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要約

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。

要約

海馬は、辺縁系の一部であり、記憶形成と統合だけでなく、アルツハイマー病やてんかんを含む重度の脳障害の症状に関与している脳内の高度に組織化された構造です。海馬は高度な内部および相互接続性を受け取り、内部および外部の脳構造との適切なコミュニケーションを確保する。この接続は、ファイバー経路の形で異なる情報フローを介して実現されます。脳のスライスは、海馬の神経生理学的機能を探索する際に頻繁に使用される方法論です。海馬の脳スライスは、電気生理学的記録、光顕微鏡測定、ならびにいくつかの分子生物学的および体化学的技術を含むいくつかの異なる用途に使用することができる。したがって、脳スライスは、タンパク質機能を評価し、神経疾患に関与する病態生理学的プロセスを研究し、創薬目的で理想的なモデルシステムを表す。

スライスの準備には、いくつかの異なる方法があります。ビブラートメを用いた脳スライス調製物は、組織構造のより良い保存を可能にし、組織チョッパーの従来の使用よりも利点を提示するスライス中に十分な酸素供給を保証する。さらに、異なる切断面は、ビブラートメ脳スライスの準備のために適用することができる。ここでは、マウス脳のビブラートカット水平海馬スライスの準備に成功するための詳細なプロトコルが提供される。他のスライス調製とは対照的に、水平スライスは、海馬入力経路(穿角経路)の繊維をスライス内で完全に無傷の状態に保つことを可能にし、内海馬相互作用の調査を容易にする。ここでは、マウス脳の解剖、抽出、および急性水平スライスのための徹底的なプロトコルを提供し、この技術の課題と潜在的な落とし穴について議論する。最後に、さらなる応用における脳スライスの使用例をいくつか示します。

概要

海馬の広範な探査は、スコヴィルとミルナーが重度のてんかん1の治療として海馬および近くの側頭葉構造を外科的に除去した後、患者(H.M.)が新しい宣言的記憶を形成できないことを報告したときに始まった。その瞬間から、海馬は、てんかんやアルツハイマー病などの重度の脳障害の発症まで、一般的な神経特性および機能から始まり、2、3、4、5まで広範囲に研究されてきた。海馬は、感情と記憶形成6、7に関与する関連する脳構造のグループからなる辺縁系の一部である。いくつかの繊維経路の密なネットワークは、内部および外部の脳構造へのタイトな海馬接続を達成する。これらの経路には、内側および側側の穿間経路(回をデンテートする内皮質、CA3-CA1およびサブカルム)8、苔状繊維経路(CA3へのデンテート・ジャイス)9およびシャファー側副交分路(CA3〜CA1)10(図1)が含まれる。海馬は、ニューロン層形成の高度に保存された層組織と、相対的に容易に重要な神経培養および脳スライスを得る可能性のために、これまでで最も広く探求された脳領域の1つを提示する5。

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図1:異なる海馬領域と主要な繊維経路を示す漫画。異なる海馬領域は、内皮質(EC;黒)、デンテート回(DG;オレンジ)、 コルヌアンモニス (CA)3(シアン)、2(黄色)、および1(マゼンタ)、およびsubiculum(緑)の単色の線で示されます。ファイバー経路は、内側(MPP、赤)および横向きの穿フォーラント経路(LPP、 青)(内皮質からデンテート回、CA3、CA1、およびsubiculum)、苔状繊維経路(MF、バイオレット)(デンテート回からCA3まで)およびシャファー担保(CA3からCA1へのイプシラテララル)/関連付け交分路(AC、緑色)(CA1)まで。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

脳スライスプロトコルは、多くの場合、関心領域へのより遠い脳領域からの接続の損失をもたらす 5.また、毛細血管は機能性5ではなく、血液循環が奪われる11.これらの制限にもかかわらず、脳のスライスは、多くの利点のために海馬の神経生理学的機能の調査に主に使用されます。まず、海馬の抽出は速い12であり、多くの材料を必要としません。唯一の必須の機器は、解剖キット、実験室の水浴、カルボーゲンへのアクセスと振動マイクロトーム(ビブラートーム)13を含みます。脳スライス技術の他の資産は、血液脳関門(BBB)の回避と、実験開始前に内因的に放出された分子の洗い流し5であり、これは比較的正確な用量制御14で薬物の効果を研究することを可能にする。さらに、脳スライスは海馬15,16内の細胞体アーキテクチャおよびシナプス回路を保存し、神経間接続性および複雑な神経グリア相互作用を有する神経解剖学および局所環境は4、11、17を保持する。さらに、海馬繊維の接続は主に単方向であり、海馬ニューロンは高いシナプス可塑性を有し、神経学的プロセス18、19を理解するために高品質の電気生理学的記録の収集および解釈を非常に簡素化する。重要なことに、脳スライスは、イメージング記録に対する分子生物学的技術から、電気生理学的測定12、20、21、22、23、24、25、26まで、さまざまな科学的技術に適用可能な貴重な資産を提示する。

上で概説したように、海馬の脳スライスは、シナプス接続性の構造的および機能的特徴を研究するための強力な実験ツールを提示する。これは、神経興奮性および可塑性16に対する化学物質または突然変異の影響を評価する機会を提供する。

急性脳スライス製剤は、動物の年齢、安楽死の方法、解剖およびスライスの速度、スライス溶液およびパラメータ(例えば、スライス速度)ならびにスライス回復の条件を含む理想的な実験条件に大きく依存する、比較的敏感な技術および最適なスライスの質を提示する。したがって、適切に設計されたプロトコルは、最も重要であり、異なる研究ユニット13間で再現性を確保します。

