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  • Discusión
  • Divulgaciones
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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este documento describe métodos para la preparación de tejidos, tinción y análisis de papilas gustativas completas fungiformes, circunvaladas y del paladar que producen consistentemente papilas gustativas enteras e intactas (incluidas las fibras nerviosas que las inervan) y mantienen las relaciones entre las estructuras dentro de las papilas gustativas y la papila circundante.

Resumen

Las papilas gustativas son colecciones de células transductoras del gusto especializadas para detectar subconjuntos de estímulos químicos en la cavidad oral. Estas células transductoras se comunican con las fibras nerviosas que llevan esta información al cerebro. Debido a que las células transductoras del gusto mueren continuamente y son reemplazadas a lo largo de la edad adulta, el entorno de las papilas gustativas es complejo y dinámico, lo que requiere análisis detallados de sus tipos de células, sus ubicaciones y cualquier relación física entre ellas. Los análisis detallados se han visto limitados por la heterogeneidad y la densidad del tejido lengüístico que han reducido significativamente la permeabilidad de los anticuerpos. Estos obstáculos requieren protocolos de seccionamiento que resultan en la división de las papilas gustativas en todas las secciones para que las mediciones solo se aproximen y se pierdan las relaciones celulares. Para superar estos desafíos, los métodos descritos en este documento implican la recolección, obtención de imágenes y análisis de papilas gustativas completas y cenadores terminales individuales de tres regiones gustativas: papilas fungiformes, papilas circunvaladas y el paladar. La recolección de papilas gustativas completas reduce el sesgo y la variabilidad técnica y se puede usar para informar números absolutos de características que incluyen el volumen de las papilas gustativas, la inervación total de las papilas gustativas, los recuentos de células transductoras y la morfología de los cenadores terminales individuales. Para demostrar las ventajas de este método, este documento proporciona comparaciones de los volúmenes de papilas gustativas e inervación entre las papilas gustativas fungiformes y circunvaladas utilizando un marcador general de papilas gustativas y una etiqueta para todas las fibras gustativas. También se proporciona un flujo de trabajo para el uso del etiquetado genético de células dispersas de las neuronas del gusto (con subconjuntos etiquetados de células transductoras del gusto). Este flujo de trabajo analiza las estructuras de los cenadores individuales del nervio del gusto, los números de tipo de célula y las relaciones físicas entre las células utilizando un software de análisis de imágenes. Juntos, estos flujos de trabajo proporcionan un enfoque novedoso para la preparación y el análisis de tejidos tanto de papilas gustativas completas como de la morfología completa de sus cenadores inervantes.

Introducción

Las papilas gustativas son colecciones de 50-100 células epiteliales especializadas que se unen a subconjuntos de estímulos químico-gustativos presentes en la cavidad oral. En general, se cree que las células transductoras del gusto existen como tipos1,2,3,4,5, 6,7,8,9,inicialmente basadas en criterios de microscopía electrónica que luego se correlacionaron con marcadores moleculares. Las células tipo II expresan fosfolipasa C-beta 2 (PLCβ2)2 y receptor transitorio potencial del canal catiónico, subfamilia M miembro 51 e incluyen células que transducen dulce, amargo y umami1,10. Las células tipo III expresan anhidrasa carbónica 4 (Car4)11 y proteína asociada a sinaptosomal 258 y denotan células que responden principalmente al sabor agrio11. Las células que transducen salinidad no han sido tan claramente delineadas12,13,14,pero potencialmente podrían incluir las células Tipo I, Tipo II y Tipo III15,16,17,18,19. El entorno de las papilas gustativas es complejo y dinámico, dado que las células transductoras del gusto giran continuamente a lo largo de la edad adulta y son reemplazadas por progenitores basales3,20,21. Estas células transductoras de sabor se conectan a las fibras nerviosas pseudounipolares de los ganglios geniculados y petrosales, que pasan la información del gusto al tronco encefálico. Estas neuronas se han categorizado principalmente en función del tipo de información gustativa que llevan22,23 porque la información sobre su morfología ha sido esquiva hasta hace poco24. Las células de tipo II se comunican con las fibras nerviosas a través de la proteína moduladora de la homeostasis del calcio 1 canales iónicos25,mientras que las células de tipo III se comunican a través de las sinapsis clásicas8,26. La caracterización adicional de las células de las papilas gustativas, incluidos los linajes de tipo celular transductores, los factores que influyen en su diferenciación y las estructuras de conexión de los cenadores son todas áreas de investigación activa.

