Échafaudage composite collagène-chitosane chargé en doxycycline pour la guérison accélérée des plaies diabétiques

Résumé

L’échafaudage DOX-CL préparé satisfaisait aux conditions préalables d’un pansement DW idéal en matière de résistance mécanique, de porosité, d’absorption d’eau, de taux de dégradation, de libération prolongée, d’antibactérien, de biocompatibilité et de propriétés anti-inflammatoires, qui sont considérées comme essentielles pour la récupération des tissus endommagés chez les DW.

Résumé

Une complication importante du diabète sucré est les plaies diabétiques (DW). La phase prolongée de l’inflammation dans le diabète obstrue les étapes ultérieures d’une blessure menant à la cicatrisation retardée de blessure. Nous avons choisi le doxycycline (DOX), comme drogue potentielle de choix, due à ses propriétés antibactériennes avec ses propriétés anti-inflammatoires rapportées. L’étude actuelle vise à formuler des échafaudages non réticulés (NCL) et réticulés (CL) chargés de collagène-chitosane et à évaluer leur capacité de guérison dans des conditions diabétiques. Le résultat de la caractérisation des échafaudages révèle que l’échafaudage DOX-CL présente une porosité idéale, un faible taux de gonflement et de dégradation et une libération prolongée de DOX par rapport à l’échafaudage DOX-NCL. Les études in vitro indiquent que l’échafaudage DOX-CL était biocompatible et a amélioré la croissance cellulaire comparée à l’échafaudage cl traité et aux groupes témoins. Les études antibactériennes ont montré que l’échafaudage DOX-CL était plus efficace que l’échafaudage CL contre les bactéries les plus courantes trouvées dans DW. Utilisant le streptozotocin et le modèle à haute teneur en matières grasses DW d’alimentation-induit, on a observé un taux sensiblement plus rapide (p≤0,05) de contraction de blessure dans le groupe traité par échafaudage dox-CL comparé à ceux dans l’échafaudage de CL traité et les groupes témoins. L’utilisation de l’échafaudage DOX-CL peut s’avérer être une approche prometteuse pour le traitement local des DWs.

Introduction

Le diabète sucré (DM) est une condition où l’incapacité du corps à délivrer de l’insuline ou à réagir à ses résultats dans la digestion anormale des sucres simples entraîne une recrudescence de la glycémie ¹. L’enchevêtrement le plus consécutif et le plus écrasant de DM est la blessure diabétique (DW). Environ 25% des patients atteints de DM ont la possibilité de construire un DW dans leur vie ¹. La guérison entravée de DW est accréditée à un triopathy de DM : immunopathy, vasculopathy, et neuropathie. Chaque fois que le DW n’est pas traité, il peut en résulter un développement de gangrène, ce qui entraîne le retrait de l’organe concerné ^2.

De nombreux traitements, tels que l’instruction des patients (inspecter la plaie quotidiennement, nettoyer la plaie, éviter les activités qui créent une pression sur la plaie, la surveillance périodique de la glycémie, etc.), le contrôle de leur glycémie, le débridement de la plaie, le déchargement de pression, la procédure médicale, l’oxygénothérapie hyperbare et les thérapies innovantes sont en pratique ^3,4. La majorité de ces médicaments ne répondent pas à tous les prérequis vitaux pour les soins DW à la lumière des conditions physiopathologiques multifactorielles et des dépenses imprévues liées à ces médicaments ⁵. Quoique la pathogénie de DW soit multifactorielle, l’inflammation persistante avec la gestion inadéquate de tissu est indiquée pour être la raison réelle de la guérison retardée dans DWs ^5,6.

Les niveaux augmentés des médiateurs inflammatoires et pro-inflammatoires dans DW ont comme conséquence les facteurs de croissance diminués responsables de la cicatrisation retardée de blessure ^2,6. La formation incorrecte de matrice extracellulaire (ECM) dans les DW est accréditée aux niveaux accrus des protéinases métalliques de matrice (MDP) responsables de la dégradation rapide de l’ECM formé. Dans les MMP, MMP-9 est rapporté comme un intermédiaire important responsable de l’inflammation prolongée et de la dégradation rapide de l’ECM ^7. Il est indiqué que le traitement local avec un médicament anti-inflammatoire qui diminue les niveaux élevés de MMP-9 rétablit l’homéostasie cutanée, l’arrangement du cadre et incite à une meilleure guérison des DWs ^8,9.

