Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。
海馬は、辺縁系の一部であり、記憶形成と統合だけでなく、アルツハイマー病やてんかんを含む重度の脳障害の症状に関与している脳内の高度に組織化された構造です。海馬は高度な内部および相互接続性を受け取り、内部および外部の脳構造との適切なコミュニケーションを確保する。この接続は、ファイバー経路の形で異なる情報フローを介して実現されます。脳のスライスは、海馬の神経生理学的機能を探索する際に頻繁に使用される方法論です。海馬の脳スライスは、電気生理学的記録、光顕微鏡測定、ならびにいくつかの分子生物学的および体化学的技術を含むいくつかの異なる用途に使用することができる。したがって、脳スライスは、タンパク質機能を評価し、神経疾患に関与する病態生理学的プロセスを研究し、創薬目的で理想的なモデルシステムを表す。
スライスの準備には、いくつかの異なる方法があります。ビブラートメを用いた脳スライス調製物は、組織構造のより良い保存を可能にし、組織チョッパーの従来の使用よりも利点を提示するスライス中に十分な酸素供給を保証する。さらに、異なる切断面は、ビブラートメ脳スライスの準備のために適用することができる。ここでは、マウス脳のビブラートカット水平海馬スライスの準備に成功するための詳細なプロトコルが提供される。他のスライス調製とは対照的に、水平スライスは、海馬入力経路(穿角経路)の繊維をスライス内で完全に無傷の状態に保つことを可能にし、内海馬相互作用の調査を容易にする。ここでは、マウス脳の解剖、抽出、および急性水平スライスのための徹底的なプロトコルを提供し、この技術の課題と潜在的な落とし穴について議論する。最後に、さらなる応用における脳スライスの使用例をいくつか示します。
海馬の広範な探査は、スコヴィルとミルナーが重度のてんかん1の治療として海馬および近くの側頭葉構造を外科的に除去した後、患者(H.M.)が新しい宣言的記憶を形成できないことを報告したときに始まった。その瞬間から、海馬は、てんかんやアルツハイマー病などの重度の脳障害の発症まで、一般的な神経特性および機能から始まり、2、3、4、5まで広範囲に研究されてきた。海馬は、感情と記憶形成6、7に関与する関連する脳構造のグループからなる辺縁系の一部である。いくつかの繊維経路の密なネットワークは、内部および外部の脳構造へのタイトな海馬接続を達成する。これらの経路には、内側および側側の穿間経路(回をデンテートする内皮質、CA3-CA1およびサブカルム)8、苔状繊維経路(CA3へのデンテート・ジャイス)9およびシャファー側副交分路(CA3〜CA1)10(図1)が含まれる。海馬は、ニューロン層形成の高度に保存された層組織と、相対的に容易に重要な神経培養および脳スライスを得る可能性のために、これまでで最も広く探求された脳領域の1つを提示する5。
図1:異なる海馬領域と主要な繊維経路を示す漫画。異なる海馬領域は、内皮質(EC;黒)、デンテート回(DG;オレンジ)、 コルヌアンモニス (CA)3(シアン)、2(黄色)、および1(マゼンタ)、およびsubiculum(緑)の単色の線で示されます。ファイバー経路は、内側(MPP、赤)および横向きの穿フォーラント経路(LPP、 青)(内皮質からデンテート回、CA3、CA1、およびsubiculum)、苔状繊維経路(MF、バイオレット)(デンテート回からCA3まで)およびシャファー担保(CA3からCA1へのイプシラテララル)/関連付け交分路(AC、緑色)(CA1)まで。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
脳スライスプロトコルは、多くの場合、関心領域へのより遠い脳領域からの接続の損失をもたらす 5.また、毛細血管は機能性5ではなく、血液循環が奪われる11.これらの制限にもかかわらず、脳のスライスは、多くの利点のために海馬の神経生理学的機能の調査に主に使用されます。まず、海馬の抽出は速い12であり、多くの材料を必要としません。唯一の必須の機器は、解剖キット、実験室の水浴、カルボーゲンへのアクセスと振動マイクロトーム(ビブラートーム)13を含みます。脳スライス技術の他の資産は、血液脳関門(BBB)の回避と、実験開始前に内因的に放出された分子の洗い流し5であり、これは比較的正確な用量制御14で薬物の効果を研究することを可能にする。