Los estudios de papilas gustativas se han visto obstaculizados por varios desafíos técnicos. Los tejidos heterogéneos y densos que componen la lengua reducen significativamente la permeabilidad de anticuerpos para la inmunohistoquímica27,28,29. Estos obstáculos han requerido protocolos de seccionamiento que resultan en la división de las papilas gustativas entre secciones para que las mediciones se aproximen en función de secciones representativas o se sumen entre secciones. Anteriormente, se han utilizado secciones delgadas representativas para aproximar tanto los valores de volumen como los recuentos de células transductoras30. La sección en serie más gruesa permite obtener imágenes de todas las secciones de papilas gustativas y la suma de las mediciones de cada sección31. Cortar secciones tan gruesas y seleccionar solo papilas gustativas enteras sesga el muestreo hacia papilas gustativas más pequeñas32,33,34. Las estimaciones de la inervación nerviosa de las papilas gustativas seccionadas se han basado en análisis de los números de píxeles13, 35,si se cuantifican en absoluto36,37,38. Estas mediciones ignoran por completo la estructura y el número de cenadores nerviosos individuales, porque los cenadores están divididos (y generalmente mal etiquetados). Por último, aunque pelar el epitelio permite teñir papilas gustativas enteras39,40, también elimina las fibras nerviosas de las papilas gustativas y podría interrumpir las relaciones normales entre las células. Por lo tanto, las investigaciones de las relaciones estructurales dentro de las papilas gustativas han sido limitadas debido a esta interrupción causada por los enfoques de tinción.

La recolección de estructura completa elimina la necesidad de secciones representativas y permite la determinación de mediciones de valor absoluto de volúmenes, recuentos celulares y morfologías de estructura41. Este enfoque también aumenta la precisión, limita el sesgo y reduce la variabilidad técnica. Este último elemento es importante porque las papilas gustativas muestran una variabilidad biológica considerable tanto dentro de34,42 como entre las regiones43,44, y los análisis completos de papilas gustativas permiten comparar el número absoluto de células entre las condiciones de control y experimentales. Además, la capacidad de recoger papilas gustativas intactas permite el análisis de las relaciones físicas entre las diferentes células transductoras y sus fibras nerviosas asociadas. Debido a que las células transductoras del gusto pueden comunicarse entre sí45 y comunicarse con las fibras nerviosas46,estas relaciones son importantes para la función normal. Por lo tanto, las condiciones de pérdida de función pueden no deberse a una pérdida de células, sino a cambios en las relaciones celulares. Aquí se proporciona un método para recolectar papilas gustativas completas para lograr los beneficios de las mediciones absolutas para refinar los análisis de volumen tanto para las papilas gustativas como para sus inervaciones, recuentos y formas de células gustativas, y para facilitar los análisis de las relaciones de las células transductoras y las morfologías nervio-cenador. También se presentan dos flujos de trabajo aguas abajo de este nuevo método de montaje completo para la preparación de tejidos: 1) para analizar el volumen de las papilas gustativas y la inervación total y 2) para el etiquetado genético de células dispersas de las neuronas del gusto (con subconjuntos de células transductoras del gusto marcadas) y los análisis posteriores de la morfología del cenador del nervio gustativo, el número de tipos de células gustativas y sus formas, y el uso de software de análisis de imágenes para analizar las relaciones físicas entre las células transductoras y las que se producen entre la transducción. células y sus cenadores nerviosos. Juntos, estos flujos de trabajo proporcionan un enfoque novedoso para la preparación de tejidos y para el análisis de papilas gustativas completas y la morfología completa de sus cenadores de inervación.

Protocolo

NOTA: Todos los animales fueron atendidos de acuerdo con las pautas establecidas por la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el Cuidado y Uso Humanitario de animales de laboratorio y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones Phox2b-Cre (cepa MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) o ratones TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg)fueron criados con ratones reporteros tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 fueron criados con Phox2b-flpo48 y Ai65. Para las inyecciones de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU), se preparó la EdU y se calcularon las dosis según Perea-Martinez et al.49.

