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Resumen

Esta metodología tiene como objetivo evaluar la citotoxicidad de biomateriales a través de la preparación de extractos solubles, utilizando ensayos de viabilidad y análisis fenotípicos, incluyendo citometría de flujo, RT-PCR, inmunocitoquímica y otras técnicas de biología celular y molecular.

Resumen

Los biomateriales entran en contacto directo o indirecto con los tejidos humanos, por lo que es importante evaluar su citotoxicidad. Esta evaluación puede realizarse por varios métodos, pero existe una alta discrepancia entre los enfoques utilizados, comprometiendo la reproducibilidad y la comparación entre los resultados obtenidos. En este trabajo, proponemos un protocolo para evaluar la citotoxicidad de los biomateriales utilizando extractos solubles, que utilizamos para biomateriales dentales. Se detalla la preparación de los extractos, desde la producción de pellets hasta su extracción en un medio de cultivo. La evaluación de la citotoxicidad de los biomateriales se basa en la actividad metabólica mediante el ensayo MTT, la viabilidad celular mediante el ensayo de sulforodamina B (SBR), el perfil de muerte celular mediante citometría de flujo y la morfología celular mediante May-Grünwald Giemsa. Además de la evaluación de citotoxicidad, se describe un protocolo para evaluar la función celular basado en la expresión de marcadores específicos evaluados por inmunocitoquímica y PCR. Este protocolo proporciona una guía completa para la evaluación de la citotoxicidad de los biomateriales y los efectos celulares, utilizando la metodología de extractos, de una manera reproducible y robusta.

Introducción

La biocompatibilidad puede definirse como la capacidad de un material para integrar tejido e inducir una respuesta terapéutica favorable, libre de daños locales y sistémicos 1,2,3. La evaluación de la biocompatibilidad es crucial para el desarrollo de cualquier material destinado a uso médico. Por lo tanto, este protocolo proporciona un enfoque sistemático e integral para cada investigador que desee desarrollar nuevos biomateriales o estudiar nuevas aplicaciones para biomateriales existentes.

Las pruebas de citotoxicidad in vitro se utilizan ampliamente como primera fase para la evaluación de la biocompatibilidad, utilizando cultivos celulares primarios o líneas celulares. Los resultados constituyen un primer indicador de potencial aplicación clínica. Además de ser vital para el desarrollo de biomateriales, estas pruebas son obligatorias para cumplir con las regulaciones vigentes para la introducción en el mercado, de los reguladores de la UE y la EUA (certificación FDA y CE)4,5,6,7,8. Además, las pruebas estandarizadas en la investigación biomédica proporcionan una ventaja significativa en términos de reproducibilidad y comparación de resultados de diferentes estudios sobre biomateriales o dispositivos similares9.

Las directrices de la Organización Internacional de Normalización (ISO) son ampliamente utilizadas por múltiples laboratorios comerciales, reguladores y académicos independientes para probar materiales de manera precisa y reproducible. La ISO 10993-5 se refiere a la evaluación de citotoxicidad in vitro y la ISO 10993-12 informa a la preparación de muestreo10,11. Para las pruebas de biomateriales se proporcionan tres categorías, que se seleccionarán de acuerdo con el tipo de material, los tejidos en contacto y el objetivo del tratamiento: extractos, contacto directo y contacto indirecto 8,11,12,13. Los extractos se obtienen enriqueciendo un medio de cultivo celular con el biomaterial. Para las pruebas de contacto directo, el biomaterial se coloca directamente sobre los cultivos celulares y, en contacto indirecto, la incubación con las células se realiza separada por una barrera, como un gel de agarosa11. Los controles apropiados son obligatorios, y se debe realizar un mínimo de tres experimentos independientes 5,8,10,11,14.

Es fundamental simular o exagerar las condiciones clínicas para determinar el potencial citotóxico. En el caso de las pruebas de extractos, el área de superficie del material;  el volumen medio; el medio y el pH del material; la solubilidad del material, la osmolaridad y la relación de difusión; y las condiciones de extracción como agitación, temperatura y tiempo influyen en los medios de enriquecimiento5.

La metodología permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la citotoxicidad de varias formulaciones farmacéuticas, tanto sólidas como líquidas. Se pueden realizar varios ensayos, como la prueba de captación de rojo neutro, la prueba de formación de colonias, el ensayo MTT y el ensayo XTT 5,10,14.

