-Henseleit.

2. Rimozione e preparazione del fegato

1. Sterilizzare o disinfettare tutti gli strumenti chirurgici, tra cui pinze curve, pinze a punta quadrata piatta, pinzette, morsetti chirurgici e forbici con autoclaving.
2. Prima della rimozione del fegato, anestesizzare profondamente i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.
   NOTA: Possono essere utilizzati altri anestetici, o i topi possono essere eutanasiati da CO₂ asfissia / dislocazione cervicale se il fegato viene rapidamente rimosso per prevenire danni causati dall'ipossia.
3. Disinfettare le superfici cutanee sui topi bagnando con una soluzione di etanolo del 70%. Topi sicuri sulla schiena con tutte le estremità appuntate a una tavola di dissezione.
4. Fare un'incisione verticale media nella pelle dalla base della cavità addominale appena sopra il diaframma.
   NOTA: Le incisioni verso le estremità sono fatte per facilitare la ritrazione della pelle.
5. Tirare la pelle indietro mentre si taglia qualsiasi tessuto connettivo tra la pelle e la cavità addominale. Impedire che i capelli vengano trasferiti nella cavità addominale il più possibile. Pin o bloccare la pelle lontano dalla cavità addominale.
6. Utilizzando pinze e forbici pulite, aprire la cavità addominale e la cavità toracica inferiore.
7. Rimuovere rapidamente il fegato senza danneggiare i lobi
   1. Utilizzando strumenti smussati (ad esempio, pinze piatte a punta quadrata), guidare i lobi superiori del fegato verso il basso verso l'addome. Tagliare il tessuto connettivo che circonda i lobi epatici superiori utilizzando le forbici.
   2. Guidare i lobi epatici verso l'alto verso il diaframma. Tenere il fascio vascolare centrale del fegato con pinze.
      NOTA: Non influenzerà la procedura se il fascio vascolare centrale è danneggiato.
   3. Togliere il fascio vascolare centrale dal mouse e tagliare il tessuto connettivo rimanente, i vasi sanguigni, ecc. per rimuovere il fegato. Fare attenzione a 1) danneggiare i lobi del fegato e 2) tagliare nel tratto gastrointestinale, in quanto questo può contaminare il fegato con microrganismi.
8. Mettere il fegato rimosso in un piatto sterile di coltura dei tessuti di 10 cm mezzo pieno di soluzione tampone Krebs-Henseleit ghiacciata. Utilizzando uno strumento smussato per guidare i lobi, tagliare il centro del fegato per dividerlo in lobi separati.
9. Selezionare un lobo epatico (utilizzare il più grande primo), e posizionarlo lato piatto verso il basso su un nuovo piatto sterile 10 cm. Conservare tutti gli altri lobi epatici nel piatto di Krebs-Henseleit soluzione tampone conservati sul ghiaccio per un uso successivo.
10. Tagliare circa il 10% del materiale dal bordo più alto del lobo del fegato mentre si è sdraiati.
    NOTA: Il taglio è importante, in quanto questo bordo del tessuto contatterà prima la lama di taglio; pertanto, un bordo di tessuto relativamente perpendicolare alla lama di taglio impedirà la compressione dei tessuti che può verificarsi a causa di angoli superficiali nei lobi epatici non tagliati.
11. Tagliare gli altri tre bordi del tessuto.
    NOTA: Questo rimuove parte della capsula fibrosa di Glisson e renderà più facile la separazione delle fette di tessuto.
12. Montaggio del lobo epatico sul supporto del campione
    1. Posizionare un sottile strato di colla cianoacrilata (supercolla o colla di cianoacrilata di grado medico/veterinario) sul supporto dell'esemplare verso la parte anteriore, dimensionata leggermente più grande del lobo di fegato tagliato.
       NOTA: Verificare che la colla cianoacrlate non contenga additivi non cianoacristi.
    2. Raccogliere delicatamente il lobo del fegato con pinze sterili utilizzando un angolo lontano dal tagliente, quindi asciugare qualsiasi tampone residuo dal lato piatto del lobo del fegato utilizzando materiale assorbente sterile.
    3. Posizionare il grande lato piatto del lobo del fegato sul cerotto di colla cianoacrita con il bordo più grande rivolto verso la parte anteriore. Lascia che si guarisca nell'aria per 1/2 min.
       NOTA: Gli adesivi cianoacrilati curano rapidamente (2 min) in risposta all'umidità residua e alle proteine dei tessuti, e attaccheranno saldamente il tessuto al supporto del campione.

