Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Riepilogo

Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Abstract

Esperimenti classici di biologia rigenerativa della salamandra nel corso dell'ultimo secolo hanno da tempo stabilito che l'epidermide della ferita è una struttura di segnalazione cruciale che si forma rapidamente dopo l'amputazione ed è necessaria per la rigenerazione degli arti. Tuttavia, i metodi per studiare la sua precisa funzione a livello molecolare negli ultimi decenni sono stati limitati a causa della scarsità di tecniche funzionali precise e informazioni genomiche disponibili nei sistemi modello di salamandra. È eccitante, la recente pletora di tecnologie di sequenziamento accoppiata con il rilascio di vari genomi di salamandra e l'avvento di metodi di test genetici funzionali, tra cui CRISPR, consente di rivisitare questi esperimenti fondamentali a una risoluzione molecolare senza precedenti. Qui, descrivo come eseguire la chirurgia del lembo di pelle piena (FSF) sviluppata classicamente negli axolotl adulti al fine di inibire la formazione dell'epidermide della ferita immediatamente dopo l'amputazione. L'epidermide della ferita si forma normalmente attraverso la migrazione distale delle cellule epiteliali nella pelle prossimale al piano di amputazione per sigillare la ferita dall'ambiente esterno. L'intervento comporta la sutura immediata della pelle a tutto spessore (che comprende sia gli strati epidermico che dermica) sul piano di amputazione per ostacolare la migrazione delle cellule epiteliali e il contatto con i tessuti mesenchimali danneggiati sottostanti. Gli interventi chirurgici di successo provocano l'inibizione della formazione di blastema e la rigenerazione degli arti. Combinando questo metodo chirurgico con le analisi molecolari e funzionali a valle contemporanee, i ricercatori possono iniziare a scoprire le basi molecolari della funzione dell'epidermide della ferita e della biologia durante la rigenerazione degli arti.

Introduzione

Da quando Lazzaro Spallanzani lo riportò nel 17681, la rigenerazione degli arti della salamandra è stato uno dei fenomeni rigenerativi naturali più studiati che ha innamorato i biologi per secoli. Il successo della rigenerazione degli arti dipende dalla formazione, dalla crescita e dal successivo pattern di una struttura cellulare indifferenziata nota come blastema. I ricercatori hanno fatto passi da gigante nella comprensione della composizione cellulare del blastema e di quali tessuti e tipi cellulari di supporto sono necessari per la sua formazione2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tuttavia, i meccanismi di segnalazione coordinati tra diversi tessuti e tipi di cellule che portano all'inizio della formazione di blastema rimangono poco compresi.

Un requisito chiave per il successo della formazione e della rigenerazione del blastema è l'epidermide della ferita, un epitelio transitorio e specializzato che copre il piano di amputazione entro 12 ore dopo l'amputazione10. Dopo l'amputazione, le cellule epiteliali dalla pelle intatta prossimale alla lesione migrano rapidamente sul piano di amputazione per formare un sottile epitelio della ^ferita14. Quando il blastema si forma nelle settimane successive, l'epidermide della ferita precoce si sviluppa in una struttura di segnalazione epiteliale più spessa chiamata cappuccio epiteliale apicale (AEC)¹⁵. Mentre la normale pelle a tutto spessore contiene sia uno strato epiteliale che uno strato dermico separati da una lamina basale, l'epidermide/AEC della ferita è costituita solo da uno strato epiteliale e manca di una lamina ^basale16,17. L'assenza della lamina basale e del derma consente il contatto diretto tra le cellule epiteliali della ferita e i tessuti sottostanti, il che facilita la segnalazione bidirezionale tra i due compartimenti che è fondamentale sia per la formazione che per il mantenimento del ^{blastema17,18}.

Studi sperimentali classici hanno ideato vari metodi chirurgici innovativi per sondare la funzione e la necessità dell'epidermide della ferita / AEC inibendo la sua formazione. Questi metodi includevano la ^sutura19 o l'innesto di pelle a tutto ^{spessore20,21} sul piano di amputazione, la sutura immediata dell'arto amputato nella cavità ^corporea22 e la continua rimozione giornaliera o irradiazione dell'epidermide precoce della ferita e ^AEC23,24. Complessivamente, questi esperimenti non solo hanno stabilito l'importanza dell'epidermide della ferita / AEC, ma hanno anche ulteriormente determinato i suoi ruoli nell'istolisi tissutale precoce, oltre a mantenere la proliferazione delle cellule progenitrici e la crescita ^blastemica13 durante la rigenerazione.