La mayoría de los estudios de evaluación de citotoxicidad publicados utilizan ensayos más simples, a saber, MTT y XTT, que proporcionan información limitada. La evaluación de la biocompatibilidad no sólo debe implicar la evaluación de la citotoxicidad, sino también la bioactividad de un material de ensayo determinado2, como lo respalda este protocolo. Deben utilizarse criterios de evaluación adicionales cuando estén justificados y documentados. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía completa, detallando un conjunto de métodos para la evaluación de la citotoxicidad de biomateriales. Además, se describe la evaluación de diferentes procesos celulares, a saber, el tipo de muerte celular, la morfología celular, la función celular en la síntesis de proteínas específicas y la producción de tejidos específicos.

Protocolo

1. Preparación de pellets

  1. Prepare los moldes de cloruro de polivinilo (PVC) realizando orificios de forma circular de dimensiones conocidas en placas de PVC.
    NOTA: Las molduras de PVC se pueden hacer de diferentes tamaños. Calcule la superficie de contacto de los moldes de PVC, utilizando la fórmula A = h (2πr) + 2πr2 (r: radio del cilindro; h: altura del cilindro).
  2. Prepare el biomaterial que se probará de acuerdo con las instrucciones del fabricante y lo más cerca posible del comienzo del experimento.
    NOTA: Para la preparación de biomateriales de formulación de pasta/pasta, una cantidad adecuada de pasta base y catalizador se mezclan manualmente con una espátula de mezcla. Para otros materiales basados en formulaciones líquidas y en polvo, se debe realizar la espatulación manual o la mezcla mecánica con vibración, siguiendo las instrucciones del fabricante o las adecuadas para nuevos materiales. Para materiales líquidos, este paso no es necesario. Inicie el protocolo en el paso 2.
  3. Coloque el biomaterial sobre los moldes con una espátula y déjelos reposar durante el tiempo adecuado.
    NOTA: El tiempo de fraguado y las condiciones de ajuste de los biomateriales deben seguir las instrucciones del fabricante o las adecuadas para nuevos materiales.
  4. Después del fraguado, retire los gránulos de biomaterial de los moldes de PVC y colóquelos en un recipiente (se puede usar una placa de 6 pocillos o una placa de Petri).
  5. Esterilice los gránulos colocándolos bajo una lámpara de luz ultravioleta (UV) durante 20 minutos para cada lado.

2. Obtención de los extractos de biomateriales

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse bajo estrictas condiciones estériles.

  1. Determinar el número necesario de pellets calculando la superficie del pellet basándose en la fórmula descrita en el punto 1.1.
    NOTA: Como valor de referencia, la superficie de contacto de 250 mm2/mL11,15 se consigue añadiendo 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) por ml del medio.
  2. Preparar los extractos solubles (extracto enriquecido con el biomaterial).
    1. Colocar los pellets en un tubo de 50 mL y añadir el correspondiente del medio de cultivo celular. Colocar los tubos durante 24 horas en la incubadora a 37°, en rotación constante.
      NOTA: Utilice el medio de cultivo celular apropiado para los cultivos celulares.
    2. Después de 24 horas, retire los tubos de la incubadora. En este punto, los extractos corresponden a una concentración de 1/1 o 100%.
    3. Realizar diluciones del extracto mediante la adición secuencial de volúmenes iguales de medio acondicionado al medio de cultivo celular.
      NOTA: No se debe realizar ningún ajuste de pH en el medio.
      1. Agregue 1 ml de medios de cultivo a 1 ml de extracto 100% para obtener un extracto al 50%. Agregue 1 ml de medios de cultivo a 1 ml de extracto al 50% para obtener un extracto al 25%, y así sucesivamente (Figura 1).
        NOTA: Utilice las concentraciones que se consideren relevantes para cada compuesto.