ここでは、急性水平海馬スライス調製のための詳細なプロトコルを提供し、海馬横方向および内側穿光路および苔状繊維経路の完全性を維持することを目的として、デンテート回関連プロセスの調査を可能にする。マウスの脳を解剖、抽出、水平にスライスする重要なステップ、続いて、ベースライン条件下および野生型C57BL/6Jマウスの脳スライスにおけるLTP誘導プロトコル中のカルシウム-マイクロフルオリメトリック記録およびフィールド励起性ポストシナプス電解(fEpsP)の代表的な結果を詳細に説明する。

プロトコル

この研究のためのすべての動物実験は、KUルーヴェン(ベルギー)(P021/2012)の倫理審査委員会によって承認されました。

1. 高スクローススライス溶液と人工脳脊髄液(ACSF)の調製

  1. 実験日の前に
    1. 実験室グレード1の水を含む10xスライスプレ溶液の1Lを調製(mM):25KCl、20 CaCl2、10MgSO 4、12.5 KH2PO4(表1)を使用する。リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、磁性攪拌機で常に攪拌しながら、800 mL H2Oであらかじめ充填されたビーカーに化学物質をゆっくりと混ぜ合わせます。溶液を4°Cまたは室温(RT)で保存してください。
  2. 実験日に
    1. 実験室グレード1タイプ水(mMで):125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1MgSO 4、1.25NaH2PO4、26NaHCO3、25グルコースを備えた1X ACSFの1 Lを調製する。蒸気圧オスマノメーターを使用して、305~315 mOsm(pH~ 7.55~7.6)の間の浸透圧を検証します。
      注:リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、磁性攪拌機で常に攪拌しながら、800 mLのH2Oであらかじめ充填されたビーカー内のすべての固体化学物質をゆっくりと混合します。MgSO4 とCaCl2 を最後に加え、1Mストック溶液から必要な量にゆっくりと滴下します。
    2. 7.3~7.4の間でpHを設定するために、カルボーゲンとRTで連続的に1x ACSF溶液を泡立てる。
      注: pH が少し高すぎる場合や低すぎる場合は、カーボジネーション強度の小さな調整で十分です。pHがカーボゲネーションで7.45より高い場合は、1 M NaH2PO4溶液の数滴を加えて調整してください。
    3. 25mLの10xスライス前溶液と(mM)の25mLを含むビーカーに1x高ショ糖スライス溶液の250mL(脳あたり)を調製する:252ショ糖、26NaHCO3、および10グルコース(表3)。オスモルラリティが 320~325 mOsm (pH ~ 7.55~7.6) の間であることを確認します。
    4. 高ショ糖スライス溶液をカルボーゲンで10~15分間泡立て、7.3~7.4の間でpHを制御します。
      注:pHがカーボキネーションで7.45より高い場合は、1 M KH2PO4 溶液の数滴を追加して調整してください。
    5. ハイスクローススライス溶液を20~30分間、超冷凍庫(-80°C)に入れ、一部冷凍するまで保管してください。

2. 脳解剖のためのワークスペースの準備

  1. 高スクローススライス液の冷却中に、以下を準備する。
    1. 水浴を32°Cに温めます。
    2. 回復チャンバー(図2A)にカルボゲン化されたACSF溶液を充填し、チャンバーを水浴に入れます。回復チャンバーの主な ACSF ボトルと ACSF にカルボーゲンを継続的に塗布します。
    3. 動物を実験室に案内する。
      注:動物の年齢、性別、および緊張は、個々の実験者によって決定され、特定の研究の質問に依存する必要があります。しかし、動物のパラメータは、異なる実験日間の比較性を保証するために、1つの研究内で一定に保たれるべきである。このプロトコルは、2~6週の年齢でC57BL/6J雄マウスを使用するために設計されました。古い動物が使用される場合、急性のスライスの脳の健康を維持するために、スライスおよび回復溶液は、それに応じて4、27(例えば、NMDG+- ベース溶液23、28)に適応する必要があります。
    4. 麻酔室を準備します。
    5. ティッシュペーパーをレイアウトし、 広い開口部(カットオープン)、氷で満たされた90ミリメートルの培養皿、冷たい文化皿の上にフィルターペーパーの正方形、切断のための強力なはさみ、解剖ハサミ、湾曲した鉗子、スパチュラ、35mm培養皿、細かいブラシ、ブレード、標本プレート(ビブラートメが付属)、スーパー接着剤、ピペットチップ、4本のストラップ
    6. ビブラートオームを設定する:まず、正しい設定(ブレード移動速度:0.08 mm /s、切削振幅:1.4mm、切削周波数:85Hz)のビブラートオームをプログラムし、スライスチャンバーにカルボーゲンラインを取り付けます。次に、スライスチャンバーをホルダーに入れ、スライスチャンバーを囲むホルダーに氷を充填し、ビブラートメにすべてを取り付けます。最後に、カミソリの刃をビブラート式ブレードホルダーに入れる(図2B)。
  2. 高スクロース溶液の凍結後、以下の手順を行う。
    1. 20~30分後、ハイスクローススライス溶液を-80°Cの超冷凍庫から取り出し、ビーカーを氷の上に置きます。
    2. ハイスクロース溶液をベンチのビブラートームの隣に置き、部分的に凍結した溶液をヘラと混ぜて素敵なスラッシュを取得し、カルボーゲンで泡立ち始めます。
    3. プラスチック製のパスツールピペットでハイスクローススライス溶液を取り上げ、冷たい90mm培養皿の上に正方形のフィルターペーパーを浸します。
    4. 35 mm培養皿(または脳全体を保存するのに適した同等の小さな容器)をハイスクローススライス溶液(脳全体を覆うのに十分)で最大75%充填し、残りの溶液でビーカーの隣に保管された氷の上の培養皿を冷却します。35mm培養皿での溶液をカルボゲネート。