さらに、脳スライスは海馬15,16内の細胞体アーキテクチャおよびシナプス回路を保存し、神経間接続性および複雑な神経グリア相互作用を有する神経解剖学および局所環境は4、11、17を保持する。さらに、海馬繊維の接続は主に単方向であり、海馬ニューロンは高いシナプス可塑性を有し、神経学的プロセス18、19を理解するために高品質の電気生理学的記録の収集および解釈を非常に簡素化する。重要なことに、脳スライスは、イメージング記録に対する分子生物学的技術から、電気生理学的測定12、20、21、22、23、24、25、26まで、さまざまな科学的技術に適用可能な貴重な資産を提示する。
上で概説したように、海馬の脳スライスは、シナプス接続性の構造的および機能的特徴を研究するための強力な実験ツールを提示する。これは、神経興奮性および可塑性16に対する化学物質または突然変異の影響を評価する機会を提供する。
急性脳スライス製剤は、動物の年齢、安楽死の方法、解剖およびスライスの速度、スライス溶液およびパラメータ(例えば、スライス速度)ならびにスライス回復の条件を含む理想的な実験条件に大きく依存する、比較的敏感な技術および最適なスライスの質を提示する。したがって、適切に設計されたプロトコルは、最も重要であり、異なる研究ユニット13間で再現性を確保します。
ここでは、急性水平海馬スライス調製のための詳細なプロトコルを提供し、海馬横方向および内側穿光路および苔状繊維経路の完全性を維持することを目的として、デンテート回関連プロセスの調査を可能にする。マウスの脳を解剖、抽出、水平にスライスする重要なステップ、続いて、ベースライン条件下および野生型C57BL/6Jマウスの脳スライスにおけるLTP誘導プロトコル中のカルシウム-マイクロフルオリメトリック記録およびフィールド励起性ポストシナプス電解(fEpsP)の代表的な結果を詳細に説明する。
この研究のためのすべての動物実験は、KUルーヴェン(ベルギー)(P021/2012)の倫理審査委員会によって承認されました。
1. 高スクローススライス溶液と人工脳脊髄液(ACSF)の調製
2. 脳解剖のためのワークスペースの準備
3. マウス脳の解剖と位置決め
4. 脳の水平スライス
5. 電気生理学的記録のための脳スライスの回復
海馬の内側穿角経路(MPP)におけるfEPSP録音
7. 脳スライスのカルシウムイメージング記録
プロトコルに必要なツールと重要な手順の概要
図2 は、このプロトコルに記載されているように、水平急性海馬脳スライスの調製に必要なすべてのツールと重要なステップを示しています。一般的に、いくつかの解剖ツールとスライス回収室(図2A)、実験室用水浴、およびビブラート(図2B)を含む、限られた数の主要な機器が必要です。 図 2C-E は、スライス調製プロトコル中に脳と半球の重要なステップと向きを視覚化します。 図2F は、水平脳スライスの予想結果を示す図である。
内側の穿角パスでのfEPSP録音
回復期間の後、脳のスライスは、fepspsの電気生理学的記録に使用することができます。ここでは、多チャンネル重力制御灌流システムを搭載した直立顕微鏡を用いた(図3Aおよび図3B)。ガラスマイクロピペット(〜2 MΩ)をACSF溶液で満たし、塩素化バス電極を用いた回路のオペアンプに取り付けられた塩化物被覆銀電極の上に取り付けました。fEPSPsを記録し、脳スライスの上層の海馬のMPPにガラスマイクロピペットを挿入することによって、アンプと適切な記録ソフトウェアで視覚化した。fEPSPsは、2接触クラスタマイクロ電極による刺激によって誘導され、記録電極のMPP上流に異なる電流強度を適用した。このプロトコルは、MPP の録音を取得する方法を説明することを目的としているのではなく、ここで説明するスライス準備プロトコルの成功を示す例として MPP の録音を使用するだけであることに注意してください。誰かがMPP記録を実行しようとする場合、適切な記録部位を確保し、MPPをLPP8、36、37と区別するために、特定の制御(例えば、ペアリングされたパルス録音)が必要になる可能性があります。