La doxycycline (DOX), un inhibiteur de MMP-9, a été choisie pour supprimer les niveaux élevés de MMP-9, un médiateur inflammatoire majeur responsable de l’inflammation persistante chez les DWs ^10,11,12. En outre, DOX possèdent antioxydant (produire des radicaux hydroxy et phénoxy libres capables de se lier avec des espèces réactives de l’oxygène) ¹³ et anti-apoptotique (inhiber l’expression de la caspase et la stabilisation mitochondriale) ¹⁴ activités qui sont essentielles pour le traitement de DW. L’arrangement des cadres contenant DOX, collagène (COL), et chitosan (CS) a été choisi. Le choix de COL dépend de la façon dont il aide à fournir le cadre nécessaire responsable de la résistance mécanique et de la régénération des tissus ¹⁵. D’autre part, le CS est structurellement homologue au glycosaminoglycan, associé à plusieurs phases curatives de blessure. Il est également rapporté que CS détient une propriété antibactérienne significative ¹⁵. Par conséquent, l’échafaudage COL/CS de DOX est formulé pour supprimer l’inflammation prolongée, suivi en soutenant la formation de matrice pour la blessure réussie guérissant dans des conditions de DM.

Protocole

Toutes les procédures animales effectuées ont été approuvées par le comité institutionnel d’éthique animale du JSS College of Pharmacy, Ooty, Inde.

1. Préparation d’échafaudages poreux chargés de DOX par procédé de lyophilisation

1. Ajouter 1,2 g de COL à 100 mL d’eau (p. ex. Millipore) et tenir de côté pour l’enflure.
2. Remuez la dispersion gonflée du COL à 2000 tr/min pendant la nuit pour assurer la dissolution complète du COL.
3. Préparer la solution de CS en dissolvant environ 0,8 g de CS dans 100 mL d’acide acétique à 1 %.
4. Remuer la solution CS pendant une nuit à 2000 tr/min pour assurer une dispersion uniforme.
5. Mélanger DOX (1 % p/v), suivi de la solution CS, à la solution COL, et agiter pendant 30 min.
6. Filtrer le mélange physique obtenu à l’aide d’un chiffon de mousseline pour éliminer les particules.
7. Congeler en profondeur le filtrat obtenu à -85 °C ± 4 °C pendant environ 24 h.
8. Lyophiliser le mélange de congélation profonde à -85 °C ± 4 °C pendant 72 h.
9. Stocker les échafaudages obtenus dans un dessicateur pour une analyse plus approfondie ^16,17.

2. Réticulation de l’échafaudage

1. Dissoudre le MES (0,488 g) dans 50 mL d’eau.
2. Faire tremper 50 mg de l’échafaudage chargé par DOX dans 20 mL du tampon MES pendant 30 min.
3. Mélanger 19,5 mL de tampon MES avec 0,1264 g d’EDC et 0,014 g de NHS dans un bécher séparé.
4. Immerger l’échafaudage dans le mélange tampon pendant 4 h pour obtenir une réticulation ^16.
5. Stockez les échafaudages (CL) et non réticulés (NCL) chargés par DOX pour une évaluation plus approfondie.

3. Caractérisation des échafaudages

1. Examen morphologique à l’aide d’une microscopie électronique à balayage (MEB)
   1. Caractériser les échafaudages pour l’analyse morphologique à l’aide de MEB (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
   2. Tachez la section transversale et la surface extérieure de l’échafaudage avec la couche délicate d’or (~ 150 Å).
   3. Capturez l’image photographique à la tension d’excitation de 5 kV et 10 kV.
   4. Placez les échantillons dans des talons d’aluminium et enfermez-les avec l’or à environ 9 V.
   5. Mesurer l’échafaudage à l’aide de MEB avec une résolution accrue à 10 kV.
2. Détermination de la porosité
   1. Mesurer la porosité des échafaudages à l’aide de la méthode de déplacement liquide (éthanol) ^18.
   2. Calculer la porosité des échafaudages à l’aide des formules ci-dessous.
      