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Figura 1: Esquema de preparación y diluciones de extractos solubles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Incubación celular con extractos de biomateriales

  1. Prepare una suspensión celular y colóquela en un recipiente de celda adecuado, como una placa de múltiples pocillos, de acuerdo con el número de células necesarias para los experimentos.
    1. Comience con un matraz de las células deseadas con 80% a 90% de confluencia.
    2. Deseche los medios de cultivo celular, lave con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y separe las células con tripsina-EDTA (1 a 2 ml para un matraz de cultivo celular de 75 cm2 ).
    3. Añadir el medio de cultivo celular (2 a 4 ml para un matraz de cultivo celular de 75 cm2 ), transferir la suspensión celular a un tubo y centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    4. Suspender el pellet en un volumen conocido de medios de cultivo celular.
      NOTA: Este protocolo está diseñado para el uso de cultivos celulares adherentes; Sin embargo, se pueden hacer adaptaciones simples para trabajar con cultivos celulares en suspensión.
    5. Cuente las células en el hemocitómetro y calcule la concentración celular de la suspensión celular.
    6. Suspender la cantidad determinada de suspensión celular en medio de cultivo y transferir a placas multipocillos. Como valor de referencia para la densidad de siembra, considere 5 – 20 x 105 celdas/cm2.
      NOTA: El número apropiado de celdas debe calcularse de acuerdo con el tipo de celda y las características de la celda, es decir, el tiempo de duplicación de la celda.
  2. Incubar las células durante 24 horas para permitir la adhesión celular.
  3. Después de este período, administrar los extractos solubles en las placas de cultivo.
    1. Aspirar el medio de cultivo celular.
    2. Añadir los extractos de los biomateriales a cada pocillo, según la secuencia de concentraciones, como se ha descrito anteriormente. Agregue un medio de cultivo celular fresco a los pocillos de control.
    3. Incubar las placas durante 24 h o más.
      NOTA: Se deben realizar controles negativos en cada ensayo, correspondientes a células no tratadas, mantenidas en el medio de cultivo. Los tiempos de incubación se pueden seleccionar de acuerdo con los objetivos del estudio.

4. Evaluación de la actividad metabólica

  1. Después de la incubación celular con los extractos de los biomateriales, aspirar el medio de las placas y lavar cada PBS de pozo.
  2. Colocar, en cada pocillo, el volumen adecuado de 0,5 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol (MTT) preparado en PBS, pH 7.4.
  3. Incubar las placas durante 4 h o durante la noche en la oscuridad a 37 ° C.
  4. Para solubilizar los cristales de formazán obtenidos, añadir el volumen adecuado de solución 0,04 M de ácido clorhídrico en isopropanol a cada pocillo y agitar las placas durante 30 minutos.
    NOTA: Ajuste la cantidad de MTT e isopropanol de acuerdo con el tamaño de los pocillos.
  5. Revuelva y homogeneice el contenido de cada pocillo, si es necesario, pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que no se vean cristales.
  6. Cuantificar la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm con un filtro de referencia de 620 nm, en el espectrofotómetro.
  7. Para calcular la actividad metabólica, divida la absorbancia de las células tratadas por la absorbancia de los cultivos de control. Para obtener valores porcentuales multiplicar por 100.

5. Evaluación de la muerte celular

NOTA: Para realizar esta evaluación se debe utilizar un mínimo de 10a 6 celdas por condición.

  1. Utilizar tubos centrífugos debidamente identificados, de acuerdo con las condiciones que se evalúan.
  2. Después de la incubación celular con los extractos de los biomateriales, recolectar los medios de cultivo en el tubo respectivo.
  3. Separe las celdas y agregue la suspensión celular a los tubos respectivos.
  4. Concentrar las suspensiones celulares por centrifugación a 120 x g durante 5 minutos.
  5. Lave los pellets con PBS. Retire el PBS por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos.
  6. Agregue 1 ml de PBS y transfiera los gránulos celulares a los tubos de citometría identificados.
  7. Retire el PBS por centrifugación a 1.000 x g durante 5 minutos.
  8. Incubar con 100 μL de tampón de unión (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl y 0,25 mM CaCl2)16, y dejar que las células reposen durante unos 15 minutos para la recuperación de la membrana celular.
  9. Añadir 2,5 μL de anexina-V marcada con fluorescencia y 1 μL de yoduro de propidio durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  10. Después de la incubación, agregue 400 μL de PBS y analice en el citómetro. Para el análisis y cuantificación de la información se utiliza el software adecuado.
  11. Presentar los resultados como porcentaje de células vivas, apoptosis, apoptosis/necrosis tardía y necrosis.

6. Evaluación morfológica

  1. Seleccione el tamaño apropiado de cubreobjetos de vidrio esterilizados que encajen dentro de la placa multipocillo.
  2. Coloque cada portaobjetos en un pozo con pinzas estériles.
  3. Distribuir una suspensión celular a una concentración adecuada en los pocillos y dejar pasar la noche en una incubadora a 37 °C en atmósfera humidificada con 95% de aire y 5% deCO2.
  4. Exponga los cultivos celulares a los extractos, como se describió anteriormente.
  5. Aspirar el medio y lavar con PBS.
  6. Deje secar los cubreobjetos a temperatura ambiente y, a continuación, añada un volumen suficiente de solución de May-Grünwald para cubrir los cubreobjetos; Incubar durante 3 minutos.
  7. Retire el tinte y lave con agua destilada durante 1 minuto.
  8. Retire el agua y añada un volumen suficiente de solución Giemsa para cubrir los cubreobjetos; Incubar durante 15 minutos.
  9. Lave los cubreobjetos con agua corriente.
  10. Transfiera los cubreobjetos a una corredera.
  11. Mire bajo un microscopio. Toma las fotografías con el aumento elegido.

7. Evaluación de la función celular mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)

NOTA: Para realizar esta evaluación se debe utilizar un mínimo de 2x106 celdas por condición. Como ejemplo, la fosfatasa alcalina se presenta como un gen de interés para la evaluación de la actividad de los odontoblastos. Otros genes de interés se pueden ver en la Tabla 1.

  1. Coloque las celdas como se describió anteriormente.
    NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración de células plateadas, de acuerdo con el tipo de célula y la citotoxicidad de los biomateriales que se están estudiando.
  2. Incubar con extractos solubles, como se describió anteriormente.
  3. Separe las celdas para obtener una suspensión como se describió anteriormente.
  4. Lave las células dos veces con PBS; Para ello centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  5. Lise las células suspendiendo el pellet en 1 ml de solución de purificación de ARN (por ejemplo, NZYol), agitación intensa y pipeteo sucesivo.
  6. Incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  7. Añadir 200 μL de cloroformo y agitar los tubos a mano durante 15 segundos.
  8. Incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  9. La centrífuga lisa a 4 ° C durante 15 min a 12,000 x g. Durante esta centrifugación, dos fases se originan en la muestra, dejando el ARN en la fase acuosa (superior).
  10. Retire la fase acuosa a un nuevo tubo y agregue 500 μL de isopropanol frío para precipitar el ARN.
  11. Incubar muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC.
  12. Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de etanol al 75% por centrifugación a 7.500 x g durante 5 minutos a 4ºC.
  13. Seque el pellet a temperatura ambiente hasta que el etanol se evapore.
  14. Suspender en agua libre de RNasa.
  15. Cuantificar y determinar el grado de pureza de las muestras mediante espectrofotometría de absorción, en las longitudes de onda 260 nm y 280 nm. Determine la pureza del ARN y utilice muestras con una relación de pureza (A260/280) de alrededor de 2,0.
  16. Almacenar las muestras a -80 ° C.
  17. Proceder a realizar RT-PCR siguiendo el protocolodel fabricante 17.
    NOTA: De acuerdo con el objetivo del estudio, seleccione los marcadores específicos que se evaluarán.

8. Evaluación de la función celular a través de la identificación de proteínas

NOTA: De acuerdo con el objetivo del estudio, seleccione las proteínas específicas a evaluar. Como ejemplo, la sialoproteína de dentina (DSP) se presenta como una proteína de interés para la evaluación de la actividad de los odontoblastos. Otras proteínas de interés se pueden ver en la Tabla 1.

  1. Cultivar células en cubreobjetos y exponerlas a los extractos, como se describió anteriormente.
  2. Lave los cultivos celulares con PBS.
  3. Fijar con paraformaldehído al 3,7% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Lavar dos veces con PBS.
  5. Permeabilizar con Tritón al 0,5% en PBS durante 15 minutos.
  6. Bloquee la peroxidasa con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS durante 5 minutos.
  7. Lavar dos veces con PBS.
  8. Lavar dos veces con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.
  9. Bloquear cultivos celulares con BSA al 2% durante 45 minutos.
  10. Lavar con BSA al 0,5% en PBS.
  11. Incubar cultivos con el anticuerpo primario de acuerdo con la proteína seleccionada durante 60 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Este protocolo utiliza el anticuerpo primario DSP (M20) Anticuerpo (1:100) y el anticuerpo secundario Policlonal Conejo Anti-cabras inmunoglobulinas/HRP (1:100).
  12. Lave cinco veces con BSA al 0.5% en PBS.
  13. Incubar con anticuerpos secundarios durante 90 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Haga las diluciones de anticuerpos usando BSA al 0.5% en PBS.
  14. Lave cinco veces con BSA al 0.5% en PBS durante 1 minuto en cada lavado.
  15. Incubar cultivos con una mezcla de sustrato y cromógeno a una concentración de 20 μL de sustrato cromogenado/ml durante 25 minutos.
  16. Lavar dos veces con BSA al 0,5% en PBS.
  17. Contratinción con hematoxilina durante 15 minutos.
  18. Lavar con una secuencia de 0,037 mol/L de amoníaco y agua destilada durante 5 minutos para eliminar el exceso de tinte.
  19. Monte los cubreobjetos en las diapositivas. Utilice glicerol como medio de montaje.
  20. Dejar secar durante la noche.
  21. Mire bajo un microscopio. Toma las fotografías con el aumento elegido.

9. Evaluación de mineralización mediante el ensayo Alizarin Red S

  1. Preparar una solución de Alizarin Red S a una concentración de 40 mM18. Revuelva la solución para homogeneizar durante 12 horas en la oscuridad.
    NOTA: Para preparar 100 ml de solución de Alizarin Red S, solubilice 1,44 g de alizarina en polvo (Peso molecular: 360 g/mol) en agua ultrapura, protegida de la luz. Para esta solución, el valor de pH es crítico y debe estar entre 4.1 y 4.3.
  2. Incubar el cultivo celular con extractos solubles, como se describió anteriormente.
  3. Lave los cultivos celulares tres veces con PBS.
  4. Fijar con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  5. Lavar tres veces con PBS.
  6. Tinción con Alizarin Red Staining solution durante 20 minutos a 37 °C en la oscuridad.
  7. Después de la tinción, lave las placas con PBS para eliminar el exceso de tinte.
  8. Mire bajo un microscopio. Toma las fotografías con el aumento elegido.
  9. Agregue una solución de extracción, compuesta por 10% (p/v) de ácido acético y 20% (p/v) de metanol, a cada pocillo y deje remover durante 40 minutos a temperatura ambiente.
  10. Mida la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm en un espectrofotómetro19.

Resultados

Los resultados representativos aquí se refieren al estudio de los biomateriales dentales. La metodología del extracto permite obtener un perfil de citotoxicidad y función celular después de la exposición a los materiales dentales, en cuanto a los efectos sobre la actividad metabólica (Figura 2), la viabilidad celular, el perfil de muerte celular y la morfología celular (Figura 3), y la expresión de proteínas específicas (Figura 4)....

Discusión

Este protocolo fue diseñado teniendo en cuenta la norma ISO 10993-5, que se refiere a la evaluación de la citotoxicidad in vitro de los biomateriales que entran en contacto con los tejidos, para evaluar la biocompatibilidad y contribuir a los estudios de reproducibilidad21. Esta es una preocupación creciente en la ciencia, y muchos autores ya están siguiendo estas recomendaciones en el diseño experimental de sus estudios in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28.<...

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo de GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB está financiado por Fondos Nacionales a través de FCT (Fundación para la Ciencia y la Tecnología) a través del Proyecto Estratégico UIDB/04539/2020 y UIDP/04539/2020 (CIBB). Agradecemos a Jacques Nör, de la Facultad de Odontología de la Universidad de Michigan, por proporcionar la línea celular MDPC-23.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibodySanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Antibiotic antimycotic solutionSigmaA5955
BCA assayThermo Scientific23225Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albuminSigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
CD133 antibodyMiteny Biotec293C3-APCAllophycocyanin (APC)
CD24 antibodyBD Biosciences658331Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibodyBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Cell strainerBD Falcon35234040 µM
Collagenase, type IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + ChromogenDakoK3468
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factorSigmaE9644
Hepes 0.01 MSigmaMFCD00006158
Fibroblast growth factor basicSigmaF0291
Giemsa Stain, modified GS-500SigmaMFCD00081642
GlycerolDakoC0563
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium SolutionGibco41400045
May-Grünwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22Human mammary adenocarcinoma cell line
MethylcelluloseAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100DakoG-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylateSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acidJMSEINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfateSigma436143
Substrate BufferDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan blueSigmaT8154
Trypsin-EDTASigmaT4049
β-actin antibodySigmaA5316

Referencias

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