図3Cは、fEPSP記録の負(左パネル、低品質スライス)と正(右パネル、高品質のスライス)の例を示す。負の例のトレースは、実際の fEPSP 振幅 (≈0.5 mV) よりもさらに高い大きなファイバー・ボレー (FV) 振幅を示しています。対照的に、高品質のスライス例(右パネル)は、FEPSP比の小さいFVと高いfEPSP振幅(>0.5 mV)を示しています。ファイバー・ボレーは、刺激された神経線維の脱分極時に起こるシグナルであり、したがって、ポストナプティック増強(fEPSP)に先行する。FEPSPプロパティとFVの関係は、軸索およびシナプス特性の保存に関する重要な情報を提供する。無傷の神経線維を有する高品質のスライスは、FV比に対する高いfEPSP振幅を示す必要があります。逆に、伝導特性が損なわれている低品質のスライスは、FEPSP対FV比が低下します。同様に、脳スライスの生存率は、fEPSPの傾きと繊維のバレー振幅をプロットすることによって分析することができる(図3D)。
さらに、入力出力曲線(fEPSP傾きと刺激強度に対するFV振幅)は、スライスの品質を決定するために標準で使用されます。このような曲線は、脳スライスに増加する電流刺激を適用し、その後のfEPSP応答を監視することによって得られる。低品質の脳スライスは、保存状態の悪い脳組織の最適でない伝導特性による入力出力曲線の減少を示す(図3E,F)。さらに、シナプスプロセスの調査に理想的な刺激強度範囲を定義するために、入力出力曲線が必要です。理想的には、刺激強度は最大応答の強度の約50%を設定する必要があります。この選択された刺激強度では、fEPSP応答はシナプス可塑性の変化に対して非常に敏感であり、長期的な増強(LTP)と長期うつ病(LTD)の両方を調査する機会を提供する。
シナプス可塑性を研究するために、選択された50%の刺激強度での脳スライス(fEPSPスロープ)のシナプス透過を、コンディショニング段階の前に長い期間(通常は20〜40分間)監視します。実行可能な脳スライスは安定したベースラインを持ちますが、不安定なベースラインを持つ脳スライスは、脳回路のシナプス可塑性を研究するために、さらなるコンディショニングプロトコルに使用することはできません(図3G、上部パネル)。fEPSPベースライン記録は、シナプス透過自体に対する薬物効果を監視するためにも有用である(図3G、下部パネル)。記録されたfEPSPベースライン信号の平均は、通常、fEPSP時間経過を正規化するために使用され、標準で100%に設定されています。
シナプス可塑性は、脳スライスに特定のコンディショニングプロトコルを適用することによって研究することができます。これらのプロトコルは、調査された脳回路と関心のメカニズム(例えば、LTPまたはLTD)に依存する。デンテート回のMPPにLTPを誘導するためには、MPPシナプス38に存在する強力なGABAergic阻害のために強力なコンディショニングプロトコルが必要である。GABAergic阻害は、高スクローススライス溶液39で調製した脳スライスにおいてさらに顕著であると報告されている。ここでは、GABAA 受容体拮抗薬ビキュクリンで処理しながら5分間隔で適用される1秒長い100Hzパルスの4つの刺激からなるプロトコルを使用する(図3H)。コンディショニング期間中にNMDAとビクキュリンを併せて添加すると、LTPが増加する(図3H)。スライスの低品質と不安定なシナプス伝達(fEPSPベースライン)は、LTPおよびLTD誘導の変更または失敗をもたらす可能性があります。したがって、高品質のスライス準備を行い、厳密な除外基準(繊維ボレー比(<3)のfEPSP振幅が低い)、小さなfEPSP傾斜(<0.5 mV/ms)または振幅(<0.5 mV)および不安定なfEPSPベースライン(5%以上の変化)を使用することが非常に重要です。シナプスプロセスを調査する際の、不可能なスライス用。
デンテート回の顆粒細胞層におけるマイクロ蛍光測定
回復後、脳スライスを、光から遮蔽したカルボゲン化ASCFで1時間、カルシウム感受性染料2μMで室温でインキュベートした。このスライスを、多チャンネル重力制御灌流システムを搭載した直立蛍光顕微鏡上の記録チャンバー(図3A)に移した。蛍光発光画像は、488nmでの照射後500ミリ秒ごとに取得した(図4A,B)。励起はキセノンランプで行われ、スキャナーは回折格子を取り付け、画像取得はコンピュータ制御のCCDカメラで行った。測定の間、スライスをNMDA受容体アンタゴニストAPVで処理し、その結果、細胞内カルシウム濃度が低下した。高カリウム濃度(50mM)を含む細胞外溶液を用いたスライスの刺激は、ニューロンの脱分極と電圧ゲートイオンチャネルの開口による細胞外カルシウムの大量流入をもたらした(図4C)。