3. Produzione di fette di fegato

1. Posizionare il supporto del provino con il lobo del fegato collegato nel vassoio del tampone del vibratoma. Assicurarsi che il lobo del fegato sia completamente coperto da tampone.
   NOTA: Se necessario, ricaricare il livello di soluzione tampone Krebs-Henseleit ghiacciata. Se il livello di buffer oscura il processo di taglio, aumentare o diminuire il livello.
2. Impostare la velocità di taglio.
   NOTA: potrebbe essere necessario determinare empiricamente a seconda del modello vibratoma e delle caratteristiche della lama. Come guida di partenza, utilizzare una velocità di 57 Hz/3.420 rpm. La velocità del vibratoma può essere misurata utilizzando un'applicazione di analisi dello spettro audio su uno smartphone.
3. Abbassare la lama di taglio fino a quando non si trova appena sopra il lobo del fegato utilizzando il quadrante di altezza. Eseguire il braccio di taglio vibrante sopra il campione.
4. Riportare la lama utilizzando la maniglia a manovella in senso inverso. Attivare le vibrazioni durante la restituzione della lama. Dopo che la lama è tornata e non è al di sopra del campione, abbassare l'altezza della lama di 250 m.
5. Ripetere il processo di taglio fino a rimuovere la parte superiore del tessuto. Scartare le prime una o due fette, in quanto queste conterranno la capsula di Glisson e quindi non contengono molto tessuto epatico funzionale rispetto ad altre fette.
6. Per tagliare le fette di fegato, far avanzare lentamente la lama vibrante nel tessuto ruotando la maniglia. Utilizzare un piccolo pennello (disinfettato con una soluzione di etanolo del 70%) per guidare delicatamente il tessuto durante il processo di taglio.
7. Utilizzare il pennello per sollevare le fette di tessuto tagliato e posizionare la fetta di tessuto in un tubo sterile di tampone Krebs-Henseleit ghiacciato. Quando non è in uso, tenere questo tubo sul ghiaccio tra le fette.
   NOTA: A volte, il tessuto strappa durante il processo di taglio, ma per la maggior parte degli scopi il tessuto è ancora utilizzabile.
8. Ripetere il processo di taglio fino a raggiungere la base del lobo epatico. Scartare eventuali fette di fegato che hanno visibile colla curata.
   NOTA: La colla curata è visibile come aree bianche sulle fette di tessuto. Un tipico lobo epatico avrà solo uno spessore utilizzabile di circa 2 mm. Pertanto, solo otto fette di fegato da 250 m sono prodotte da ogni lobo.
9. Tagliare le fette di tessuto fino a vicino alla colla cianoacrilata. Non tagliare nella colla.
10. Ripetere l'intero processo con altri lobi epatici fino a ottenere il numero richiesto di fette di tessuto.
11. Per pulire la colla e il tessuto di cianocrita curati dal supporto del campione, utilizzare una lama per raschiare la miscela di colla/tessuto stagionato, oppure ammorbidire e pulire la miscela con acetone o zolfo dimetilico.

4. Cultura dei tessuti

NOTA: Tutto il lavoro di coltura dei tessuti deve essere eseguito in una cappa sterile a flusso laminare.

1. In una cappa di flusso laminare di coltura tissutale, pipetta 1 mL del mezzo E di William contenente 2,0 g/l di glucosio, 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 u/mL di penicillina e 100 streptomici in 12 piastre di coltura dei tessuti.
   NOTA: possono essere aggiunti anche altri antibiotici e agenti antifungini. Alcuni studi hanno utilizzato additivi nel mezzo di incubazione dei tessuti (ad esempio, dexamethasone e insulina¹⁰), ma questi possono interferire con la segnalazione cellulare.
2. Posizionare il tubo contenente fette di fegato dal ghiaccio nella cappa di coltura dei tessuti. Per rimuovere le fette di tessuto, ruotare delicatamente il composto e puntarlo delicatamente in un piatto sterile di 10 cm mentre vorticoso.
3. Utilizzando pinze sterili a punta affilata e un bisturi, tagliare le fette di tessuto in dimensioni approssimativamente uniformi (ad esempio, 15 mm²).
   NOTA: questo passaggio viene eseguito per garantire una superficie coerente. Poiché i lobi del fegato di topo sono di dimensioni significativamente diverse e alcune fette di tessuto si lacerano, questo produrrà una gamma di PCLS con aree di superficie variabili. Le dimensioni finali delle superfici di superficie dei PCLS dipendono dalla quantità di materiale necessaria nelle applicazioni di analisi successive e dal numero di repliche necessarie. Tagliare grandi PCLS in più pezzi più piccoli della stessa dimensione approssimativa permetterà innatamente un aumento del numero di repliche sperimentali.
4. Utilizzando pinze sterili o un piccolo pennello, trasferire le fette di tessuto tagliato ai pozzetti di un pozzo 12 contenente 1 mL di mezzo.
   NOTA: Fare attenzione a confermare la consistenza dello spessore e della forma delle fette di tessuto. Le sezioni più scure della media suggeriscono che lo spessore del tessuto è maggiore e deve essere scartato. Le fette più leggere suggeriscono la presenza di colla cianoacrilata curata e devono essere scartate.
5. Incubare le fette di fegato a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ sotto il 95% di umidità.
   NOTA: Altri gruppi hanno utilizzato metodi per migliorare la consegna di ossigeno a PCLS, che sembrano prolungare il tempo di sopravvivenza dei tessuti^{6,10,11,12,13} (vedi sezione discussione).
6. Il giorno successivo, cambiare il mezzo di coltura utilizzando una pipetta manuale (piuttosto che aspirazione) per prevenire la perdita di tessuto attraverso errori di aspirazione. Successivamente, cambiare il supporto sul PCLS ogni giorno. I PCLS sono ora pronti per l'uso sperimentale.

5. Esempio di applicazione di PCLS

1. A 16 ore dopo la generazione, trattare pcLS con tre diversi acidi biliari: acido glicococolilico (GCA), acido taurocolilico (TCA), e acido collezioso (CA) (come sali di sodio, il tutto ad una concentrazione di 150 m) per 2 giorni.
2. Dopo 2 giorni di trattamento dell'acido biliare, estrarre l'mRNA inserendo fette di tessuto nel tampone di lisi di RNA ghiacciato e omogeneizzare rapidamente utilizzando perline con un omogeneizzatore di perline ().
3. Purificare l'RNA utilizzando un kit di isolamento rna () e creare cDNA dall'RNA purificata.
4. Eseguire la reazione quantitativa della catena di polimerasi () utilizzando primer specifici ( Tabella1) sul cDNA per esaminare l'espressione genica.

Risultati

Per determinare la vitalità cellulare dei PCLS nel tempo, sono stati misurati i livelli di ATP dei tessuti. I livelli ATP sono in genere proporzionali alla redditività. I PCLS (circa 15 mm² nell'area) sono stati coltivati nel normale mezzo E di William con il 10% di FBS, quindi in tempi specifici, le fette di fegato sono state rimosse dalla coltura dei tessuti e omogeneizzate con concentrazioni atP e proteine (per la normalizzazione) (

Discussione

Il protocollo dimostra l'applicazione dell'isolamento e della coltura dei tessuti del PCLS murino, e le procedure sono progettate per valutare sia la vitalità che l'utilità, nonché per esaminare gli impatti dei mediatori esogeni della patobiologia epatica utilizzando saggi biochimici, istologia e qPCR. L'utilità sperimentale della coltura tissutale PCLS nei roditori e negli esseri umani è stata dimostrata in una vasta gamma di applicazioni, tra cui indagini sperimentali in microRNA¹⁵/RNA

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri Dish	GREINER	664160	Sterile Dish
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom	Greiner Bio-one	665180
70% Ethanol Solution (made with AR Grade)	Chem-Supply Pty Ltd	EA043-20L-P	Disinfection solution
Acetone	Chem-Supply Pty Ltd	AA008-2.5L
Cholic acid	Sigma-Aldrich	C1129-100G
Cyanoacrylate Super Glue	Parfix, DuluxGroup (Australia)		Other brands should work
Disposable Single Edge Safety Razor Blades	Mixed
Dissection Board	Made in-house		Sterile material over polystyrene
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.02
Forceps sharp point 130 mm long	ThermoFisher Scientific	MET2115-130
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	371
Glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	25030081
Glycocholic acid hydrate	Sigma-Aldrich	G2878-100G
ISOLATE II RNA Mini Kit	Bioline (Aust) Pty Ltd	BIO-52073
Ketamine 50 ml	Provet	KETAI1
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L	Sigma-Aldrich	K3753	Can also be made in house
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	ThermoFisher Scientific
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140-122
Picro Sirius Red	ABCAM Australia Pty Ltd	ab246832
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath	Interpath	24800
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath	Interpath	24300
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath	Interpath	24700
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath	Interpath	24500
Precellys Homogeniser	Bertin Instruments	P000669-PR240-A
Protractor	Generic		To measure blade angle
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block	Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific
Scalpel Blade	Mixed
Scalpel Blade Holder	Mixed
SensiFAST cDNA Synthesis Kit	Bioline (Aust) PTY LTD
Small Paintbrush with Plastic Handle	Mixed		Plastic handle resists ethanol
Square-Head Foreceps	Mixed
Sterile 50 ml Plastic Tubes	Corning Falcon	352098
Surgical Clamps	Mixed
Surgical Forceps	Mixed
Surgical Pins	Mixed
Surgical Scissors	Mixed
Taurochoic acid	Sigma-Aldrich	T-4009-5G
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice	World Precision Instruments	SYS-NVSLM1	With thermoelectric cooling
Williams Medium E	Life Technologies Australia Pty Ltd	12551032	2.0 g/l glucose
Xylazine 100 mg/mL 50 mL	Provet	XYLAZ4