1. Preparación de materiales

  1. Preparación de soluciones
    1. Disolver 5.244 g de fosfato de sodio monobásico y 23.004 g de fosfato de sodio dibásico en agua de doble destilación (ddH2O) en una placa de agitación. Ajuste el pH a 7.4 y lleve el volumen total para obtener 1 L de tampón de fosfato de sodio (PB) de 0.2 M.
    2. Disuelva el paraformaldehído en ddH2O en una campana extractora de humos calentando mientras se agita en una placa de agitación hasta que la solución alcance los 90 °C. Añadir 4 M de solución de NaOH gota a gota para limpiar el paraformaldehído, y filtrar la solución utilizando un matraz Erlenmeyer al vacío y un filtro cerámico con papel de filtro. Agregue un volumen igual de 0.2 M PB y ajuste el pH a 7.4 para obtener 4% de PFA en 0.1 M PB.

2. Preparación de tejidos

  1. Recolección de tejidos
    1. Sacrifique ratones utilizando una sobredosis anestésica con una solución de trabajo que contiene 10 ml de solución salina estéril y 0,25 ml de una solución madre que contiene 5 g de 2,2,2-tribromoetanol y 5 ml de alcohol terc-amílico. Perfusa transcárdica con 4% de PFA en 0,1 M PB; quitar la lengua y el paladar.
    2. Aislar las papilas gustativas circunvaladas utilizando un corte coronal que separa la lengua posterior, detrás de la eminencia intermolar; cortar las papilas gustativas con una cuchilla de afeitar; y luego dividir la lengua anterior en la línea media. Post-fijación durante la noche a 4 °C con 4% de PFA en 0,1 M PB.
    3. Crioproteger el tejido en sacarosa al 30% durante la noche a 4 °C.
      NOTA: El tejido se puede congelar en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) utilizando 2-metilbutano enfriado en un vaso de precipitados sobre hielo seco y almacenado a -80 ° C si el procedimiento debe detenerse aquí.
  2. Papilas gustativas fungiformes
    1. Enfríe el 2-metilbutano en un vaso de precipitados sobre hielo seco en preparación para el paso 2.2.8.
    2. Descongelar y enjuagar la lengua en 0,1 M PB. Coloque la mitad de la lengua anterior que contiene las papilas fungiformes en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de disección.
    3. Use fórceps contundentes y tijeras de disección para extirpar el músculo. Use fórceps de extremo romo para mantener el tejido abierto a medida que el epitelio lingual está curvado, y asegure una orientación plana manteniendo las cuchillas de las tijeras de disección gruesas paralelas al epitelio.
    4. Deseche el epitelio ventral no queratinizado de la lengua, ya que no contiene papilas gustativas.
    5. Use tijeras de disección finas para una disección más cercana a la parte inferior del epitelio queratinizado.
      NOTA: Es importante diseccionar cerca del epitelio para que el músculo restante sea de grosor uniforme y la superficie sea lisa para garantizar una penetración uniforme de anticuerpos. La consecuencia del grosor no uniforme del músculo restante será una sección desigual en el criostato, con exposición del epitelio en áreas con menos músculo y una capa más gruesa de músculo para otras áreas, lo que impide la penetración de anticuerpos.
    6. Use las pinzas de extremo romo para colocar un pedazo de epitelio en un molde de tejido (lado muscular hacia abajo) y asegúrese de que quede plano. Una vez que el tejido esté plano, agregue una gota de OCT al tejido.
      NOTA: Dado que la punta de la lengua es curva, puede ser necesario hacer un corte en el epitelio donde está curvada para que el tejido se pueda hacer que quede plano.
    7. Coloque el molde de tejido sobre una base de metal (previamente enfriada en hielo seco) debajo del endoscopio de disección. Continúe golpeando el tejido ligeramente con las pinzas hasta que la OCT se haya congelado para asegurarse de que el tejido se congele lo más plano posible.
    8. Una vez que el OCT se haya congelado, agregue rápidamente OCT adicional y coloque el molde en un vaso de precipitados de 2-metilbutano (enfriado en hielo seco) hasta que se congele.
    9. Seccionamiento de criostatos
      NOTA: El criostato se utiliza para la extracción fina del tejido subcutáneo restante, lo que puede inhibir la penetración de anticuerpos(Figura 1).
      1. Monte los moldes OCT en el criostato y corte secciones de 20 μm. Recoja cada sección y visualícela bajo el microscopio de luz para evaluar su proximidad a la base del epitelio(Figura 1E - H).
      2. Después de afeitar el tejido de la parte inferior del epitelio, descongele el epitelio y enjuáguelo dos veces en 0,1 M PB en una coctelera.
  3. Papilas gustativas circunvaladas
    1. Usando un corte coronal con una hoja de afeitar, separe la papila circunvalada de la lengua anterior. Use dos cortes parasagitales con la misma cuchilla de afeitar para extirpar el tejido lateral a la papila bajo un endoscopio de disección. Coloque la papila en un molde de tejido usando fórceps de modo que un borde lateral de la papila circunvalada se enfrente a la parte inferior del molde de tejido.
      NOTA: El tejido se puede congelar en OCT utilizando 2-metilbutano enfriado en un vaso de precipitados sobre hielo seco y almacenado a -80 ° C si el procedimiento debe detenerse aquí.
    2. Cortar el tejido en secciones flotantes de 90 μm en el criostato.
  4. Papilas gustativas en el paladar
    1. Cortar el paladar duro anterior a la unión del paladar blando y duro (Figura 2). Use tijeras para separar el paladar blando del tejido subyacente, asegurándose de que se corten los fragmentos de hueso restantes. Extirpar músculo adicional y tejido conectivo.
      NOTA: Una vez eliminado, todo el tejido que queda consistirá en glándulas y tejido conectivo suelto, que se adhieren ligeramente a la parte inferior del paladar.
    2. Sostenga el paladar con fórceps de extremo romo y retire las glándulas restantes y el tejido conectivo suelto raspándolos suavemente con una cuchilla de afeitar.
      NOTA: El tejido se puede congelar en OCT utilizando 2-metilbutano enfriado en un vaso de precipitados sobre hielo seco y almacenado a -80 ° C si el procedimiento debe detenerse aquí.