3. マウス脳の解剖と位置決め

  1. 5%イオフルランで動物を麻酔します。足をつまんで麻酔の適切な深さを決定します。足の離脱反射は起こるべきではありません。
  2. ティッシュペーパーで動物を移し、強いはさみまたは小さい動物のギロチンでそれを切り落とす。
  3. 頭皮を切り開くには解剖ハサミを使用してください。
  4. 矢状縫合に沿ってカルバリアを切り開き、嗅球を含む脳全体が見えるまで湾曲した鉗子の助けを借りてそれを取り除く。
    注:カルバリアや鉗子の鋭いエッジで脳を損傷しないように注意してください。
  5. 脳を慎重にすくい取るためにへらを使用してください(嗅球は取り付けられたままにする必要があります)。
  6. 冷やされた35mm培養皿で脳を移し、ACSFで満たされたパスツールピペットで脳を穏やかに洗浄することによって組織からすべての毛髪または血液粒子を取り除く(血液は脳組織29に対する細胞毒性効果を有する)。
  7. 冷蔵90mm培養皿の上に浸したろ紙にスパチュラの助けを借りて脳を移す(図2A)。
  8. ブレードを使用して脳を半分に切断し、2つの半球を分離し、切断したばかりの内側側に両方の半球を配置します。
  9. ブレードを使用して、後側部分を取り外します (5%~ 10%)各半球から脳の、平行な切断を伴い、2C(図)30を、脳の腹側を上向きに切り取り、切り取りたばかりの側に両半球を配置する。
  10. 標本の版の上にスーパー接着剤の滴を置き、両方の半球を収容するためにピペットの先端で適切に広がる。
  11. フィルターペーパーストラップで腹側に触れて毛細血管力で1つの半球を拾い上げ、それによって組織を損傷しないようにフィルターペーパーストラップを使用してください。
  12. 別のフィルターペーパーストラップを使用して、脳の後側を慎重に半乾燥させてから、片面プレートの接着剤の上に後側を下にして半球を配置します。2 番目の半球でも同じ手順を繰り返します。
    注: 半球は、回転体プレート上のミラー状の水平位置に配置され、ロストラル側は外側を指し、尾側は真ん中に向き合う(しかし触れていない)必要があります。両半球の内側側はビブラートメブレードを向き、側面は実験者に向かう必要があります(図2D)。
  13. スライスチャンバーに試料プレートを置き、迅速に、しかし慎重に、氷冷高ショ糖スライス溶液スラッシュでそれをカバーします。溶液が接着剤に触れるとすぐに、それは固まり、適切に標本プレートに半球を接着します。
  14. 半球が高ショ糖スライス溶液で適切に覆われていることを保証し、溶液がカルボーゲンで泡立っていることを確認します。
    注: 解剖手順全体は、できるだけ速く実行する必要があります。非常に長い間、酸素の供給なしに脳がとどまらないようにしてください。それは、高ショ糖スライス溶液スラッシュで切断から脳の水没まで約1〜1.5分しかかからず。これは、スライスの高品質を保証するために急性脳スライス調製のための最も重要な要件です。

4. 脳の水平スライス

  1. ビブラートメブレードを半球の内側側の前に置き、現在上向きになっている半球の腹側と同じ高さに下げます。ビブラートメコントロールの助けを借りてブレードを下げ、さらに600μmの後方方向に切り、スライスを開始します。ブレードは、組織に当たる必要があります(そうでなければ、ブレードを逆にしてもう少し下げます)。最初の 2 つのスライスが 2 つの半球から完全に分離されるまでスライスします。
  2. ブレードを逆にして、さらに300μm下げて、もう一度スライスします。
  3. 海馬が見えるようになると(必要に応じて、マウス31 脳アトラスを使用して助けを求める)(図2E)は、拡大されたプラスチック製のパスツールピペットでスライスを収集する。海馬の隣に、ケーデートのプタメンが見えるまでスライスを集める。通常、マウスの脳のために300 μm(1半球あたり4~6)の8~12個のスライスを採取することができます。
  4. プラスチック製のパスツールピペットを使用してスライスを収集し、水浴中の回収室(図2F)に移します(スライスの各ラウンド後にスライスを収集してスライスチャンバーに浮かびまないようにします)。
    注:できるだけ速く作業し、ハイスクローススライス溶液が氷冷と全体の手順の間にカルボゲン化されていることを確認してください。必要に応じて、スライスチャンバーを囲む氷を補充します。

5. 電気生理学的記録のための脳スライスの回復

  1. 32°Cの水浴でACSF充填回収室にスライスを1時間放置します。
    注:回復チャンバーも市販されています。
  2. 水浴から回復室を取り出します。
  3. それ以上のアプリケーションを開始する前に、回復のために少なくとも別の30分間RTにスライスを置きます。