      W_w = Poids humide de l’échafaudage
      W_d = Poids à sec de l’échafaudage
      W_v = Volume de l’échafaudage
3. Détermination de la capacité d’absorption d’eau
   1. Mesurer le poids à sec de l’échafaudage.
   2. Incuber l’échafaudage pesé à 37 °C pendant 24 h dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pH 7,4.
   3. Retirez l’excès de PBS sur l’échafaudage à l’aide de papier filtre.
   4. Mesurer la capacité d’absorption d’eau à l’aide des formules ^{ci-dessous 17}.
      
      W_S = Pourcentage d’absorption d’eau
      W₁=Poids humide de l’échafaudage
      W₀= Poids à sec de l’échafaudage
4. Dégradation de l’échafaudage
   1. Incuber l’échafaudage (1cm x 1cm) à 37 °C pendant 7 jours dans un PBS de pH 7,4 contenant des lysozymes.
   2. Lavez l’échafaudage pour éliminer les ions collés sur la surface.
   3. Lyophilisé l’échafaudage lavé ¹⁷.
   4. Calculer le taux de dégradation à l’aide de formules.
      
      Ww = Poids initial de l’échafaudage
      Wd = Poids de l’échafaudage après lyophilisation
5. Études de libération in vitro
   1. Déterminez le comportement de libération du DOX à partir de l’échafaudage à l’aide de la méthode du sac de dialyse.
   2. Disperser l’échafaudage dans quelques millilitres de liquide de plaie simulé (pH 7,4) et le transférer dans un sac de dialyse.
   3. Fermez hermétiquement les extrémités du sac à membrane et plongez dans les 500 mL de solution de liquide de plaie simulée.
   4. Remuer la solution liquide de la plaie contenant le sac de dialyse à 200-250 tr / min.
   5. Recueillir la solution surnageante et la remplacer par une quantité égale de solution tampon fraîche à intervalles de temps définis.
   6. Déterminer le pourcentage de rejet de DOX par les échafaudages dans la solution surnageante à l’aide d’un spectromètre UV-visible à 240 nm.

4. Études antibactériennes in vitro

1. Déterminer la concentration inhibitrice minimale (CMI) des échafaudages CL et DOX-CL contre S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa en utilisant la méthode de dilution du micro-bouillon.
2. Préparer les cultures bactériennes à l’aide du bouillon Mueller-Hinton dans un rapport de 1:1000 pour obtenir une turbidité de 0,5 McFarland.
3. Ajouter le D-glucose (800 mg/dl) aux cultures bactériennes pour l’hyperglycation ^19,20.
4. Hacher et solubiliser le CL et le DOX-CL dans le DMSO (contrôle négatif).
5. Diluer en série la suspension bactérienne hyperglycée (100 μL) et les échantillons d’essai (100 μL de solution d’échafaudages) dans 96 plaques de puits.
6. Incuber la plaque à 37 °C pendant 20-24 h.
7. Enregistrer l’absorbance à une longueur d’onde de 600 nm ^21.

5. Études de biocompatibilité in vitro

1. Évaluer la biocompatibilité des échafaudages préparés à l’aide du test MTT [(3-(4,5 diméthyl thiazole-2 yl)-2,5-diphényl tétrazolium)]
2. Stérilisez les échafaudages de dimension standard et placez-les dans 24 plaques de puits.
3. Ajouter les cellules 3T3-L1 à la plaque de 24 puits et incubées pendant 72 h.