3. Tinción inmunohistoquímica

  1. Lavar los pañuelos con 0,1 M pb, 3 x 15 min. Coloque los tejidos en tubos de 1 ml con solución bloqueadora (suero de burro al 3%, surfactante no iónico al 0,5% (consulte la Tabla de materiales),0,1 M PB) a 4 °C durante la noche.
  2. Retire la solución bloqueadora e incube el tejido en anticuerpo primario (conejo anti-PCLβ2) en solución de anticuerpos (0,1 M PB, surfactante no iónico al 0,5%) durante 5 días a 4 °C.
  3. Lavar con 0,1 M pb, 4 x 15 min cada lavado, e incubar en el anticuerpo secundario anti-conejo 488 de burro (1:500) en solución de anticuerpos durante 2 días a 4 °C.
  4. Lavar con 0,1 M pb, 4 x 15 min cada lavado, y bloquear con suero de conejo normal al 5% en solución de anticuerpos.
  5. Lavar con 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incubar con el anticuerpo bloqueador anti-conejo de burro (20 μg/ml) en solución de anticuerpos durante 2 días a 4 °C.
  6. Lavar con 0,1 M pb, 4 x 15 min cada lavado, y luego incubar con anticuerpo primario dsRed (conejo) conjugado a una etiqueta fluorescente (según las instrucciones del fabricante) en una solución de anticuerpos durante 5 días a 4 °C.
  7. Lavar con 0,1 M pb, 4 x 15 min cada lavado, y luego incubar con anticuerpo primario (cabra anti-Car4 (1:500)) en solución de anticuerpos durante 5 días a 4 °C.
  8. Lavar con 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavado. Incubar con anticuerpo secundario burro anti-cabra 647 (1:500) en solución de anticuerpos durante 2 días a 4 °C.
  9. Lavar con 0,1 M PB, 4 x 15 min cada lavado, y montar (lado epitelial hacia arriba) en medios de montaje acuosos, y colocar una cubierta sobre la sección de tejido.
    NOTA: Si usa anticuerpos de diferentes especies, como en el caso de queratina-8 y dsRed solamente, agregue todos los anticuerpos primarios a la solución de anticuerpos en el paso 3.2 y todos los anticuerpos secundarios en el paso 3.3 antes de continuar con el paso 3.9.