海馬の内側穿角経路(MPP)におけるfEPSP録音

  1. ホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペットを引き出し、水平ピペットプーラーでピペットを受け取り、ACSF溶液で充填し、ACSF充填記録チャンバに浸漬すると、〜2MΩの大きさのピペットを受け取ります。
  2. 記録チャンバに接続された重力制御多バレル灌流システムに適切な化学物質(例えば、Bicuculline)を含むACSF浴溶液およびACSF溶液を充填する。継続的にすべてのソリューションをカーボケート。
  3. 記録室の灌流ラインの反対側に接続された吸引管に接続された蠕動ポンプまたは真空ポンプをオンにします。ACSF 充填バレルを開き、連続的なフローの確立を開始します(1~ 2 ドロップ/秒)。参照電極が ACSF ソリューションに沈み込みされていることを確認します。
  4. セットアップコンピュータ、アンプ、マイクロマニピュレータ、刺激装置、顕微鏡ライト、カメラ、モニタ(該当する場合)のスイッチをオンにします。
  5. 電気生理学的記録に適したソフトウェアを開きます(電気生理学的機器用のハードウェアおよびソフトウェアプロバイダが複数存在します)。
  6. 回復チャンバーからスライスセットアップの記録チャンバーに1つの脳スライス半球を移し、視野のデンテート回顆粒細胞層と分子層と正しい方向に配置します。刺激電極が内皮質の方向からスライス内のMPPに到達できること、および記録電極がCA3の方向から正反対の側からMPPにアクセスできることを確認してください。
  7. クリップ(図3A)または市販の脳スライスグリッドで記録チャンバー内のスライスを安定化させます。
    注:スライスの転送と位置決めの間に、灌流をオフにすると便利です。しかし, これは脳のスライスの品質を保証するためにあまりにも長い時間を取るべきではありません..
  8. MPP内の記録および刺激電極を、顆粒細胞層に近い分子層の下3分の1(図3B)に下げ、位置を設定し、約100~150μmの距離で互いに向き合う。刺激電極は表面に最小限に接触し、記録電極は上部スライス層にわずかに浸透するべきである。
  9. fEPSP信号を得るために、脳スライスに低強度刺激(0.1msの30〜50 μA)を適用します。必要に応じて電極の位置を調整します(例えば、低いか、または非定型のfEPSP信号)。
  10. 入力出力曲線の記録を開始:30 sの間隔で脳スライスに増加する刺激強度を適用します。
  11. 刺激強度を最大fEPSP応答の50%に設定し、ベースラインfEPSPの録音を開始し、脳スライスに30秒間に20〜40分間の50%の刺激強度を適用します。
  12. ベースラインが安定しているように見える場合は、追加の記録(例えば、LTP /LTDプロトコルおよび/または薬物アプリケーション)を進めてください。(MPPでのLTP誘導では、ここでは5分間隔で適用される4回1s 100Hzパルスからなるプロトコルが使用された。ビキュクリンは、コンディショニング段階の10分前および調整段階で適用した。
    注: すべての録音は、適切なローパスフィルタリング(<5 kHz)とサンプリングレート(>10 kHz)を使用して、現在のクランプモードで実行する必要があります。
  13. 適切なファイル形式でデータを抽出し、ファイバー・ボレー、fEPSP 振幅、fEPSP スロープなどの fEPSP パラメーターを分析します。

7. 脳スライスのカルシウムイメージング記録

  1. 12ウェルチャンバーに1つの脳スライス半球を移し、適切なカルシウム染料で30分から1時間ロードします。12ウェルプレートの蓋に自作の穴(ホット18G針付き)を通してカルボゲネーションチューブを挿入することで、積載溶液を継続的にカーボゲネートします。
    注:このステップは、GCaMPなどの蛍光レポーターを内因的に発現する遺伝子組み換え動物からの脳スライス調製の場合には必要ありません。
  2. 手順 6.2 ~ 6.5 の説明に従って、録画のセットアップを準備します。
    メモ:マイクロフルメトリックイメージング実験には、アンプやマイクロマニピュレータは必要ありません。刺激装置の使用は実験に依存する。蛍光イメージング実験のための特定のソフトウェアが不可欠である。
  3. 正しいイメージング設定にソフトウェアを調整する:これには、カメラアンプとビニング設定、波長の設定、露光時間、タイミングプロトコルが含まれます。設定は正確な実験によって異なる場合があります。(トレース例としては、1 x 1 ビニング、2.4x プリアンプ ゲイン、300 EM カメラゲイン、488 nm で 50 ミリ秒の露光を実験の間 500 ミリ秒ごとに繰り返して使用しました。
  4. カルシウム染料をロードした後、脳スライス半球を12ウェルから記録室に移し、顕微鏡ステージに置きます。
  5. ペーパークリップ(図3A)またはステップ6.7に記載したものと同様の市販の脳スライスグリッドで記録チャンバー内のスライスを安定化させます。
  6. 対象領域が正しい顕微鏡分野に焦点を当てるようにしてください。
  7. 蛍光イメージングソフトウェアを使用して、スライス上の関心領域(ROI)を複数選択します。
    注:フォトブリーチによる明るさの一般的な変動に従うために、視野全体を選択すると便利です。
  8. 記録を開始し、選択した時点で実験用試験薬を適用します。
    注:各実験の最後に高いK+ 溶液を適用して、細胞の神経の特徴とスライスの品質を検証することをお勧めします。
  9. 適切なファイル形式でデータを抽出し、測定全体にわたってROIで発生する蛍光信号の変化を分析します。ROI は、オフライン解析中にも適合させることができます。
    注: 脳スライスにおけるfEPSP記録とカルシウムマイクロフルオリメトリーを記述する他のプロトコルは、文献24、32、33、34、35で利用可能です。

結果

プロトコルに必要なツールと重要な手順の概要
図2 は、このプロトコルに記載されているように、水平急性海馬脳スライスの調製に必要なすべてのツールと重要なステップを示しています。一般的に、いくつかの解剖ツールとスライス回収室(図2A)、実験室用水浴、およびビブラート(図2B)を含む、限られた数の主要な機器が必要です。 図 2C-E は、スライス調製プロトコル中に脳と半球の重要なステップと向きを視覚化します。 図2F は、水平脳スライスの予想結果を示す図である。

内側の穿角パスでのfEPSP録音
回復期間の後、脳のスライスは、fepspsの電気生理学的記録に使用することができます。ここでは、多チャンネル重力制御灌流システムを搭載した直立顕微鏡を用いた(図3Aおよび図3B)。ガラスマイクロピペット(〜2 MΩ)をACSF溶液で満たし、塩素化バス電極を用いた回路のオペアンプに取り付けられた塩化物被覆銀電極の上に取り付けました。fEPSPsを記録し、脳スライスの上層の海馬のMPPにガラスマイクロピペットを挿入することによって、アンプと適切な記録ソフトウェアで視覚化した。fEPSPsは、2接触クラスタマイクロ電極による刺激によって誘導され、記録電極のMPP上流に異なる電流強度を適用した。このプロトコルは、MPP の録音を取得する方法を説明することを目的としているのではなく、ここで説明するスライス準備プロトコルの成功を示す例として MPP の録音を使用するだけであることに注意してください。誰かがMPP記録を実行しようとする場合、適切な記録部位を確保し、MPPをLPP8、36、37と区別するために、特定の制御(例えば、ペアリングされたパルス録音)が必要になる可能性があります。

図3Cは、fEPSP記録の負(左パネル、低品質スライス)と正(右パネル、高品質のスライス)の例を示す。負の例のトレースは、実際の fEPSP 振幅 (≈0.5 mV) よりもさらに高い大きなファイバー・ボレー (FV) 振幅を示しています。対照的に、高品質のスライス例(右パネル)は、FEPSP比の小さいFVと高いfEPSP振幅(>0.5 mV)を示しています。ファイバー・ボレーは、刺激された神経線維の脱分極時に起こるシグナルであり、したがって、ポストナプティック増強(fEPSP)に先行する。FEPSPプロパティとFVの関係は、軸索およびシナプス特性の保存に関する重要な情報を提供する。無傷の神経線維を有する高品質のスライスは、FV比に対する高いfEPSP振幅を示す必要があります。逆に、伝導特性が損なわれている低品質のスライスは、FEPSP対FV比が低下します。同様に、脳スライスの生存率は、fEPSPの傾きと繊維のバレー振幅をプロットすることによって分析することができる(図3D)。

さらに、入力出力曲線(fEPSP傾きと刺激強度に対するFV振幅)は、スライスの品質を決定するために標準で使用されます。このような曲線は、脳スライスに増加する電流刺激を適用し、その後のfEPSP応答を監視することによって得られる。低品質の脳スライスは、保存状態の悪い脳組織の最適でない伝導特性による入力出力曲線の減少を示す(図3E,F)。さらに、シナプスプロセスの調査に理想的な刺激強度範囲を定義するために、入力出力曲線が必要です。理想的には、刺激強度は最大応答の強度の約50%を設定する必要があります。この選択された刺激強度では、fEPSP応答はシナプス可塑性の変化に対して非常に敏感であり、長期的な増強(LTP)と長期うつ病(LTD)の両方を調査する機会を提供する。

シナプス可塑性を研究するために、選択された50%の刺激強度での脳スライス(fEPSPスロープ)のシナプス透過を、コンディショニング段階の前に長い期間(通常は20〜40分間)監視します。実行可能な脳スライスは安定したベースラインを持ちますが、不安定なベースラインを持つ脳スライスは、脳回路のシナプス可塑性を研究するために、さらなるコンディショニングプロトコルに使用することはできません(図3G、上部パネル)。fEPSPベースライン記録は、シナプス透過自体に対する薬物効果を監視するためにも有用である(図3G、下部パネル)。記録されたfEPSPベースライン信号の平均は、通常、fEPSP時間経過を正規化するために使用され、標準で100%に設定されています。

シナプス可塑性は、脳スライスに特定のコンディショニングプロトコルを適用することによって研究することができます。これらのプロトコルは、調査された脳回路と関心のメカニズム(例えば、LTPまたはLTD)に依存する。デンテート回のMPPにLTPを誘導するためには、MPPシナプス38に存在する強力なGABAergic阻害のために強力なコンディショニングプロトコルが必要である。GABAergic阻害は、高スクローススライス溶液39で調製した脳スライスにおいてさらに顕著であると報告されている。ここでは、GABAA 受容体拮抗薬ビキュクリンで処理しながら5分間隔で適用される1秒長い100Hzパルスの4つの刺激からなるプロトコルを使用する(図3H)。コンディショニング期間中にNMDAとビクキュリンを併せて添加すると、LTPが増加する(図3H)。スライスの低品質と不安定なシナプス伝達(fEPSPベースライン)は、LTPおよびLTD誘導の変更または失敗をもたらす可能性があります。したがって、高品質のスライス準備を行い、厳密な除外基準(繊維ボレー比(<3)のfEPSP振幅が低い)、小さなfEPSP傾斜(<0.5 mV/ms)または振幅(<0.5 mV)および不安定なfEPSPベースライン(5%以上の変化)を使用することが非常に重要です。シナプスプロセスを調査する際の、不可能なスライス用。

デンテート回の顆粒細胞層におけるマイクロ蛍光測定
回復後、脳スライスを、光から遮蔽したカルボゲン化ASCFで1時間、カルシウム感受性染料2μMで室温でインキュベートした。このスライスを、多チャンネル重力制御灌流システムを搭載した直立蛍光顕微鏡上の記録チャンバー(図3A)に移した。蛍光発光画像は、488nmでの照射後500ミリ秒ごとに取得した(図4A,B)。励起はキセノンランプで行われ、スキャナーは回折格子を取り付け、画像取得はコンピュータ制御のCCDカメラで行った。測定の間、スライスをNMDA受容体アンタゴニストAPVで処理し、その結果、細胞内カルシウム濃度が低下した。高カリウム濃度(50mM)を含む細胞外溶液を用いたスライスの刺激は、ニューロンの脱分極と電圧ゲートイオンチャネルの開口による細胞外カルシウムの大量流入をもたらした(図4C)。

化合物濃度 (mM)分子量 (g/mol)金額 (g)
KCl2574.551.86
CaCl2 * 2H2O20147.012.94
MgSO4 * 7H2O10246.482.46
KH2PO4 12.5136.081.7

表1:10×スライス前溶液(1L)。

化合物濃度 (mM)分子量 (g/mol)金額 (g)
ナクル12558.447.3
KCl2.574.550.19
CaCl2 * 2H2O21 M CaCl2 ソリューションから2 mL
MgSO4 * 7H2O11 M MgSO4 溶液より1 mL
NaH2PO4 * 2H2O1.25156.020.2
ナフコ3 2684.012.18
グルコース * H2O25198.174.95

表 2: 1x ACSF (1 L) (305~315 mOsm の間の浸透性)

化合物濃度 (mM)分子量 (g/mol)金額 (g)
10x スライス解像度該当する該当する25 mL
蔗糖252342.321.57
ナフコ3 2684.010.55
グルコース * H2O10198.170.49

表3:1x高スクローススライス溶液(250mL)(320〜325mOsm間の浸透性)。

figure-results-6469
図2:水平海馬脳スライスの調製に関する詳細情報。(A) げっ歯類の脳の解剖と切断に必要なツールの画像: (a) 長さ ±2cm、フィルターペーパーの幅±0.5cm幅(例えば、グレード413)(b) ブレード;(c) スーパーグルー;(d) ピペットチップ;(e)標本プレート(ビブラートメが付属);(f) 35 mm の培養皿。(g)細かいブラシ。(h) へら;(i) 湾曲した鉗子;(j) 解剖はさみ;(k)強いはさみ(10cm以上の刃の長さ)。(l)プラスチック製のパスツールピペット、広い開口部(直径0.6〜0.8cmの間)。(m)回復室(250 mLビーカー、プラスチックリング、ナイロンメッシュ、10 mL血清ピペットの一部で自作)。(n)冷蔵培養皿の上に氷と(o)ろ紙の正方形で満たされた90mmの培養皿。(B) 氷で満たされたスライスチャンバーの(a)ホルダーを持つビブラートメの画像;(b) スライスチャンバー(c)カルボゲンラインおよび(d)スライスカミソリブレード。(C)横スライスのために脳を準備するために1つの半球の後側のカットの向きを示す漫画(ステップ3.9を参照)。(D)ビブラートメの標本プレート上の脳の向きの等角投影。(E)標本プレート上の2つの半球の位置の上面図を示す漫画。(F)横脳スライスで海馬の位置を示す漫画。海馬のデンテート回(DG)と コルヌアンモニス (CA)-スビキュラム(SB)領域が示されている。(G) 10 スライスされた新しい水平脳スライスを含むカーボゲン化 ACSF を持つ回復室の画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7576
図3:海馬脳切片の電気生理学的記録。(A)直立した顕微鏡下で使用される、灌流と吸引を伴う記録室の画像。脳のスライスはチャンバーに配置され、録音の開始前にペーパークリップの一部で固定化されます。(B) 直立した顕微鏡下での海馬脳スライスの明視野画像(10倍の目的)。デンテート回(DG)およびCA3領域は、fEPSPの記録中の内側穿刺経路を標的とする刺激(左下)および記録(右下)電極と同様に示される。(C)左:堅牢なファイバーボレーと小さな振幅を持つfEPSP記録の低品質スライス例の表現。右:fEPSP記録の高品質スライス例。灰色の線はベースラインレベルを示します。点線は、0.5 mVのカットオフ振幅を示します。(D) fEPSP スロープと FV 振幅のプロット (黒; n =10) および低品質の脳スライス (グレー; n =4)SEM±平均として表されるデータ(E)高品質スライス(黒;n = 10)と低品質スライス(グレー;n = 4)の異なる刺激強度(μA)の入力出力プロット(fEPSPスロープ)(F)(E) と同じですが、FV 振幅と刺激強度の比較を行います。(G)3つの異なるベースラインfEPSP記録の時間経過(fEPSPの傾き%;最初の5分の平均fEPSP傾きに正規化)。上側のパネルは正(黒)と負(赤)の例を表し、後者は記録中にカルボーゲンが失われたために不安定なベースラインを有する。下段のパネルは、治療中の2つの安定したベースライン記録を示しています(安定ベースラインの20分後、AMPA受容体はAMPA受容体拮抗薬DNQX(10μM))の適用によってブロックされた)および未処理の状態(黒)。。(H)異なる治療条件(下部パネルで示される)のためのLTP記録の時間経過。コンディショニング時のビキュリン(20μM)の塗布用黒色、コンディショニング中のビキュリン(20μM)とNMDA(10μM)の共同適用にブルー。上部パネルの矢印は、高周波刺激が適用された時点を示します(4 x 1s of 100Hz)。下のパネルの棒グラフは、平均fEPSPの傾き(%)を表します上部パネルに示されている実験のLTP誘導後50〜60分間(各条件の単一の代表的な記録)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8969
図4:海馬の脳スライスのカルシウム-マイクロフルオリメトリー.(AおよびB)蛍光画像(488nmで励起)(A)とマウス脳の水平海馬脳スライスの対応するヒートマップ(B)。デンテート回(DG)、CA3領域、および関心領域(ROI)の一例は、NMDA受容体アンタゴニストAPV(50μM)および細胞外カリウム(50μM)を含む高い細胞性カリウム(50μM)を用いた治療中の急性海馬脳スライスのデンテートジのROIからのカルシウム応答の時間経過(F488nm)および高細胞カリウム(50μM)を含む溶液で示されている。トレースは、高K+灌流中の最も高いカルシウム応答に正規化され、光漂白のためにベースライン補正されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

一般的に神経科学コミュニティの間で使用されていますが, 脳スライスの準備もいくつかの欠点に直面しています。.例えば、関心のある脳領域への入出力接続は、もはや脳スライスに接続されていません。さらに、一度単離されると、組織は時間の経過とともにゆっくりと分解し始め、このプロセスは脳スライスの生理学的条件を変える可能性がある。特に、ほとんどの脳スライスの記録は数分から数時間かかるため、実験開始前に6~8時間まで隔離された組織での記録を行う実験日が長くなるため、このトピックは非常に重要です。さらに、脳脊髄液および血液循環は、スライス調製中に中断され、脳スライス内の重要な内因性化合物の不足につながる可能性がある。そして最も明らかに、スライス手順自体は、得られた結果を損なう可能性のある機械的組織損傷を引き起こす可能性があります。しかし、脳スライス製剤の実際の利点は、まだ彼らの欠点を上回っているので、彼らは神経科学研究で高く評価され、採用された技術を提示する理由です。

急性海馬脳スライスは、分子レベルから複雑な脳回路研究までのニューロンプロセスを調査するために強力で広く使用されている技術を提示します。これは、スライス調製18で容易に保存することができる海馬の理想的な神経解剖学に基づいている。その結果、海馬の脳スライスは、薬物スクリーニング17、認知機能に関与する神経およびシナプス特性の研究、および病的な脳状態14、42、43の調査を含む、多種多様な科学的研究プロジェクトで使用される。しかし、さまざまな用途の広いスペクトルはまた、解剖条件や切断面の向きなど、さまざまなパラメータで異なる使用可能なスライス調製プロトコルの広い範囲を引き起こします。したがって、科学プロジェクトの正確な研究問題は、適切なスライス調製プロトコルを選択するために決定されなければならない。

組織チョッパーは、海馬の脳スライス44、45を準備するために最も古くから使用される技術の1つを提示する。この調製方法の主な利点は、チョッパーの低コストと高速かつ簡単に使用46を含む。しかし、組織チョッパーは、形態学的変化および細胞死をもたらす機械的ストレスを引き起こす47。それに比べて、ビブラートは高価な機械であり、スライスの準備の時間が大幅に増加し、スライスの品質に影響を与える可能性があります。しかし、ビブラートメは通常、組織からスライスを分離するより穏やかな方法を提供し、脳を正常に冷却し、全体の分離手順にわたって酸素化し、それによってスライス特性46を改善することを可能にする。したがって、いくつかのグループは、標準的にこの技術を採用しており、ビブラートメ16、30、48を使用して急性海馬脳スライスの調製のためのプロトコルを前進させました。いくつかのプロトコルはスライス自体の詳細を提供するが、むしろそのようなスライス準備48の特定のアプリケーションに焦点を当てるが、他の人は、この記事27、30で与えられた切断面または他のプロトコルの詳細(例えば、アガロース埋め込みまたはスライス/回復ソリューション)で異なる詳細なスライスプロトコルを提供する。

ここで説明するプロトコルは、若い動物から高品質の急性水平海馬マウス脳スライスを調製するための簡単な方法を提示する。このプロトコルは、海馬皮質から海馬8、49、50に向かう海馬入力経路を示す穿角経路(内側および外側)を保存するのに特に有用である。射手、冠状動脈、ならびに孤立した海馬横スライス製剤は、主に内皮質の層IIおよびVに由来する穿角経路を適切に保存せず、海馬18内のいくつかの領域にプロジェクトする。海馬に関する内皮質の解剖学的位置決めのために、水平脳スライスはスライス調製31内の完全に無傷の穿形経路繊維を維持するために必要である。さらに、水平スライスは、理想的には、海馬9、30、50内のCA3ニューロンにデンテート回から投影する苔状の繊維を保存します。したがって、この調製方法は、海馬の入力経路およびDG関連プロセスを調査する研究にとって価値が高い。さらに、このプロトコルは、シャファー担保経路50の調査を可能にする。しかし、矢状および冠状脳スライス製剤は、CA3からCA1繊維投影を調査する際により一般的に使用され、おそらく高品質のスライスを得る可能性を高めることができるわずかに速い準備時間のために使用される。それにもかかわらず、水平海馬スライス製剤は、1つのスライス半球内のすべての海馬繊維経路の保存および調査を可能にするので、強力な研究ツールを提示する。これは、例えば、マルチ電極アッセイ記録において、回路応答が研究される場合に特に有用であり得る。

脳のスライスを準備するときの主な懸念は、脳組織の適切な保存です。これは、速い解剖、組織の連続的かつ十分な酸素化および冷却、および低ナトリウム、高スクローススライス溶液39、51を用いた保護切断法を用いた脳組織の保護を含む、我々のプロトコルのいくつかの重要なステップによって達成される。ここで説明するプロトコルが約90%の成功率をもたらすという事実にもかかわらず、古いまたは遺伝的に多様な動物に由来する組織を扱うとき、または特定の細胞集団を保存しようとする場合には、潜在的に追加の保護ステップが必要になる可能性があります。いくつかの方法は、敏感な脳組織の準備を保護するために既に報告されました。.これらの方法には、ナトリウム透過性52を低減するためのNMDGベースのスライス溶液の使用、NMDA受容体活性53を遮断するためにスライス溶液中で高マグネシウムレベルを使用すること、および回復期間23中にも保護溶液の長期使用が含まれる。これらの措置のすべては、減少する興奮毒性をもたらす。さらに、氷冷保護ACSF溶液を用いた心間灌流は、古い動物27と一緒に作業する際にしばしば採用され、必要である。

急性海馬脳スライスは、ノイズ比11に対する高い信号を保証する比較的厚い(300〜500μm)の急性脳スライスから得ることができる高振幅信号などの理由から、電気生理学的研究に理想的かつ広く使用される。標準的に使用される電気生理学的用途には、電圧または電流クランプモードでの細胞外フィールド記録および細胞内全細胞記録が含まれる。高品質の電気生理学的データを取得するために、スライスの健康は、提示されたプロトコルに厳密に従うことによって、第一の関心事であり、保証することができます。ただし、スライスの準備は高感度な手法を提示するので、各実験の開始前に品質チェックを定期的に含める必要があります。いくつかのパラメータは、スライスの品質チェックとして使用することができ、標準では入力出力曲線とベースラインfEPSPまたはEPSC記録19を介して評価されます。それにもかかわらず、電極位置決め、配向、あるいは損傷などの実験的エラーから生じ得る、しかも、調製されたスライスの健康状態を表すものではない。したがって、40xの目的またはDAPI核染色の下で細胞の簡単な視覚化および評価のような追加の品質管理を行うことを推奨する。このような品質チェックを使用して、複数のスライス準備セッションで一定のスライスの正常性を確認できます。

カルシウムマイクロフルオリメトリーは、海馬の脳スライスを研究するためにあまり一般的に使用される技術を提示します。しかし、この技術は、細胞内および細胞内の電極記録に追加的な価値があり、神経およびシナプスシグナル伝達において重要である細胞内カルシウムフラックスを視覚化および定量化することができる。細胞内カルシウム濃度の変化は、神経伝達物質の小胞放出、過敏性の潜在的発生、シナプス可塑性および軸索神経伝導の調節54、55、56に関与している。この技術の例として(図4)、市販のカルシウム染料を利用しました。間違いなく、カルシウム染料による組織スライスの治療は、実験的な時間枠の増加や、低位置ニューロン細胞の非効率的なローディングなどの困難を生み出す可能性があります。しかし、この技術のバリエーションは、これらの技術的な課題を回避するために使用することができます。例えば、海馬のスライスでカルシウム測定とパッチクランプの記録を組み合わせることが可能です。このようにして、カルシウム蛍光色素をパッチピペットを介して特定の細胞にロードすることができ、関心のある1つの特定の細胞におけるカルシウムダイナミクスの測定を可能にする57。あるいは、カルシウム指標を発現する遺伝子操作動物、GCaMP58は、脳全体で、または細胞特異的な促進器によって駆動され、使用され得る。興味深いことに、GCaMP動物から関心のあるタンパク質への直接リンカーを持つ脳組織は、ニューロン発現パターンを決定したり、カルシウム火花や波への関与を調査する機会を提供する可能性があります。

全体として、我々は、電気生理学的およびイメージング記録のためのマウスからの健康で実行可能な水平海馬脳スライスの成功した準備のためのガイドラインを提供する。この方法論は、歯状回に記載されている脳病理で起こる神経学的変化にアクセスするのに非常に有用である。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

KEIMPE Wierda博士とジョリス・デ・ウィット教授の監督の下、VIB-KUルーヴェン脳疾患研究センターの電気生理学ユニットに感謝します。さらに、私たちは、イオンチャネル研究所とKUルーヴェンの子宮内膜症、子宮内膜症および生殖医学の研究室のすべてのメンバーに、彼らの有益な議論とコメントに感謝します。

このプロジェクトは、研究財団フランダース(G.084515NおよびG.0B1819NからJ.V.)とKUルーヴェンの研究評議会(C1-資金調達C14/18/106からJ.V.)から資金を受け取っています。K.P.はFWO[PEGASUS]2マリー・スクウォドフスカ・キュリー・フェローで、研究財団フランダース(FWO)(12T0317N)とマリー・スクウォドフスカ・キュリー交付契約(665501)に基づく欧州連合(EU)のホライゾン2020研究イノベーションプログラムから資金を受け取りました。K.H.はベルギーのフランダース研究財団の博士研究員です(12U7918N)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia chamberhome made - GenericN/Aplexiglas
Anesthesia vaporizerDräger & MSS International LtdIsoflurane Vapor 19.3 & MSS Isofluraneto vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion systemTERUMOHypodermic syringes without needlehttps://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodidehellobioHB0893https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillariesScience ProductsGB150F-8Phttps://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrateMerck102382https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging softwareTill PhotonicsLiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tankAir LiquideAlphagaz mix B50Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrodeFHCCE2C55https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm)Corning Life Sciences353001https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm)Thermo Fisher Scientific101VR20https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forcepsFine Science tools11270-20https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5hellobioHB0225https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrateSigma Aldrich16301https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS cameraHAMAMATSUORCA-spark C11440-36Uhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissorsFine Science tools14058-09https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQXhellobioHB0262https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD cameraAndoriXon TM + DU-897E-CSO-#BVhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp AmplifierHEKA Elektronik895278https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paperVWR516-0818grade 413
Fine brushRaphael Kaerell8204Size #1
18G needleHenke Sass Wolf Fine-Ject18G X 1 1/2" 4710012040https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
IsofluraneDechra Veterinary ProductsIso-Vet 1000mg/g250 ml bottle
Loctite 406Henkel Adhesive technologiesLoctite 406Super glue
Magnesium sulfate heptahydrateMerck105886https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MicromanipulatorLuigs & NeumannSM-10 with SM-7 remote control systemhttps://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging)OlympusBX51WIhttps://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings)ZeissAxio Examiner.A1https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light sourceCAIRN Researchdual OptoLed power supplyhttps://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
MonochromatorTill PhotonicsPolychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)Sigma AldrichM3262https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1Invitrogen Molecular Probes#0680710x50ug
OsmometerWescor5500 vapor pressure osmometerto verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pumpThermo Fisher ScientificMasterflex C/L 77120-62https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meterWTWinoLab series pH 720https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette pullerSutter InstrumentP-1000https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chloridChem-labCL00.1133https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheresSPI suppliesSafety Cartridge Dispenser - Pkg/10GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratomeTed Pella Inc121-6double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamberhome made - GenericN/Ato collect and store brain slices in (see details in manuscript)
ScissorsAny companyN/ABlade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wireAny companyfor recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrateMerck106342https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonateAlfa Aesar14707https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chloridFisher ScientificS/3160/60https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordingsHEKA ElektronikPatchMasterhttps://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
SpatulaSigma AldrichS9147-12EAhttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
StimulatorA.M.P.IISO-FLEXhttp://www.ampi.co.il/isoflex.html
SucroseVWR International Ltd.102745Chttps://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1Warner Instruments64-0167Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2Fisher Scientific800/100/200 & 800/100/280Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pumphome made - GenericN/A
8 valve multi-barrel perfusion systemhome madeN/Aconsists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines)NResearch Inc.p/n 161P011https://nresearch.com/
VibratomeLeica14912000001Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bathMemmertWNB 7https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification systemMerckSynergy milliporeto obtain highly purified water
12-well platesGreiner Bio-OneCELLSTAR, 665180http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

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