Tuttavia, questi studi precedenti erano in gran parte limitati alla colorazione istologica e agli impulsi triziati di timidina per tracciare la proliferazione cellulare. In effetti, la rivisitazione di questi esperimenti classici con le moderne tecnologie di sequenziamento e tecniche funzionali nelle salamandre è stata fatta solo di recente e ha portato alla scoperta di ruoli aggiuntivi per l'epidermide della ferita nella modulazione dell'infiammazione e della degradazione / deposizione di ECM durante le prime fasi della ^{rigenerazione25}. Con il rilascio di varie sequenze del genoma e del trascrittoma della salamandra26,27,28,29,30,31,32,33,34, nonché il crescente numero di metodi funzionali disponibili nelle specie di salamandra11,35,36,37,38 , i ricercatori sono ora ben posizionati per iniziare a svelare i meccanismi molecolari che guidano la formazione, la funzione e lo sviluppo dell'AEC dell'epidermide della ferita.

Sfortunatamente, molti di questi metodi classici utilizzati per inibire la formazione dell'epidermide della ferita sono tecnicamente impegnativi, presentando difficoltà di riproducibilità tra le repliche biologiche nello stesso esperimento. Ad esempio, il mantenimento degli innesti cutanei può essere difficile in quanto gli innesti possono eventualmente cadere dall'arto ospite e la rimozione dell'epidermide della ferita / AEC ogni giorno è difficile senza danneggiare i tessuti sottostanti. Inoltre, la sutura dell'arto amputato nella cavità corporea è impegnativa e richiede anche ulteriori lesioni nel sito di inserimento. D'altra parte, la sutura della pelle a tutto spessore immediatamente sul piano di amputazione è relativamente semplice, tecnicamente riproducibile e introduce danni tissutali minimi. Questo metodo chirurgico a lembo di pelle piena (FSF) è stato precedentemente sviluppato da Anthony Mescher nel 1976 nei tritoni adulti (Notophthalmus viridiscens). Ha dimostrato che la chirurgia FSF ha inibito la formazione e la funzione dell'epidermide della ferita proibendo sia la migrazione delle cellule epiteliali sul piano di amputazione sia il contatto diretto tra le cellule epiteliali e i tessuti sottostanti.

Qui, questa procedura chirurgica viene mostrata passo dopo passo usando l'arto axolotl. Accoppiata con le moderne tecnologie molecolari e di sequenziamento, questa tecnica può rivelarsi molto utile per i ricercatori per approfondire la nostra comprensione della formazione e della funzione dell'epidermide della ferita / AEC durante la rigenerazione degli arti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida IACUC (Protocollo #: 11-32) e AAALAC presso l'Università di Harvard.

1. Preparazione di soluzioni e configurazione per l'anestesia e il recupero

1. Preparare una soluzione fresca di tricaina allo 0,1% per l'anestesia e una soluzione di sale sodico allo 0,5% di sulfamerazina per il recupero. Rendere le soluzioni con acqua adatta per l'allevamento ^axolotl37 secondo i protocolli IACUC approvati presso l'istituto di ricerca competente (soluzione di Holtfreter modificata, ad esempio). Assicurarsi che le soluzioni siano ben miscelate e che sia preparato un volume sufficiente per immergere l'intero axolotl.
   1. Per preparare la soluzione di tricaina allo 0,1%, mescolare 1 g di tricaina e 1 g di bicarbonato di sodio con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta.
   2. Per preparare la soluzione di sale sodico di sulfamerazina allo 0,5%, mescolare 5 g di sale sodico di sulfamerazina con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta. La soluzione di sulfamerazina è un antibiotico che previene l'infezione batterica durante il recupero chirurgico.
2. Disinfettare l'area chirurgica spruzzandola con Clidox-S o etanolo al 70%. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze, forbici per sezionare, forbici a molla) mediante autoclave. Se si eseguono più interventi chirurgici, assicurarsi di sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a perline calde tra gli animali.
3. Per impostare l'area di recupero, posizionare una capsula di Petri da 15 cm o qualsiasi contenitore che si adatti all'axolotl sopra un secchio pieno di ghiaccio bagnato. Riempire la capsula di Petri con un basso livello di soluzione di sale sodico allo 0,5%, abbastanza tale che l'axolotl non sarebbe completamente sommerso. Il recupero sul ghiaccio post-operatorio rallenterà il movimento dell'animale mentre si risveglia dall'anestesia, consentendo all'area suturata di guarire relativamente indisturbata.
   NOTA: questa configurazione può essere personalizzata dai ricercatori a seconda dei materiali che hanno a disposizione.

2. Esecuzione della procedura chirurgica del lembo della pelle completa

1. Anestetizzare l'axolotl immergendolo in un contenitore di soluzione di tricaina allo 0,1%. Questo richiederà circa 15-20 minuti. Assicurarsi che l'axolotl sia effettivamente completamente anestetizzato eseguendo un pizzico di coda. Se non c'è risposta dall'axolotl, procedere con l'intervento chirurgico.
   NOTA: Utilizzare axolotl più vecchi e più grandi per questo intervento chirurgico (almeno 15 cm di dimensione). Assicurarsi che l'axolotl rimanga ben idratato durante l'intervento chirurgico bagnando periodicamente la pelle con acqua del sistema axolotl usando una pipetta di plastica. Assicurarsi di preparare asetticamente il sito chirurgico irrigando l'area con PBS sterile prima dell'intervento chirurgico. L'animale deve anche essere posto su un drappo chirurgico sterile per la procedura.
2. Eseguire un'amputazione dell'arto all'estremità distale degli elementi scheletrici zeugopodiali utilizzando le forbici di dissezione (Figura 1.1).
3. Usando le forbici a molla, fare una piccola incisione (circa 2 mm) sulla porzione ventrale della pelle (Figura 1.2).
4. Usando la pinza, staccare con cura la pelle approssimativamente sulla linea mediana degli elementi scheletrici zeugopodiali, esponendo i tessuti degli arti sottostanti (muscoli, ossa, ecc.) (Figura 1.3). Assicurati di non danneggiare la pelle. Vedere la nota dopo il passaggio 2.8.
5. Amputare i tessuti degli arti sottostanti esposti sulla linea mediana dello zeugopode usando forbici chirurgiche (Figura 1.4).
6. Spingere indietro il tessuto muscolare con le forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto.
   NOTA: Questo è necessario per garantire una migliore guarigione e anche per aumentare il successo dell'intervento chirurgico in quanto l'osso sporgente può essere frastagliato contro il lembo suturato e interrompere l'integrità di un lembo di pelle intatto in seguito.
7. Utilizzando la pinza, tirare con attenzione la pelle extra a tutto spessore sul piano di amputazione per coprire i tessuti sottostanti esposti e suturare in posizione collegandosi con la pelle ventrale a tutto spessore (Figura 1.5).
8. Suturare i restanti lati destro e sinistro del lembo della pelle nelle porzioni ventrali sottostanti della pelle intatta. Questo può essere fatto suturando i lati del lembo in modo "incrociato" (consigliato) (Figura 1.6-1.9), o semplicemente suturando direttamente nella pelle ventrale. Utilizzare la pinza e le forbici a molla curve per la sutura. Assicurarsi che non si vedano tessuti sottostanti esposti e che le suture siano legate strettamente (annodate almeno tre volte).
   NOTA: è fondamentale che la pelle intatta non sia danneggiata nei passaggi 2.4, 2.7-2.8. Abbiamo scoperto che il danno alla pelle a tutto spessore è stato correlato con interventi chirurgici non riusciti, poiché le aree di danno possono ancora formare una piccola ferita epidermide. Se possibile, prova a utilizzare un paio di pinze più opache quando consegni il lembo della pelle a tutto spessore.
9. Eseguire un'amputazione sull'arto controlaterale (controllo animale interno opzionale) amputandolo a livello medio zeugopode con forbici chirurgiche. Spingere indietro il tessuto muscolare con forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto.
   NOTA: Un controllo interno dell'arto controlaterale può essere fatto per valutare meglio il successo dell'intervento chirurgico durante la fase 4 nello stesso animale. Tuttavia, l'amputazione dello stesso arto in un animale separato può anche essere utilizzata per fungere da controllo.