4. Imagen confocal y deconvolución

  1. Capture imágenes confocales utilizando un microscopio confocal con un objetivo de 60x (apertura numérica = 1.40), 4 ms / píxel, zoom de 3, Kalman de 2 y tamaño de 1024 x 1024. Seleccione un tamaño de paso de 0,47 mm a lo largo del eje z. Para capturar la inervación de la papila, use un zoom de 2.5 si el campo de visión con un zoom de 3 es demasiado estrecho para capturar toda la inervación a la papila.
  2. Para desenredar las imágenes, tenga en cuenta que algunas configuraciones se importarán automáticamente con la imagen; por lo tanto, complete los detalles restantes para la modalidad, la lente del objetivo, la apertura numérica, el medio de inmersión, el medio de muestra y los fluoróforos capturados en la imagen. A continuación, seleccione Deconvolución 3D.

5. Análisis de imágenes

  1. Volumen de papilas gustativas e inervación
    1. Importe pilas de imágenes desenredadas a un software de análisis de imágenes basado en píxeles (consulte la Tabla de materiales)para determinar el volumen de las papilas gustativas y el volumen de inervación total dentro de la papila gustativa.
      1. Desmarque Volumen en el menú principal Objeto.
      2. Seleccione Agregar nuevas superficies en el menú Objeto. Seleccione Omitir creación automática, editar manualmentey, a continuación, seleccione Contorno.
      3. Haga clic en Seleccionar y observe la flecha que aparece como un + para ayudar a trazar el borde de la papila gustativa. Mueva la cortadora y delinee la papila gustativa en cada sección óptica. Una vez que se completen los contornos, haga clic en Crear superficie.
      4. Observe el objeto de volumen de papilas gustativas que aparece ahora en el menú principal de objetos. Localice el volumen de la papila gustativa en Herramientas.
    2. Volumen de inervación dentro de la papila gustativa
      1. Seleccione el icono del lápiz debajo del objeto de la papila gustativa y, a continuación, seleccione Enmascarar todo.
      2. En el menú desplegable, seleccione el canal fluorescente que corresponde con la etiqueta de la fibra nerviosa. Marque Crear canal duplicado.
      3. Marque Establecer vóxeles fuera de la superficie en:, y escriba 0 en el cuadro.
      4. Observe el nuevo canal que aparece en la ventana Ajuste de pantalla, que es un duplicado inalterado del canal fluorescente seleccionado dentro de la papila gustativa.
      5. En el menú principal Objeto, seleccione Crear nueva superficie. Desmarque Omitir creación automática, edite manualmente.
      6. Haga clic dos veces en la flecha azul para continuar con el siguiente paso.
      7. Haga clic en Eliminar, luego haga clic en la flecha doble verde para completar la superficie, que representa el volumen de las fibras nerviosas presentes dentro de la papila gustativa. Para encontrar el valor del volumen, seleccione Herramientas en el menú Objeto de fibra nerviosa y seleccione Volumen en el menú desplegable.
    3. Volumen de inervación a la papila
      1. Cree un volumen de la papila gustativa como se describe en la sección 5.1.
      2. Seleccione el icono del lápiz debajo del objeto de la papila gustativa y, a continuación, seleccione Enmascarar todo.
      3. En el menú desplegable, seleccione el canal fluorescente que corresponde con la etiqueta de la fibra nerviosa. Marque Crear canal duplicado.
      4. Marque Establecer vóxeles dentro de la superficie en: y escriba 0 en el cuadro. Haga clic en Aceptar.
      5. Genere una superficie haciendo clic en Agregar nueva superficie. Seleccione Segmentar sólo una región de interés.
      6. Haga clic en la flecha azuly aumente el valor Z para que la región de interés comience en la base de la papila gustativa.
      7. Haga clic dos veces en la flecha azul para continuar con el siguiente paso.
      8. Haga clic en Eliminar, luego haga clic en la flecha doble verde para completar la superficie, que representa el volumen de la inervación a la papila. Para encontrar el valor del volumen, seleccione Herramientas en el menú Objeto de fibra nerviosa y seleccione Volumen en el menú desplegable.
    4. Análisis de contacto del cenador terminal
      1. Preparación de imágenes
        1. Vaya al menú Editar y seleccione Recortar 3D. Recorte la imagen por todos lados, eliminando el espacio fuera de la papila gustativa.
          NOTA: Recorte lo más cerca de la papila gustativa sin eliminar ninguna estructura relevante: cualquier exceso de imagen alargará el tiempo de procesamiento.
        2. Seleccione Editar en el menú principal, haga clic en Cambiar tipo de datos. Seleccione Para: flotador de 32 bits en el menú desplegable.
        3. Seleccione Agregar nuevas superficies en el menú Objeto. Haga clic en Omitir creación automática, editar manualmente,seleccione Contornoy, a continuación, arrastre la posición del sector hacia la derecha para encontrar el número total de sectores ópticos.
        4. Genere vóxeles isométricos y asegúrese de que en lugar de que los vóxeles sean rectángulos (0.0691 x 0.0691 x 0.474) como XxYxZ, respectivamente, los vóxeles sean 0.0691 x 0.0691 x 0.0691 dividiendo los rectángulos en cubos con valores idénticos para la intensidad de fluorescencia que el vóxel rectangular original. Seleccione Propiedades de imagen. Luego, divida el valor Z para voxel Size por el valor X o Y (= 0.474/0.0691) y multiplique ese valor por el número de cortes (secciones ópticas) encontrados en el paso anterior.
        5. Vuelva a Editar en el menú principal y seleccione Volver a muestrear 3D.
        6. Reemplace el valor Z (número de sectores) por el valor recién calculado.
      2. Creación de superficies automáticas basadas en fluorescencia
        1. Haga clic en Agregar nueva superficie de nuevo para agregar una nueva superficie, anule la selección de Segmentar solo una región de interésy haga clic en Siguiente.
        2. En el menú desplegable Canal de origen, seleccione el canal para uno de los tipos de celdas de transducción de sabor. Anule la selección de Suavizar y continúe con el siguiente paso.
        3. No altere nada en la siguiente pantalla que muestre el rango de intensidades fluorescentes presentes en la imagen. Haga clic en la flecha azul en la parte inferior de nuevo para pasar al siguiente paso.
        4. Haga clic en Eliminary, a continuación, haga clic en la flecha doble verde para completar la superficie.
        5. Vaya al menú Objeto en la mano izquierda de la pantalla donde aparecerá la superficie de celda completada y se llamará algo genérico como Surface 2. Haga doble clic en el nombre de la superficie para nombrarlo de acuerdo con lo que representa la etiqueta.
          NOTA: En este caso, la superficie generada se basa en la celda marcada con PLCß2.
        6. Si hay puntos en lugar de una superficie, en el menú de la esquina inferior izquierda, haga clic en Superficie en lugar de Punto central. A continuación, haga clic en Aceptar cuando se le solicite.
        7. Repita los pasos 5.3.2.1-5.3.2.5 para los otros marcadores celulares transductores del gusto y el marcador de fibra nerviosa.
        8. Guarde (exporte) el progreso.
        9. Haga clic en un tipo de celda Surface en el menú principal. En el menú de ese objeto, haga clic en Herramientasy, a continuación, haga clic en Transformación de distancia.
        10. Espere a que aparezca un cuadro emergente titulado XTDistanceTransformation. Seleccione Objeto de superficie exterior. Anote el nuevo canal que aparece en el menú Ajuste de pantalla denominado Distancia al nombre de la superficie.
        11. Seleccione la superficie Fibra nerviosa en el menú Objeto. Haga clic en el icono del lápiz y luego en Enmascarar todo.
        12. En el menú desplegable que aparece, seleccione el nuevo canal Distancia hasta el nombre de la superficie. Anote el nuevo canal que aparece en la ventana Ajuste de pantalla denominada Distancia enmascarada al nombre de la superficie.
        13. Cree un nuevo objeto mediante el menú principal Objeto. Anule la selección de Segmentar solo una región de interés y haga clic en la flecha azul. Seleccione la distancia enmascarada al canal PLCß2 y desmarque Suavizar.
        14. En la siguiente pantalla, verifique si hay alguna región donde las células transductoras de sabor estén a la distancia más pequeña de las fibras nerviosas discernibles por este software. Para hacer esto, establezca un límite de 0.01-0.11 μm para verificar si hay fluorescencia de células receptoras tan cerca de las fibras nerviosas.
        15. Escriba 0.01 en el cuadro verde del lado izquierdo para establecer el umbral inferior, presione Tab. Luego haga clic en el botón rojo y escriba 0.11 para establecer el umbral superior. Presione Tab y luego haga clic en la flecha azul en la parte inferior para pasar al siguiente paso.
        16. Haga clic en Eliminar y luego en la flecha doble verde para finalizar.
        17. Cambie el nombre de esta superficie dentro de 0.01-0.11 de PLCß2 en el menú Objeto. Seleccione Dentro de 0.01 - 0.11 de la superficie PLCß2 en el menú Objeto.
        18. Seleccione el lápiz y luego haga clic en Enmascarar todo. Seleccione el canal rojo (fibra nerviosa) en el menú desplegable y haga clic en Aceptar. Tome nota del nuevo canal que aparece en la ventana Ajuste de pantalla denominada CHS2 enmascarado.
        19. Haga clic en el nombre del canal; cambie el nombre del canal dentro de 0.01 - 0.11 de PLCß2.
          NOTA: Este es un canal fluorescente que representa un duplicado del canal fluorescente rojo presente dentro de la superficie creada.
        20. Haga clic en blanco en el centro del selector de color. Seleccione un color que contraste con los colores de las estructuras.
        21. Exporte (es decir, guarde) el archivo en esta etapa.
        22. Repita los pasos 5.4.2.9-5.4.2.21 para otros marcadores celulares transductores del sabor.
        23. Exporte (es decir, guarde) el archivo en esta etapa.
          NOTA: Para analizar la proximidad de un tipo de célula etiquetada a otro, simplemente reemplace la superficie de la fibra nerviosa en el paso 5.4.2.11 (y los siguientes pasos) con el objeto de interés y los componentes equivalentes que pertenecen a cada paso posterior.

6. Reconstrucción del cenador neuronal y cuantificación del número celular absoluto

  1. Rastreo y análisis del cenador terminal
    1. Abra el archivo de imagen desenrevesado en un software de análisis de imágenes basado en vectores 3D (consulte la Tabla de materiales),seleccione Rastrear,haga clic en Neuronay luego haga clic en Dendrita.
    2. Desplácese hasta la base de la papila gustativa en la pila de imágenes. Traza cada fibra hasta el final mientras te desplazas por la pila de imágenes.
    3. Cuando esté en el extremo de la rama, haga clic con el botón derecho en el extremo y seleccione Finalizar. En los puntos de bifurcación, haga clic con el botón derecho y seleccione Nodo bifurcado.
      NOTA: Esto permite rastrear una rama hasta el final y luego regresar al punto de bifurcación y rastrear la otra rama con el programa reconociendo que este rastreo sigue siendo de la misma neurona.
    4. Guarde el archivo de datos como un archivo . DAT, que luego se puede abrir para su análisis en el software de análisis de imágenes basado en vectores 3D.

7. Cuantificación del número de células

  1. Cuantificar las células de papilas gustativas etiquetadas en cualquier paquete de software de análisis de imágenes, siempre que se puedan colocar marcadores distintos para transducir tipos de células ancladas a la posición z a nivel nuclear.

Resultados

Tinción del epitelio lingual con anticuerpos contra dsRed y queratina-8 (un marcador general de papilas gustativas) etiquetadas tanto como todas las papilas gustativas enteras y toda la inervación de las papilas gustativas en ratones Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figura 3A). Las imágenes de estas papilas gustativas desde sus poros hasta sus bases dieron las imágenes planas x-y de mayor resolución(Figura 3A,

Discusión

El desarrollo de un enfoque para recolectar y teñir consistentemente papilas gustativas enteras de tres regiones gustativas de la cavidad oral (fungiformes, circunvaladas y el paladar) proporciona mejoras significativas para analizar las células transductoras del gusto, rastrear las células recién incorporadas, la inervación y las relaciones entre estas estructuras. Además, facilita la localización de un potencial marcador neuronal secundario tanto dentro como fuera de una población marcada50.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Kavisca Kuruparanantha por sus contribuciones a la tinción de tejidos y la obtención de imágenes de papilas gustativas circunvaladas, Jennifer Xu por la tinción y la imagen de la inervación en la papila, Kaytee Horn por el cuidado de los animales y el genotipado, y Liqun Ma por su tinción de tejidos de las papilas gustativas del paladar blando. Este proyecto fue apoyado por R21 DC014857 y R01 DC007176 a R.F.K y F31 DC017660 a L.O.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

Referencias

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