化合物 | 濃度 (mM) | 分子量 (g/mol) | 金額 (g) |
KCl | 25 | 74.55 | 1.86 |
CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2.94 |
MgSO4 * 7H2O | 10 | 246.48 | 2.46 |
KH2PO4 | 12.5 | 136.08 | 1.7 |
表1:10×スライス前溶液(1L)。
化合物 | 濃度 (mM) | 分子量 (g/mol) | 金額 (g) |
ナクル | 125 | 58.44 | 7.3 |
KCl | 2.5 | 74.55 | 0.19 |
CaCl2 * 2H2O | 2 | 1 M CaCl2 ソリューションから | 2 mL |
MgSO4 * 7H2O | 1 | 1 M MgSO4 溶液より | 1 mL |
NaH2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156.02 | 0.2 |
ナフコ3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
グルコース * H2O | 25 | 198.17 | 4.95 |
表 2: 1x ACSF (1 L) (305~315 mOsm の間の浸透性)
化合物 | 濃度 (mM) | 分子量 (g/mol) | 金額 (g) |
10x スライス解像度 | 該当する | 該当する | 25 mL |
蔗糖 | 252 | 342.3 | 21.57 |
ナフコ3 | 26 | 84.01 | 0.55 |
グルコース * H2O | 10 | 198.17 | 0.49 |
表3:1x高スクローススライス溶液(250mL)(320〜325mOsm間の浸透性)。
図2:水平海馬脳スライスの調製に関する詳細情報。(A) げっ歯類の脳の解剖と切断に必要なツールの画像: (a) 長さ ±2cm、フィルターペーパーの幅±0.5cm幅(例えば、グレード413)(b) ブレード;(c) スーパーグルー;(d) ピペットチップ;(e)標本プレート(ビブラートメが付属);(f) 35 mm の培養皿。(g)細かいブラシ。(h) へら;(i) 湾曲した鉗子;(j) 解剖はさみ;(k)強いはさみ(10cm以上の刃の長さ)。(l)プラスチック製のパスツールピペット、広い開口部(直径0.6〜0.8cmの間)。(m)回復室(250 mLビーカー、プラスチックリング、ナイロンメッシュ、10 mL血清ピペットの一部で自作)。(n)冷蔵培養皿の上に氷と(o)ろ紙の正方形で満たされた90mmの培養皿。(B) 氷で満たされたスライスチャンバーの(a)ホルダーを持つビブラートメの画像;(b) スライスチャンバー(c)カルボゲンラインおよび(d)スライスカミソリブレード。(C)横スライスのために脳を準備するために1つの半球の後側のカットの向きを示す漫画(ステップ3.9を参照)。(D)ビブラートメの標本プレート上の脳の向きの等角投影。(E)標本プレート上の2つの半球の位置の上面図を示す漫画。(F)横脳スライスで海馬の位置を示す漫画。海馬のデンテート回(DG)と コルヌアンモニス (CA)-スビキュラム(SB)領域が示されている。(G) 10 スライスされた新しい水平脳スライスを含むカーボゲン化 ACSF を持つ回復室の画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:海馬脳切片の電気生理学的記録。(A)直立した顕微鏡下で使用される、灌流と吸引を伴う記録室の画像。脳のスライスはチャンバーに配置され、録音の開始前にペーパークリップの一部で固定化されます。(B) 直立した顕微鏡下での海馬脳スライスの明視野画像(10倍の目的)。デンテート回(DG)およびCA3領域は、fEPSPの記録中の内側穿刺経路を標的とする刺激(左下)および記録(右下)電極と同様に示される。(C)左:堅牢なファイバーボレーと小さな振幅を持つfEPSP記録の低品質スライス例の表現。右:fEPSP記録の高品質スライス例。