6. Études in vivo sur des animaux

1. Induction de DM et plaie d’excision
   1. Nourrissez l’animal avec un régime riche en graisses pendant deux semaines et administrez une dose unique de streptozotocine (STZ) (50 mg/kg de poids corporel) dans une solution tampon citrate par voie intrapéritonéale aux rats albinos Wistar (180-200 g) pour l’induction du diabète de type 2.
   2. Choisissez les animaux avec une glycémie constante de 250 mg/dl pour l’étude.
   3. Randomiser les animaux sélectionnés pour l’induction des plaies d’excision.
   4. Anesthésiez les rats diabétiques utilisant l’éther diéthylique (5 ml ont été ajoutés à la chambre d’anesthésie avant saturée) et confirmez utilisant la méthode de pincement d’asteil et la couleur de membrane muqueuse.
   5. Raser la région dorsale (région thoracique dorsale, lombaire) à l’aide d’une tondeuse aseptique et de lames (A40).
   6. Stérilisez la zone rasée avec un écouvillon alcoolique.
   7. Exciser la peau (2 x 2 cm² et une profondeur de 1 mm) avec une lame A40 chirurgicale aseptique sur la zone rasée pour créer une plaie ouverte.
   8. Divisez les animaux en trois groupes (groupe 1 - Contrôle de la maladie (contrôle), groupe 2 - Échafaudage CL (placebo), groupe 3 - Échafaudage DOX CL), chaque groupe composé de 6 rats.
   9. Apposez les échafaudages CL et DOX CL à l’aide de ruban chirurgical et couvrez le groupe témoin avec de la gaze stérile pendant 21 jours.
   10. Tracez la zone de la plaie sur une feuille stérile d’OHP et mesurez le pourcentage de réduction de la plaie à l’aide de la méthode de la grille les jours 0, 7, 14 et 21 pour tous les groupes.
   11. Calculer le pourcentage de réduction des plaies à l’aide des formules ci-dessous.
       

7. Études histopathologiques

1. Isoler la zone de la plaie cicatrisé les jours 7, 14 et 21, conserver dans une solution de forin (10%).
2. Sectionr les tissus à l’aide d’un microtome pour obtenir une épaisseur de 6 μm.
3. Montez les sections sur une lame de verre et colorez à l’aide d’hématoxyline et d’éosine ¹⁷.
4. Capturez les images sous un grossissement 40x à l’aide d’un microscope numérique.

8. Estimation de l’hydroxyproline

1. Isolez le secteur guéri de blessure aux jours 0, 7, 14, et 21 pour l’évaluation.
2. Estimer la teneur en hydroxyproline à l’aide de la procédure décrite par Reddy G et al., 1996 ²².

9. Test Elisa

1. Estimer les niveaux de MMP-9 à l’aide du kit Elisa conformément aux instructions du fabricant.
2. Isoler les échantillons de tissu de la zone de plaie guérie le jour 21 et hacher à l’aide d’un homogénéisateur de tissu.
3. Centrifuger l’homogénéat obtenu et recueillir le surnageant.
4. Diluer le surnageant à 100 fois à l’aide d’un tampon d’analyse.
5. Numérisez la plaque à l’aide d’un lecteur à plaques multiples.

10. Analyse statistique

1. Représenter les résultats obtenus en tant que DD moyen ±.
2. Effectuez l’analyse statistique à l’aide de Graph pad prism v5.01.
3. Atteindre la signification statistique à l’aide de l’analyse de variance à sens unique (ANOVA) et du test post hoc de Dunnet.
4. Considérez les valeurs avec p≤0,05 comme significatives.

Résultats

Caractérisation de l’échafaudage NCL et CL chargé par DOX
À l’examen visuel, l’échafaudage de NCL et de CL s’est avéré crème dans la couleur. En outre, les deux échafaudages semblent être comme une éponge, raides et inélastiques lorsqu’ils sont examinés physiquement. Les images MEB des échafaudages NCL et CL sont illustrées à la figure 1. D’après la figure, il était clair qu’il y avait une diminution de la taille des pores après réticulat...

Discussion

L’objectif principal de cette étude était de déterminer l’effet de l’échafaudage COL-CS chargé par DOX sur la guérison DW chez les rats. Cl et NCL ont été préparés et évalués en termes de morphologie, d’index de gonflement, de cinétique in vitro de libération, et de biocompatibilité.

Caractérisation de l’échafaudage NCL et CL chargé par DOX
Les échafaudages préparés se sont avérés poreux avec des pores interconnectés. Ces pores interconnect...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu