Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

Abstract

I metodi di co-immunoprecipitazione sono spesso usati per studiare le interazioni proteina-proteina. La conferma delle interazioni proteina-proteina ipotizzate o l'identificazione di nuove possono fornire informazioni inestimabili sulla funzione di una proteina di interesse. Alcuni dei metodi tradizionali per la preparazione degli estratti richiedono spesso tecniche ad alta intensità di manodopera e dispendiose in termini di tempo. Qui, un protocollo di preparazione degli estratti modificato che utilizza un omogeneizzatore per mulini perline e perline metalliche è descritto come una rapida alternativa ai metodi tradizionali di preparazione delle proteine. Questo metodo di preparazione dell'estratto è compatibile con studi di co-immunoprecipitazione a valle. Ad esempio, il metodo è stato utilizzato per co-immunoprecipitato con successo C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e due interattori ALG-1 noti: AIN-1 e HRPK-1. Questo protocollo include descrizioni della raccolta dei campioni animali, della preparazione degli estratti, della chiarificazione dell'estratto e dell'immunoprecipitazione proteica. Il protocollo descritto può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o sovraespresse di C. elegans in una varietà di background genetici.

Introduzione

Identificare le interazioni macromolecolari di una proteina di interesse può essere la chiave per saperne di più sulla sua funzione. Gli esperimenti di immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione possono essere utilizzati per identificare l'intero interamome di una proteina attraverso approcci proteomici su^{larga scala 1} o per testare specificamente la capacità di una proteina di coprecipitate con un interagente ipotizzato. In C. elegans, entrambi i metodi sono stati utilizzati con successo per saperne di più sull'attività di una varietà di proteine, comprese quelle che funzionano strettamente con i microRNA per^{regolare l'espressione genica 2,3,4}. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno il vantaggio di testare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente cellulare nativo, ma la preparazione degli estratti può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. È necessaria un'analisi efficiente del campione, ma bisogna fare attenzione a ridurre al minimo l'interruzione delle interazioni proteina-proteina. Metodi come il douncing⁵, la sonicazione^6,l'omogeneizzazione balch⁷e l'omogeneizzazione delle perline di zirconia^{8,9 sono} stati utilizzati per preparare con successo gli estratti proteici totali di C. elegans. Questi metodi, ad eccezione dell'omogeneizzazione delle perline di zirconia, hanno limitazioni in termini di numero di campioni che possono essere elaborati contemporaneamente. Presentato è un metodo alternativo che può essere facilmente scalato per consentire una preparazione rapida ad alto contenuto di produzione e estratto proteico da campioni di C. elegans seguita da co-immunoprecipitazione. In particolare, il metodo può preparare fino a 24 campioni alla volta, riducendo notevolmente il tempo necessario per la preparazione dell'estratto. Al contrario, ad esempio, il douncing in genere consente una sola preparazione del campione alla volta. Questo metodo di estrazione può essere utilizzato per preparare estratti da qualsiasi stadio di sviluppo di C. elegans.

Descritto è una procedura dettagliata per la raccolta di campioni animali, la preparazione degli estratti, l'immunoprecipitazione e la presentazione dei dati western di soffiatura per confermare il successo del pulldown proteico e il rilevamento della proteina co-immunoprecipitante di interesse. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, sono stati eseguiti due esperimenti di co-immunoprecipitazione tra 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, un omologo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, un interagente ALG-1 appena identificato². ALG-1 e AIN-1 sono proteine fondamentali che comprendono il complesso silenziatore indotto da microRNA (miRISC) e l'interazione tra queste due proteine è^{ben consolidata 10,11}. Il protocollo di preparazione dell'estratto è stato efficace nell'esperimento di co-immunoprecipitazione ALG-1-AIN-1. Questo protocollo ha anche confermato con successo l'interazione tra ALG-1 e il suo interagentore appena identificato, HRPK-1².