灰色の線はベースラインレベルを示します。点線は、0.5 mVのカットオフ振幅を示します。(D) fEPSP スロープと FV 振幅のプロット (黒; n =10) および低品質の脳スライス (グレー; n =4)SEM±平均として表されるデータ(E)高品質スライス(黒;n = 10)と低品質スライス(グレー;n = 4)の異なる刺激強度(μA)の入力出力プロット(fEPSPスロープ)(F)(E) と同じですが、FV 振幅と刺激強度の比較を行います。(G)3つの異なるベースラインfEPSP記録の時間経過(fEPSPの傾き%;最初の5分の平均fEPSP傾きに正規化)。上側のパネルは正(黒)と負(赤)の例を表し、後者は記録中にカルボーゲンが失われたために不安定なベースラインを有する。下段のパネルは、治療中の2つの安定したベースライン記録を示しています(安定ベースラインの20分後、AMPA受容体はAMPA受容体拮抗薬DNQX(10μM))の適用によってブロックされた)および未処理の状態(黒)。。(H)異なる治療条件(下部パネルで示される)のためのLTP記録の時間経過。コンディショニング時のビキュリン(20μM)の塗布用黒色、コンディショニング中のビキュリン(20μM)とNMDA(10μM)の共同適用にブルー。上部パネルの矢印は、高周波刺激が適用された時点を示します(4 x 1s of 100Hz)。下のパネルの棒グラフは、平均fEPSPの傾き(%)を表します上部パネルに示されている実験のLTP誘導後50〜60分間(各条件の単一の代表的な記録)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:海馬の脳スライスのカルシウム-マイクロフルオリメトリー.(AおよびB)蛍光画像(488nmで励起)(A)とマウス脳の水平海馬脳スライスの対応するヒートマップ(B)。デンテート回(DG)、CA3領域、および関心領域(ROI)の一例は、NMDA受容体アンタゴニストAPV(50μM)および細胞外カリウム(50μM)を含む高い細胞性カリウム(50μM)を用いた治療中の急性海馬脳スライスのデンテートジのROIからのカルシウム応答の時間経過(F488nm)および高細胞カリウム(50μM)を含む溶液で示されている。トレースは、高K+灌流中の最も高いカルシウム応答に正規化され、光漂白のためにベースライン補正されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
一般的に神経科学コミュニティの間で使用されていますが, 脳スライスの準備もいくつかの欠点に直面しています。.例えば、関心のある脳領域への入出力接続は、もはや脳スライスに接続されていません。さらに、一度単離されると、組織は時間の経過とともにゆっくりと分解し始め、このプロセスは脳スライスの生理学的条件を変える可能性がある。特に、ほとんどの脳スライスの記録は数分から数時間かかるため、実験開始前に6~8時間まで隔離された組織での記録を行う実験日が長くなるため、このトピックは非常に重要です。さらに、脳脊髄液および血液循環は、スライス調製中に中断され、脳スライス内の重要な内因性化合物の不足につながる可能性がある。そして最も明らかに、スライス手順自体は、得られた結果を損なう可能性のある機械的組織損傷を引き起こす可能性があります。しかし、脳スライス製剤の実際の利点は、まだ彼らの欠点を上回っているので、彼らは神経科学研究で高く評価され、採用された技術を提示する理由です。
急性海馬脳スライスは、分子レベルから複雑な脳回路研究までのニューロンプロセスを調査するために強力で広く使用されている技術を提示します。これは、スライス調製18で容易に保存することができる海馬の理想的な神経解剖学に基づいている。その結果、海馬の脳スライスは、薬物スクリーニング17、認知機能に関与する神経およびシナプス特性の研究、および病的な脳状態14、42、43の調査を含む、多種多様な科学的研究プロジェクトで使用される。しかし、さまざまな用途の広いスペクトルはまた、解剖条件や切断面の向きなど、さまざまなパラメータで異なる使用可能なスライス調製プロトコルの広い範囲を引き起こします。したがって、科学プロジェクトの正確な研究問題は、適切なスライス調製プロトコルを選択するために決定されなければならない。
組織チョッパーは、海馬の脳スライス44、45を準備するために最も古くから使用される技術の1つを提示する。この調製方法の主な利点は、チョッパーの低コストと高速かつ簡単に使用46を含む。しかし、組織チョッパーは、形態学的変化および細胞死をもたらす機械的ストレスを引き起こす47。それに比べて、ビブラートは高価な機械であり、スライスの準備の時間が大幅に増加し、スライスの品質に影響を与える可能性があります。しかし、ビブラートメは通常、組織からスライスを分離するより穏やかな方法を提供し、脳を正常に冷却し、全体の分離手順にわたって酸素化し、それによってスライス特性46を改善することを可能にする。したがって、いくつかのグループは、標準的にこの技術を採用しており、ビブラートメ16、30、48を使用して急性海馬脳スライスの調製のためのプロトコルを前進させました。いくつかのプロトコルはスライス自体の詳細を提供するが、むしろそのようなスライス準備48の特定のアプリケーションに焦点を当てるが、他の人は、この記事27、30で与えられた切断面または他のプロトコルの詳細(例えば、アガロース埋め込みまたはスライス/回復ソリューション)で異なる詳細なスライスプロトコルを提供する。
ここで説明するプロトコルは、若い動物から高品質の急性水平海馬マウス脳スライスを調製するための簡単な方法を提示する。このプロトコルは、海馬皮質から海馬8、49、50に向かう海馬入力経路を示す穿角経路(内側および外側)を保存するのに特に有用である。射手、冠状動脈、ならびに孤立した海馬横スライス製剤は、主に内皮質の層IIおよびVに由来する穿角経路を適切に保存せず、海馬18内のいくつかの領域にプロジェクトする。海馬に関する内皮質の解剖学的位置決めのために、水平脳スライスはスライス調製31内の完全に無傷の穿形経路繊維を維持するために必要である。さらに、水平スライスは、理想的には、海馬9、30、50内のCA3ニューロンにデンテート回から投影する苔状の繊維を保存します。したがって、この調製方法は、海馬の入力経路およびDG関連プロセスを調査する研究にとって価値が高い。さらに、このプロトコルは、シャファー担保経路50の調査を可能にする。しかし、矢状および冠状脳スライス製剤は、CA3からCA1繊維投影を調査する際により一般的に使用され、おそらく高品質のスライスを得る可能性を高めることができるわずかに速い準備時間のために使用される。それにもかかわらず、水平海馬スライス製剤は、1つのスライス半球内のすべての海馬繊維経路の保存および調査を可能にするので、強力な研究ツールを提示する。これは、例えば、マルチ電極アッセイ記録において、回路応答が研究される場合に特に有用であり得る。
脳のスライスを準備するときの主な懸念は、脳組織の適切な保存です。これは、速い解剖、組織の連続的かつ十分な酸素化および冷却、および低ナトリウム、高スクローススライス溶液39、51を用いた保護切断法を用いた脳組織の保護を含む、我々のプロトコルのいくつかの重要なステップによって達成される。ここで説明するプロトコルが約90%の成功率をもたらすという事実にもかかわらず、古いまたは遺伝的に多様な動物に由来する組織を扱うとき、または特定の細胞集団を保存しようとする場合には、潜在的に追加の保護ステップが必要になる可能性があります。いくつかの方法は、敏感な脳組織の準備を保護するために既に報告されました。.これらの方法には、ナトリウム透過性52を低減するためのNMDGベースのスライス溶液の使用、NMDA受容体活性53を遮断するためにスライス溶液中で高マグネシウムレベルを使用すること、および回復期間23中にも保護溶液の長期使用が含まれる。これらの措置のすべては、減少する興奮毒性をもたらす。さらに、氷冷保護ACSF溶液を用いた心間灌流は、古い動物27と一緒に作業する際にしばしば採用され、必要である。
急性海馬脳スライスは、ノイズ比11に対する高い信号を保証する比較的厚い(300〜500μm)の急性脳スライスから得ることができる高振幅信号などの理由から、電気生理学的研究に理想的かつ広く使用される。標準的に使用される電気生理学的用途には、電圧または電流クランプモードでの細胞外フィールド記録および細胞内全細胞記録が含まれる。高品質の電気生理学的データを取得するために、スライスの健康は、提示されたプロトコルに厳密に従うことによって、第一の関心事であり、保証することができます。ただし、スライスの準備は高感度な手法を提示するので、各実験の開始前に品質チェックを定期的に含める必要があります。いくつかのパラメータは、スライスの品質チェックとして使用することができ、標準では入力出力曲線とベースラインfEPSPまたはEPSC記録19を介して評価されます。それにもかかわらず、電極位置決め、配向、あるいは損傷などの実験的エラーから生じ得る、しかも、調製されたスライスの健康状態を表すものではない。したがって、40xの目的またはDAPI核染色の下で細胞の簡単な視覚化および評価のような追加の品質管理を行うことを推奨する。このような品質チェックを使用して、複数のスライス準備セッションで一定のスライスの正常性を確認できます。
カルシウムマイクロフルオリメトリーは、海馬の脳スライスを研究するためにあまり一般的に使用される技術を提示します。しかし、この技術は、細胞内および細胞内の電極記録に追加的な価値があり、神経およびシナプスシグナル伝達において重要である細胞内カルシウムフラックスを視覚化および定量化することができる。細胞内カルシウム濃度の変化は、神経伝達物質の小胞放出、過敏性の潜在的発生、シナプス可塑性および軸索神経伝導の調節54、55、56に関与している。この技術の例として(図4)、市販のカルシウム染料を利用しました。間違いなく、カルシウム染料による組織スライスの治療は、実験的な時間枠の増加や、低位置ニューロン細胞の非効率的なローディングなどの困難を生み出す可能性があります。しかし、この技術のバリエーションは、これらの技術的な課題を回避するために使用することができます。例えば、海馬のスライスでカルシウム測定とパッチクランプの記録を組み合わせることが可能です。このようにして、カルシウム蛍光色素をパッチピペットを介して特定の細胞にロードすることができ、関心のある1つの特定の細胞におけるカルシウムダイナミクスの測定を可能にする57。あるいは、カルシウム指標を発現する遺伝子操作動物、GCaMP58は、脳全体で、または細胞特異的な促進器によって駆動され、使用され得る。興味深いことに、GCaMP動物から関心のあるタンパク質への直接リンカーを持つ脳組織は、ニューロン発現パターンを決定したり、カルシウム火花や波への関与を調査する機会を提供する可能性があります。
全体として、我々は、電気生理学的およびイメージング記録のためのマウスからの健康で実行可能な水平海馬脳スライスの成功した準備のためのガイドラインを提供する。この方法論は、歯状回に記載されている脳病理で起こる神経学的変化にアクセスするのに非常に有用である。
著者らは開示するものは何もない。
KEIMPE Wierda博士とジョリス・デ・ウィット教授の監督の下、VIB-KUルーヴェン脳疾患研究センターの電気生理学ユニットに感謝します。さらに、私たちは、イオンチャネル研究所とKUルーヴェンの子宮内膜症、子宮内膜症および生殖医学の研究室のすべてのメンバーに、彼らの有益な議論とコメントに感謝します。
このプロジェクトは、研究財団フランダース(G.084515NおよびG.0B1819NからJ.V.)とKUルーヴェンの研究評議会(C1-資金調達C14/18/106からJ.V.)から資金を受け取っています。K.P.はFWO[PEGASUS]2マリー・スクウォドフスカ・キュリー・フェローで、研究財団フランダース(FWO)(12T0317N)とマリー・スクウォドフスカ・キュリー交付契約(665501)に基づく欧州連合(EU)のホライゾン2020研究イノベーションプログラムから資金を受け取りました。K.H.はベルギーのフランダース研究財団の博士研究員です(12U7918N)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia chamber | home made - Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made - Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made - Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |
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