3. Recupero e cura post-operatoria

1. Una volta completato l'intervento chirurgico, posizionare un Kimwipe o un tovagliolo di carta sterile sul fondo del contenitore o della capsula di Petri per bagnarlo. Metti l'animale nel contenitore su ghiaccio bagnato e avvolgi delicatamente le estremità esposte del Kimwipe o del tovagliolo di carta intorno alla parte superiore dell'animale per mantenerlo ben idratato con la soluzione di sulfamerazina. Lasciare sul ghiaccio bagnato per 30 minuti a 1 ora per garantire un movimento minimo durante il recupero dall'anestesia.
2. Posizionare l'animale in un contenitore statico con soluzione di sulfamerazina allo 0,5%. Gli axolotl devono rimanere in questa soluzione per le prime 24 ore al fine di prevenire l'infezione.
3. Posizionare l'axolotl nell'acqua normale del sistema e monitorare quotidianamente la salute. Assicurarsi che nessuna sutura cada ogni giorno in quanto ciò può causare la formazione di una piccola ferita epidermide che confonderà i risultati.
   NOTA: Assicurarsi che il contenitore dell'alloggiamento disponga di ampio spazio per il movimento dell'axolotl e ridurre al minimo le possibilità che l'arto suturato sull'axolotl possa entrare in contatto con i lati del contenitore. Ciò contribuirà a garantire che le suture rimangano in posizione, specialmente durante la prima settimana dopo l'intervento chirurgico.

4. Valutare il successo dell'intervento chirurgico al microscopio stereoscopico

NOTA: Si consiglia di controllare gli animali al microscopio stereo almeno una volta alla settimana per valutare l'integrità del lembo di pelle completa e il successo dell'intervento chirurgico.

1. Anestetizzare l'axolotl in 0,1% di tricaina come nel passaggio 2.1. Assicurati che ci sia ampio spazio nel contenitore per far muovere l'axolotl.
2. Se si ispeziona durante le prime due settimane dopo l'intervento chirurgico, ispezionare l'arto suturato utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che non siano spuntate suture e che un'epidermide della ferita sottile chiara non sia visibile da nessuna parte. Se si ispeziona la terza settimana dopo l'intervento chirurgico o più tardi, assicurarsi che non si sia formato un blastema e confrontare con il modo in cui il normale arto amputato di controllo (dallo stesso animale o da un animale diverso) è progredito durante la rigenerazione (cioè, se si è formato un blastema).
3. Al termine, riportare l'axolotl alle normali condizioni di acqua e allevamento del sistema.

Risultati

Questo protocollo chirurgico consentirà la completa inibizione della formazione dell'epidermide della ferita (Figura 1) e, in definitiva, la rigenerazione degli arti. Un intervento chirurgico di successo non provoca la formazione di blastema in circa 2-3 settimane a seconda delle dimensioni dell'animale, mentre il controllo degli arti rigeneranti dovrebbe formare normalmente un blastema.

I ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato ad occhio nudo ogni 2-3 giorni per assicurarsi che le suture non siano spuntate e che non si stia formando un blastema. Se una o più delle suture spuntano fuori, può ancora formarsi un'epidermide della ferita con conseguente blastema piccolo o grande e un intervento chirurgico senza successo (Figura 2). Inoltre, i ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato almeno una volta alla settimana sotto uno stereomicroscopio per assicurarsi che un'epidermide sottile della ferita non sia evidente da nessuna parte sulla superficie di amputazione. Per confronto, i ricercatori dovrebbero anche esaminare l'arto rigenerante di controllo che dovrebbe avere un'epidermide avvolta sul piano di amputazione e formare un blastema per 2-3 settimane. L'epidermide della ferita apparirà sottile e chiara, mentre la pelle normale apparirà più opaca e rosa pallido (quasi bianca), giallo chiaro o verde scuro rispettivamente negli axolotl leucistici, albini o wildtype.

Se i ricercatori desiderano raccogliere il tessuto prima delle fasi di formazione del blastema a 2-3 settimane, dovrebbero ispezionare gli arti suturati prima della raccolta del campione per assicurarsi che le suture rimangano in posizione e che non si formi una piccola ferita epidermide. Inoltre, sezionare sagitalmente attraverso il tessuto dell'arto suturato ed eseguire analisi istologiche in qualsiasi momento può anche verificare la presenza del derma dal lembo di pelle intera che circonda l'intero piano di amputazione e l'assenza di un'epidermide della ferita (Figura 3).

Figura 1: Schema delle fasi dell'intervento chirurgico del lembo di pelle completa.
I passaggi del protocollo sono numerati e schematizzati qui. Le linee tratteggiate denotano i piani di amputazione ai passaggi 1 e 3 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di interventi chirurgici di lembo di pelle piena di successo e senza successo.
Immagine rappresentativa in campo luminoso di un arto che ha subito un intervento chirurgico di successo (a sinistra), un intervento chirurgico senza successo (a destra) e un arto rigenerante di controllo (nessun intervento chirurgico) a 25 giorni dopo l'amputazione (dpa). L'intervento chirurgico di successo ha un piano di amputazione piatto in cui è stato suturato il lembo di pelle intera, mentre l'intervento chirurgico non riuscito ha un piccolo blastema in via di sviluppo. Le punte di freccia denotano il piano di amputazione e le linee tratteggiate bianche sono lì per aiutare la visualizzazione dell'assenza di un blastema nell'intervento chirurgico di successo e la presenza di blastemi nell'intervento chirurgico non riuscito e controllare gli arti rigeneranti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Colorazione istologica degli arti normali rigeneranti e suturati FSF.
(A-B») Immagini rappresentative in campo luminoso di sezioni colorate di picro-mallory da arti rigeneranti (A-A') e suturati axolotl (B-B') a 7 dpa. Gli inserti in A e B sono mostrati rispettivamente in A' e B'. Lo strato dermico pesante di collagene si allinea e copre l'intero piano di amputazione in arti suturati. Il piano di amputazione è indicato da punte di freccia in A-B. Le barre di scala rappresentano 500 μm. Questa cifra è stata adattata da Tsai et ^al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo articolo descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici di lembo di pelle intera negli arti axolotl per inibire la formazione dell'epidermide della ferita. Mentre questo intervento chirurgico è relativamente semplice e tecnicamente riproducibile rispetto ad altri metodi di inibizione della formazione dell'epidermide della ferita, ci sono diversi passaggi critici che possono influire sul successo dell'intervento chirurgico. In primo luogo, quando si tira il lembo intatto della pelle intera sui tessuti sottostanti esposti, è fondamentale che la pelle a tutto spessore non venga danneggiata in alcun modo. Il danno al lembo della pelle può ancora portare alla formazione di una piccola ferita epidermide, che può provocare una piccola escrescenza simile al blastema. In secondo luogo, assicurarsi che le suture non cadano durante le cure post-operatorie in quanto ciò può anche portare alla formazione di una piccola ferita epidermide. A questo punto, ridurre al minimo il potenziale contatto tra l'arto suturato e le eventuali superfici è importante, soprattutto durante la prima settimana post-operatoria. Diversi modi per prevenire questo comportano l'alloggiamento e l'anestesia dell'axolotl in un contenitore abbastanza grande in modo tale che l'axolotl abbia molto spazio per muoversi dopo l'intervento chirurgico.

Questo intervento chirurgico ha anche diverse limitazioni. Forse il più notevole è che il successo degli interventi chirurgici può essere valutato solo in due modi: utilizzando l'ambito di dissezione durante le prime due settimane di intervento chirurgico per cercare l'assenza di un'epidermide della ferita e / o controllando se si forma un blastema entro 3 settimane. Sebbene questi metodi siano efficaci, sono relativamente bassi. Lo sviluppo di futuri axolotl reporter transgenici per marcatori specifici dell'epidermide della ferita può aiutare in uno screening più rapido per interventi chirurgici di successo rispetto a quelli senza successo. Inoltre, questo intervento chirurgico è più difficile da eseguire su animali più giovani in quanto la pelle intatta è più fragile. Si raccomanda pertanto l'uso di axolotl sub-adulti o adulti.

Mentre questo intervento chirurgico è stato originariamente sviluppato in N. viridiscens19, è stato facilmente adattato per axolotls25,39 e può probabilmente essere applicato anche ad altre specie di salamandra. In sintesi, l'applicazione di questa tecnica a futuri studi rigenerativi sugli arti consentirà ai ricercatori di sviluppare più strumenti per affrontare la biologia dell'epidermide delle ferite e identificare i meccanismi sottostanti che guidano la sua funzione nell'avviare la formazione di blastema.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curved spring scissors	Fine Scientific Tools	15009-08
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2
Forceps	Fine Scientific Tools	11252-40	Need two pairs
Nylon monofilament sutures (9-0)	Roboz	SUT-1000-21
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Stereo microscope	Leica	MZ6
Sulfamerazine sodium salt	Sigma-Aldrich	127-58-2
Surgical scissors	Fine Scientific Tools	14002-14