In sintesi, il manoscritto descrive un protocollo di preparazione dell'estrazione di C. elegans che può essere scalato fino a elaborare simultaneamente 24 campioni insieme a un protocollo di co-immunoprecipitazione che può essere utilizzato per identificare nuove o confermare interazioni ipotizzate tra proteine. Il protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con una serie di esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazione^{proteica 2} e i pulldown di microRNA¹². Inoltre, il protocollo di immunoprecipitazione può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o C. elegans sovraespresse in una varietà di background genetici.

Protocollo

1. Raccolta di campioni di worm

1. Seme a stadio misto o^{sincronizzato 13} vermi su piastre solide NGM alla temperatura richiesta e consentire ai vermi di crescere fino allo stadio desiderato. Per la crescita e la manutenzione di base di C. elegans, si prega divedere Stiernagle et al.
2. Raccogliere i vermi in un tubo di centrifuga conica da 15 ml lavando le piastre del verme con tampone M9.
3. Pelletare i vermi centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti e scartare il supernatante.
   NOTA: La dimensione del pellet di verme per la preparazione dell'estratto è compresa tra 100 μL e 500 μL. Un pellet da 300 μL di vermi imballati è raccomandato per esperimenti di immunoprecipitazione a valle e in genere produce ~ 4,5 mg di proteine totali, mentre un pellet da 500 μL produrrà ~ 7,5 mg di proteine totali.
4. Eseguire ulteriori lavaggi da 3 a 5 con buffer M9 (vedere tabella 1) o fino a quando il supernatante non è più torbido.
5. Eseguire un lavaggio finale con ddH₂O.
6. Spostare il pellet di verme sciolto su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e girare verso il basso a 400 x g a RT per 2 min. Scartare il supernatante rimanente per ottenere un pellet di verme imballato e procedere all'estrazione della preparazione.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I pellet di verme possono essere immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C o in azoto liquido. Si prega di notare che i pellet di vermi possono essere scongelati una sola volta e non possono essere refrozen.

2. Estrarre la preparazione del pellet di verme

NOTA: La preparazione dell'estratto deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 °C.

1. Se congelato, scongelare il pellet di verme sul ghiaccio.
   NOTA: Se la dimensione del pellet di verme imballato desiderata di 300 μL non è stata ottenuta durante la raccolta del campione, è possibile formare più pellet più piccoli fino a quando non è presente materiale sufficiente per un'ulteriore estrazione.
2. Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi ghiacciato 2x (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 4 mM cloruro di magnesio, 10% glicerolo, 2 mM DTT con inibitore della RNasi, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi; vedi tabella 1) e vortice o pipetta su e giù per mescolare. Ruotare il tubo o i tubi verso il basso per raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo.
3. Spostare la miscela in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml contenente perline metalliche (vedi Tabella dei materiali)e mettere il campione nell'omogeneizzatore del mulino perline (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C. Assicurarsi che i tappi del tubo siano serrati e che i campioni siano bilanciati all'interno dell'omogeneizzatore.
4. Omogeneizzare il campione alla massima velocità (impostando 12) per 4 minuti.
5. Rimuovere il campione dalle perline e posizionarlo in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. In alternativa, un magnete fornito con l'omogeneizzatore può essere utilizzato per rimuovere le perline dal campione.
6. Spin verso il basso l'estratto a 19.000 x g per 20 min a 4 °C per chiarire l'estratto proteico.
7. Trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 ml sul ghiaccio, evitando il riporto del precipitato bianco e torbido che si forma sopra il campione. Il supernatante è ora l'estratto chiarito.
   NOTA: Salvare 10 μL dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione totale di proteine.
8. Utilizzare immediatamente l'estratto per i seguenti esperimenti o congelare l'estratto in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. Gli estratti possono essere conservati a temperatura ultra bassa (congelatore a -80 °C o azoto liquido per ~ 6 mesi). Gli estratti congelati possono essere scongelati una volta e non possono essere refrozen.
9. Determinare la concentrazione totale di proteine dell'estratto utilizzando un kit di dosaggio della concentrazione proteica compatibile con i detergenti (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.

3. Immunoprecipitazione

NOTA: Tutte le fasi di immunoprecipitazione per la preparazione dell'estratto devono essere eseguite sul ghiaccio o a 4 °C. Si raccomanda di utilizzare 2 mg di proteine totali per ogni immunoprecipitazione. Tuttavia, sono state eseguite immunoprecipitazioni di successo con 0,8-1 mg di proteine totali. Utilizzare sempre estratti proteici freschi o appena scongelati. Il seguente protocollo è delineato per eseguire l'immunoprecipitazione da 2 mg di proteine totali, o un singolo esperimento di immunoprecipitazione. La quantità di perline e anticorpi può essere aumentata o diminuita di conseguenza per più campioni o se viene utilizzata una diversa quantità di estratto proteico.

1. Posizionare o scongelare l'estratto proteico sul ghiaccio. Il campione può essere diluito a 10 mg/mL o a 5 mg/mL con tampone di lysis 1x ghiacciato (cfr. tabella 1).
2. Rimospendare le perline magnetiche per inversione e trasferire 150 μL della sospensione del 50% delle perline in un tubo da 1,5 ml. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per 1 minuto o fino a quando la soluzione non è chiara. Scartare il supernatante.
3. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e lavare le perline in un tampone di lisi 1x utilizzando 2 volumi (cioè 300 μL) di liquami di perline. Ripetere il lavaggio 2 volte per un totale di tre lavaggi.
4. Rimescolare le perline in 150 μL di tampone di lysis ghiacciato.
5. Trasferire 75 μL del liquame di perline a 2 mg di estratto proteico e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. Salvare la sospensione del tallone rimanente sul ghiaccio per un uso successivo.
   NOTA: Questo passaggio viene eseguito per ridurre il legame proteico non specifico alle perline durante la fase di immunoprecipitazione.
6. Posizionare il tubo con campione sul supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml; non disturbare le perline. Questo è il litorato proteico precleato. Risparmia il 10% del campione per l'analisi western delle macchie.
7. Aggiungere 20 μg di anticorpo purificato di affinità al lisato precleare e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione.
   NOTA: La quantità di anticorpi utilizzati per l'immunoprecipitazione è specifica dell'anticorpo e della proteina e deve essere determinata empiricamente per garantire un'immunoprecipitazione efficace della proteina bersaglio.
8. Aggiungere i restanti 75 μL della sospensione delle perline prelavate (fase 3.5) alla miscela anticorpo/lisato e incubare per 1 h a 4 °C con agitazione delicata.
9. Posizionare il tubo nel supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Salvare il supernatante per l'analisi western blot (facoltativo).
10. Lavare le perline contenenti l'immunoprecipitato 3x in 450 μL di tampone di lavaggio (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 2 mM di cloruro di magnesio, 10% di glicerolo, 1 mM DTT; cfr. tabella 1) sul ghiaccio.
    NOTA: Ulteriori lavaggi possono essere eseguiti se si preferisce condizioni di lavaggio più rigorose.
11. Rimossare il pellet di perline in 20 μL di tampone di carico del gel proteico SDS/BME (vedi Tabella dei materiali)e denaturare bollendo a 95 °C per 5 minuti prima di caricarlo su un gel SDS-PAGE. In alternativa, i campioni denaturati possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi.
    NOTA: Una porzione dell'immunoprecipitato di perline può essere salvata per l'isolamento dell'RNA a valle, se lo si desidera.

4. Rilevamento western di macchie di campioni IP

1. Caricare gli esempi IP nel gel SDS-PAGE (vedere Tabella dei materiali). Evitare di trasferire le perline posizionando i tubi IP sul supporto magnetico per 1 minuto prima dell'aspirazione del campione.
2. Eseguire l'assorbimento^{occidentale 15,16} e la colorazione degli^{anticorpi 16} con le seguenti modifiche: diluire l'anticorpo ALG-1¹⁷ 1:500 nel 5% di latte secco non grasso (NFDM); diluire l'anticorpo^{HRPK-1 2} 1:1,000 nel 5% NFDM; e diluire l'anticorpo^{AIN-1 18} 1:10.000 nel 5% di NFDM. Gli anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali)sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore.
3. Rilevare le bande con chemiluminescenza basata su HRP (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

Questo protocollo (schematizzato nella figura 1) è stato utilizzato con successo per ottenere estratti proteici totali di C. elegans (Figura 2) per l'immunoprecipitazione a valle di^{diverse proteine 2} (figura 3 e figura 4). Il protocollo di omogeneizzatore del mulino perline presentato era paragonabile, nell'estrazione totale delle proteine, ai metodi a base di dounce(figura 2)ed estratti in modo efficiente nucleare (COL-19::GFP(NLS)(figura 2)e proteine citoplasmatiche(figura 3 e figura 4). Più campioni di varie dimensioni sono stati estratti simultaneamente (Figura 2). Le proteine argonaute interagiscono con i membri della famiglia delle proteine GW182, formando i miRISC che si legano agli RRNA messaggero bersaglio e reprimeno la loro^{espressione 10}. La figura 3 mostra una co-immunoprecipitazione riuscita dei componenti miRISC centrali ALG-1 e AIN-1, coerente con le precedenti^{relazioni 11,17}. Più recentemente, sono stati compiuti sforzi per identificare ulteriori interattori proteici di Argonaute ALG-1 3 al fine di^saperne di più su come la biogenesi e l'attività del microRNA potrebbero essere regolate da fattori ausiliari. La proteina hrpk-1 legante l'RNA è stata identificata negli immunopreciti^{ALG-1 3}. Questa interazione è stata recentemente confermata in un esperimento di immunoprecipitazione HRPK-1^{reciproco 2}. I protocolli di estrazione e immunoprecipitazione presentati hanno recuperato con successo ALG-1 in co-immunopreciti specifici di HRPK-1 (Figura 4). Inoltre, l'interazione ALG-1-AIN-1 è stata testata in una varietà di background genetici e HRPK-1 si è dimostrato non necessario per l'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1² (Figura 3). Sono forniti dati supplementari per mostrare l'intera membrana sonanale(Figura supplementare 1).

Figura 1: Schema del flusso di lavoro per C. elegans estrarre la preparazione e l'immunoprecipitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Confronto western di una FPG localizzata nucleare, COL-19::GFP(NLS), livelli in campioni preparati a dounce e omogeneizzati da 250 μL e 100 μL di pellet di verme. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gw182 omologa AIN-1 co-immunopreciti con ALG-1. Western blotting per proteine ALG-1 e AIN-1 negli immunopreciti ALG-1. La co-immunoprecipitazione ALG-1/AIN-1 non è stata influenzata dall'assenza di hrpk-1. Ingresso = 10% di IP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Co-immunopreciti ALG-1 con HRPK-1. Viene mostrato l'gonfiore occidentale per HRPK-1 e ALG-1 negli immunopreciti HRPK-1. Ingresso = 10% di IP. * indica la catena pesante degli anticorpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

M9 buffer (1 L)
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
1 M MgSO4	1 mL
ddH2O	fino a 1 L
2x Tampone di lysis (5 mL)
HEPES (pH 7.4)	200 μL
2 M KCl	250 μL
10% TritonX	100 μL
1 M MgCl2	20 μL
Glicerolo al 100%	1 mL
ddH2O	fino a 5 mL
Aggiungi fresco:
1 M DTT	20 μL
Inibitore della proteasi senza EDTA	1 compressa
cocktail inibitore della fosfatasi 2	100 μL
cocktail inibitore della fosfatasi 3	100 μL
1x Buffer di lysis
Diluire il buffer di lysis 2x con un volume uguale di ddH20.
1x Tampone di lavaggio 10 mL)
HEPES (pH 7.4)	300 μL
2 M KCl	500 μL
10% TritonX	100 μL
1 M MgCl2	20 μL
Glicerolo al 100%	1 mL
ddH2O	fino a 10 mL
1 M DTT	20 μL (aggiungere fresco)

Tabella 1: Ricette

Figura supplementare 1. Vengono mostrate le membrane western blot a sondare completo utilizzate per generare figure 2-4. (A) Membrana sondata per la figura 2. Si noti che la membrana è stata tagliata per consentire il sondaggio simultaneo per GFP e Tubulina, riducendo le dimensioni complessive della macchia. (B) Membrana sondata per la figura 3. (C) Membrana sondata per la figura 3. *denota la catena pesante degli anticorpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

C. elegans è un ottimo modello per lo studio delle questioni fondamentali in biologia cellulare, molecolare e dello sviluppo¹⁹. Oltre al suo potere come sistema di modelli genetici, C. elegans è suscettibile di approcci biochimici, tra cui, a titolo considerato, immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione proteica. Un potenziale ostacolo quando si conducono esperimenti di immunoprecipitazione è la mancanza di anticorpi specifici per le proteine di interesse. Se non è disponibile alcun anticorpo, è possibile generare anticorpi policlonali o monoclonali personalizzati. Tuttavia, le recenti innovazioni nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso ai ricercatori di introdurre rapidamente mutazioni o taggare geni endogeni C. elegans ^20,21, facilitando studi che svelano le interazioni genetiche, funzionali e fisiche tra i geni e le proteine codificate. In particolare, l'etichettatura mediata da CRISPR/Cas9 dei geni C. elegans nei loci endogeni ha ridotto la dipendenza degli esperimenti di immunoprecipitazione dalla disponibilità di anticorpi, rendendo gli esperimenti di co-immunoprecipitazione molto più fattibili. I geni C. elegans possono essere taggati con una varietà di tag che vanno da tag fluorescenti come GFP o mCherry a piccoli tag come FLAG e HA. Gli anticorpi che riconoscono questi tag sono prontamente disponibili commercialmente, facilitando gli studi sulle interazioni proteina-proteina attraverso approcci di immunoprecipitazione.

Il protocollo presentato, descritto nella figura 1, può essere eseguito per un numero limitato di campioni o scalato, consentendo fino a 24 preparati campione alla volta. Mentre le caratterizzazioni iniziali delle interazioni proteina-proteina attraverso l'immunoprecipitazione sono tipicamente fatte in background di tipo selvatico in normali condizioni di crescita, gli studi di follow-up richiedono spesso di testare le interazioni proteina-proteina in una varietà di background genetici o in diverse condizioni di crescita. La capacità di preparare contemporaneamente più estrazioni consente di risparmiare tempo e, cosa importante, garantisce la coerenza della preparazione dell'estrazione tra i diversi campioni. È sempre necessario un controllo negativo, con il controllo ideale che è una mutazione nulla nella codifica genica per la proteina di interesse immunoprecipitata (vedi figura 3 e figura 4 per esempi).

Questo protocollo di estrazione consente una rapida preparazione dell'estratto proteico da campioni di C. elegans ed è paragonabile all'omogeneizzazione a base di perline di zirconio⁸. L'omogeneizzazione delle perline in generale può essere scalata fino a più preparati simultanei di campioni utilizzando una varietà di omogeneizzatori di mulini perline o apparecchiature simili. Tuttavia, alcuni omogeneizzatori più economici per mulini perline possono ridurre il numero di campioni che possono essere lavorati contemporaneamente. In alternativa, il protocollo di estrazione presentato è compatibile con la preparazione dell'estratto a base di dounce, che rappresenta un'alternativa economica. Mentre diversi omogeneizzatori di mulini di perline non sono stati testati, la maggior parte è probabile che sia compatibile con questo protocollo di estrazione proteica, purché si ottiene una completa interruzione dei campioni di C. elegans.

Come presentato, questo protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con più esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazione^{proteica 2} e il pull-down di microRNA^{12 e} consente la raccolta a valle di componenti di proteine e RNA. Estrae inoltre in modo efficiente proteine nucleari e citoplasmatiche (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Allo stesso modo, il protocollo di immunoprecipitazione presentato consente l'isolamento dell'RNA dagli immunopreciti associati alle proteine. Mentre il protocollo di immunoprecipitazione è stato originariamente sviluppato per identificare gli interattori proteici ALG-1, il metodo può essere adattato per testare le interazioni tra qualsiasi proteina di interesse. Infatti, le condizioni di immunoprecipitazione utilizzate hanno funzionato altrettanto bene per l'immunoprecipitazione di ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1(Figura 4). Questo protocollo è un ottimo punto di partenza per l'immunopurificazione delle proteine leganti l'RNA. Va notato, tuttavia, che alcuni cambiamenti nella composizione tampone possono essere necessari per altre proteine di interesse. I cambiamenti possono dipendere dalle proprietà fisiche e biochimiche della proteina di interesse e devono essere attuati caso per caso.

Una volta che la proteina bersaglio (qui, ALG-1 o HRPK-1) è immunoprecipitata, l'blotting occidentale può essere utilizzato per testare il co-immunoprecipitato per specifici interattori proteici.

In alternativa, l'immunoprecipitato copurato può essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa per identificare tutte le proteine putative interagenti. Le interazioni co-immunoprecipitazione confermate possono quindi essere esaminate in una varietà di background genetici o condizioni per identificare la potenziale regolazione dell'interazione specifica. Ad esempio, per determinare se hrpk-1 svolge un ruolo nell'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1, la coprecipitazione ALG-1-AIN-1 è stata valutata sia in uno sfondo di tipo selvaggio che in assenza di HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 è stato trovato dispensabile per l'interazione ALG-1/AIN-1² (Figura 3). Inoltre, la tecnologia di editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per generare mutazioni del singolo punto o del dominio nelle proteine di interesse. Ritestare la capacità dei mutanti generati di coprecipitate con i loro interattori proteici può rivelare quali domini o residui mediano l'interazione fisica. Tali studi futuri possono fornire informazioni preziose sul meccanismo della funzione e della regolazione delle proteine. Questi approcci, combinati con il potere della genetica C. elegans, possono fornire importanti intuizioni sui processi molecolari fondamentali che governano lo sviluppo animale e la funzione cellulare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tube	VWR	89039-664	STEP 1.2
2x Laemmli Sample Buffer	BioRed	1610737	STEP 3.11
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BioRed	4561096	STEP 4.1
anti-AIN-1 monoclonal antibody	custom generated	n/a	STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007
anti-ALG-1 monoclonal antibody	custom generated by PRF&L	n/a	STEP 4.2
anti-HRPK-1 monoclonal antibody	custom generated by PRF&L	n/a	STEP 4.2
Bullet Blender Storm Homogenizer	MidSci	BBY24M	STEP 2.3
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779-5G	Table 1
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation	Thermo Fisher	10002D	STEP 3.2
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D	STEP 3.2
EDTA-free protease inhibitors	Roche	11836170001	Table 1
GFP antibody (FL)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8334	Figure 2
Glycerol	Thermo Fisher	G33-500	Table 1
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP	BioRed	1662408	STEP 4.2
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	31470	STEP 4.2
HEPES	Sigma	H4034-500G	Table 1
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit	LI-COR	926-95000	STEP 4.3
Magnesium chloride hexahydrate ACS	VWR	VWRV0288-500G	Table 1
Magnesium Sulfate Anhydrous	Thermo Fisher	M65-500	Table 1
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	VWR	20170-333	STEP 1.6
N2 wild type	CGC
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)	MidSci	NAVYR1-RNA	STEP 2.3
Phosphatase inhibitor cocktail 2	Sigma	P5726-1ML	Table 1
Phosphatase inhibitor cocktail 3	Sigma	P0044-1ML	Table 1
Potassium Chloride	Thermo Fisher	P217-500	Table 1
Potassium phosphate monobasic	Thermo Fisher	P285-3	Table 1
RC DC Protein Assay Kit I	BioRed	5000121	STEP 2.9
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	10777019	Table 1
Sodium Chloride	Thermo Fisher	S271-500	Table 1
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Thermo Fisher	S374-500	Table 1
TritionX-100	Sigma	X100-500ML	Table 1
UY38 hrpk-1(zen17)	available upon request
VT1367 col-19::gfp(maIS105)	available upon request
VT3841 alg-1(tm492)	available upon request